用于檢測(cè)犬流感病毒的rt-lamp引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測(cè)犬流感病毒的RT?LAMP引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用。所述LAMP引物組合物由SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向內(nèi)引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向內(nèi)引物BIP和SEQ ID NO.5所示的環(huán)引物L(fēng)B組成。本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在檢測(cè)犬流感病毒中的應(yīng)用。本發(fā)明篩選到用于檢測(cè)犬流感病毒的LAMP引物組合物，建立了LAMP檢測(cè)犬流感病毒的方法，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快熟簡(jiǎn)便、無需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
用于檢測(cè)犬流感病毒的RT-LAMP引物組合物、試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)犬流感病毒的引物以及試劑盒，尤其涉及用于檢測(cè)犬流感病 毒H3N2亞型的RT-LAMP引物組、以及檢測(cè)犬流感病毒H3N2亞型RT-LAMP試劑盒。本發(fā)明屬于 生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒（Influenza virus)屬于正粘病毒科流感病毒屬，基因組是由8條負(fù)鏈 RNA節(jié)段組成，編碼11或12個(gè)蛋白，病毒對(duì)包括禽類和哺乳動(dòng)物等多種動(dòng)物具有致病性，已 成為對(duì)人畜健康具有威脅力的重要傳染病原。犬流行性感冒（Canine influenza，CI)是由 犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)引起的一種犬屬動(dòng)物接觸性呼吸道傳染病，患 犬臨床癥狀表現(xiàn)為體溫升高、流鼻液、咳嗽、食欲減退、呼吸困難等，該病流行傳播迅速，在 規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)常導(dǎo)致群體性流行并伴隨死亡。研究證實(shí)，多種來源的流感病毒均可以自然 感染犬類，包括馬源H3N8亞型、禽源H3N2亞型、禽源H5N1亞型、禽源H5N2亞型、禽H9N2亞型、 禽源H3N2重組的H3N1亞型病毒株、季節(jié)性H3N2亞型人流感和2009年甲型人流感等。雖然只 有馬源H3N8亞型和禽源H3N2亞型能夠在犬中水平傳播并形成較穩(wěn)定遺傳譜系，但是鑒于A 型流感病毒具備較強(qiáng)的重組變異和跨種傳播能力，犬類流感病毒的潛在的公共衛(wèi)生問題一 直受到高度重視。另外，在我國工作犬領(lǐng)域中，H3N2亞型的犬流感病毒經(jīng)常發(fā)生于各大繁殖 基地以及安全保衛(wèi)活動(dòng)現(xiàn)場(chǎng)，以呼吸道綜合征為主要特征，并伴隨其他病原感染，對(duì)工作犬 的嗅探作業(yè)形成巨大障礙，在社會(huì)公共安全領(lǐng)域該病也受到高度重視。
[0003] 犬流感病毒常規(guī)的診斷方法有:病毒分離、血凝/血凝抑制試驗(yàn)(HA/HI)、酶聯(lián)免疫 吸附試驗(yàn)(ELISA)等，隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR以及熒光定量PCR等方法也應(yīng)用到 CIV的檢測(cè)工作當(dāng)中。然而，上述幾種方法或檢測(cè)周期長、靈敏度不高、特異性不強(qiáng)，或需要 特殊的儀器設(shè)備，不適合基層養(yǎng)殖場(chǎng)和發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。如今，隨著寵物犬、軍警犬對(duì) 該病快速診斷的需求的增加，迫切需要開發(fā)適合基層養(yǎng)殖場(chǎng)、發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)乃至邊境口岸的簡(jiǎn) 便、快速的檢測(cè)方法及試劑盒。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種 新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種引物，僅使用一種鏈置 換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下作用40-60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。 由于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，因此可通過監(jiān)測(cè)濁度來監(jiān)控反應(yīng)進(jìn)程，同 時(shí)也可在進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)事先加入熒光目視檢測(cè)試劑，即可在反應(yīng)結(jié)束時(shí)在自然光或 者紫外線照射裝置下通過目視進(jìn)行結(jié)果判定，快速簡(jiǎn)便地鑒定靶基因的有無。因此，與其他 的檢測(cè)技術(shù)相比，具有方便快捷、特異、敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備、結(jié)果判斷直觀的 特點(diǎn)。與常規(guī)RT-PCR相比，RT-LAMP技術(shù)反應(yīng)速度更快，在靈敏度、特異性和結(jié)果判定等方面 效果更優(yōu);與熒光定量RT-PCR相比，由于不依賴復(fù)雜的儀器設(shè)備，檢測(cè)成本更低。
[0005] 本發(fā)明以我國犬流感H3N2亞型南京分離株為基礎(chǔ)，以M基因?yàn)槟繕?biāo)基因，設(shè)計(jì)RT-LAMP引物組，以此為技術(shù)核心，提供一種可專用于犬流感病毒H3N2亞型的RT-LAMP試劑盒和 應(yīng)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測(cè)犬流感病毒的LAMP引物 組合物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種無需復(fù)雜設(shè)備、操作簡(jiǎn)便、敏感性高、易于判定結(jié) 果的檢測(cè)犬流感病毒H3N2亞型的RT-LAMP試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的又一目的在于提供上述LAMP引物組合物及試劑盒在檢測(cè)犬流感病毒中 的應(yīng)用。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0010] 用于檢測(cè)犬流感病毒的LAMP引物組合物，其在于：所述LAMP引物組合物包括SEQ 10勵(lì).1所示的正向外引物?3、3￡〇10勵(lì).2所示的反向外引物83、3￡〇10勵(lì).3所示的正向 內(nèi)引物？1?、3￡〇10從).4所示的反向內(nèi)引物81?和3￡〇10從).5所示的環(huán)引物1^。
[0011] 上述的LAMP引物組合物在檢測(cè)犬流感病毒中的應(yīng)用。
[0012] 上述的LAMP引物組合物在制備檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
[0013] -種檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒，其在于包含上述的LAMP引物組合物。
[0014] 上述的試劑盒，優(yōu)選的包含反應(yīng)緩沖混合液、反應(yīng)引物混合液、反應(yīng)酶類混合液；
[0015] 所述的反應(yīng)緩沖混合液的組成為：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4， 50mmol/L KCl，16mmol/L MgS〇4,0?2%(v/v)Tween 20，1?6mol/L Betaine，2?8mmol/L dNTPs mixture；
[0016] 所述的反應(yīng)引物混合液為上述的LAMP引物組合物中各引物組成的混合液，其中各 引物的濃度為：lwn〇l/L的正向外引物F3，lwnol/L的反向外引物B3,8wnol/L的正向內(nèi)引物 FIP，8wnol/L的反向內(nèi)引物BIP，4wnol/L的環(huán)引物L(fēng)B;
[0017] 所述的反應(yīng)酶類混合液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的混合溶液。優(yōu)選為:4U/ yL Bst DNA polymerise;5U/iiL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0018] 上述的試劑盒，進(jìn)一步優(yōu)選的還包含熒光目視檢測(cè)試劑。
[0019] -種檢測(cè)犬流感病毒的方法，其在于提取待檢樣本RNA，以該RNA為模板，利用上述 的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)呈綠色。
[0020] 所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系包含所述的反應(yīng)緩沖混合液12.5yL，所述的反應(yīng)引物混 合液5yL，所述的反應(yīng)酶類混合液2yL，模板溶液4yL，加去離子水適量至25yL。
[0021] 所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?60°C~65°C，40min。
[0022]本發(fā)明的用于檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒采用以下步驟制備：
[0023] (1)從GenBank檢索所有公開發(fā)布H3N2犬流感病毒的M、H基因序列，通過DNAstar軟 件分析同源性。獲得H3N2犬流感病毒M、H基因的特異性的保守序列；
[0024] (2)根據(jù)步驟(1)所得的保守靶DNA序列，設(shè)計(jì)得到三組RT-LAMP擴(kuò)增引物。
[0025] (3)通過對(duì)步驟(2)中所述三組引物的擴(kuò)增效果的比較，選定SEQ ID NO: 1~5所示 作為本發(fā)明中提及引物組合。
[0026] (4)配制LAMP反應(yīng)液，結(jié)合所得的RT-LAMP引物，構(gòu)成檢測(cè)體系，進(jìn)而組裝成檢測(cè) H3N2犬流感病毒的RT-LAMP試劑盒。
[0027]本發(fā)明的用于檢測(cè)H3N2犬流感病毒的RT-LAMP試劑盒，具體包含以下組分：
[0028] (1) 2 X LAMP 反應(yīng)緩沖液：
[0029] 組分及濃度如下：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4,50mmol/L KC1， 16mmol/L MgS〇4,0?2%(v/v)Tween 20，1?6mol/L Betaine、2?8mmol/L dNTPs mixture。
[0030] (2)反應(yīng)引物混合液：
[0031] 混合液中各引物的濃度分別為，lwnol/L的引物F3，lwnol/L的引物B3，8wn〇l/L的 引物BIP，8wnol/L 的引物FIP，4wnol/L 的引物L(fēng)B。
[0032] (3)反應(yīng)酶混合液：
[0033] 4U/liL Bst DNA polymerise;5U/liL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0034] (4)熒光目視檢測(cè)染料：
[0035] Loopamp?熒光目測(cè)試劑或|丐黃綠素/氯化猛染料溶液（625umol/L Calcein， 12.5mmol/L MnCl2)〇
[0036] (5)陽性模板:H3N2犬流感病毒南京分離株RNA。
[0037] 上述用于檢測(cè)H3N2犬流感病毒的RT-LAMP試劑盒，檢測(cè)H3N2犬流感病毒時(shí)按照以 下步驟進(jìn)行：
[0038] (1)配制21yL LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)體系，組分及用量如下：
[0039] 2 X LAMP反應(yīng)緩沖液12.5yL;反應(yīng)引物混合液5yL;反應(yīng)酶類混合液2yL;熒光目視 檢測(cè)染料1此;去離子水0.5此。
[0040] (2)按常規(guī)方法提取待測(cè)樣品中的核酸，取4iiL核酸提取液加到上述已配制好的 LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)體系中，使反應(yīng)終體系為25yL;
[0041 ] (3)瞬時(shí)離心10s使反應(yīng)體系充分混合，置63 °C恒溫40min進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增；
[0042] (4)80°C下5min進(jìn)行酶滅活處理，終止反應(yīng)。
[0043] (5)結(jié)果判定可采取兩種方法：
[0044] (a)在自然光下觀察，反應(yīng)液如變成淡綠色說明待測(cè)樣品中存在H3N2犬流感病毒， 如為橘色說明待測(cè)樣品中不存在H3N2犬流感病毒。
[0045] (b)使用紫外照射裝置，從反應(yīng)管底部向上進(jìn)行紫外線照射，佩戴護(hù)眼用具從側(cè)面 進(jìn)行觀察，反應(yīng)液發(fā)出綠色熒光說明待測(cè)樣品中存在H3N2犬流感病毒，如未發(fā)出熒光說明 待測(cè)樣品中不存在H3N2犬流感病毒。
[0046] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有下列突出的優(yōu)點(diǎn)：
[0047] (1)高靈敏度:所需擴(kuò)增模板僅需要0.04pg核酸（圖1)。
[0048] (2)高特異性:對(duì)CDV及其他常見犬源性病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌及其他常見 犬源性細(xì)菌均無擴(kuò)增反應(yīng)，只對(duì)H3N2犬流感病毒進(jìn)行擴(kuò)增(圖2)。
[0049] (3)高穩(wěn)定性:反應(yīng)體系中預(yù)先加入熒光染料，擴(kuò)增完成后無需打開反應(yīng)管進(jìn)行其 他操作，避免了反應(yīng)產(chǎn)物形成的氣溶膠對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的污染，保證了多次擴(kuò)增時(shí)的穩(wěn)定性。
[0050] (4)操作簡(jiǎn)單：只需將反應(yīng)體系放入63°C恒溫水浴鍋40min，就可完成擴(kuò)增。
[0051] (5)易于判定結(jié)果:預(yù)先加入熒光染料，通過顏色變化即可進(jìn)行判定。
[0052] (6)成本低:整個(gè)檢測(cè)過程，無需昂貴儀器，降低了檢測(cè)成本。
[0053]本發(fā)明的試劑盒及其應(yīng)用方法可以在等溫條件下，快速、高效、特異、靈敏地檢測(cè) H3N2亞型的犬流感病毒，不需要復(fù)雜儀器，降低了檢測(cè)成本，能較好滿足基層養(yǎng)殖場(chǎng)、寵物 診所、出入境檢疫、軍警犬繁育部門等的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需要，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng) 濟(jì)、社會(huì)效益。
【附圖說明】
[0054] 圖1引物篩選結(jié)果柱狀圖
[0055] BlockA中1、2、4、7、8的下部呈紅色，上部呈藍(lán)色，3、5、6呈綠色；BlockB中，1呈綠 色，2的下部呈紅色，上部呈藍(lán)色。
[0056]圖2引物篩選結(jié)果BLOCK A曲線圖
[0057] 圖3 CIV LAMP不同溫度下擴(kuò)增60分鐘的擴(kuò)增量
[0058] 其中，60°C、63°C、65°C對(duì)應(yīng)的柱狀圖下部呈紅色，上部呈藍(lán)色，陰性對(duì)照的柱狀圖 呈綠色。
[0059] 圖4 CIV LAMP病毒特異性試驗(yàn)結(jié)果圖
[0060] 1對(duì)應(yīng)的柱狀圖下部呈紅色，上部呈藍(lán)色，2-7對(duì)應(yīng)的柱狀圖呈綠色。
[0061 ] 圖5 CIV LAMP細(xì)菌特異性試驗(yàn)
[0062] 其中，1-Bb31124，2-巴氏桿菌，3-大腸桿菌，4-葡萄球菌，5-CIV培養(yǎng)物，6-CIV臨床 樣本
[0063]圖6 CIV LAMP靈敏度試驗(yàn)濁度儀檢測(cè)結(jié)果
[0064] 其中，1-6對(duì)應(yīng)的柱狀圖下部呈紅色，上部呈藍(lán)色，7-8對(duì)應(yīng)的柱狀圖呈綠色。
[0065] 圖7 CIV靈敏度試驗(yàn)RT-PCR電泳結(jié)果圖
[0066] 圖8臨床初步應(yīng)用-自然光下的結(jié)果判定
[0067] 自然光下觀察，1-CIV陽性培養(yǎng)物(呈綠色），2_臨床陽性樣本a(呈綠色），3_臨床陰 性樣本b(呈橘色），4_臨床陰性樣本c(呈橘色），5_陰性對(duì)照(呈橘色）
[0068] 圖9臨床初步應(yīng)用-紫外光下的結(jié)果判定
[0069] 紫外光下觀察，1-陰性對(duì)照(呈橘色），2_臨床陰性樣本c(呈橘色），3_臨床陰性樣 本b(呈橘色），4_臨床陽性樣本a(呈綠色），5_CIV陽性培養(yǎng)物(呈綠色）
【具體實(shí)施方式】
[0070] 實(shí)施例1犬流感病毒RT-LAMP引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化
[0071] 1.提取核酸:按照常規(guī)方法提取待測(cè)樣品的核酸。
[0072] 2.引物設(shè)計(jì)與篩選：根據(jù)Gen Bank公布的CIV M基因及H基因基因序列，通過 http: //primerexplorer ? jp/e/PrimerExplorer4 ? 0設(shè)計(jì)3組引物，包括內(nèi)、外引物和環(huán)引 物。設(shè)計(jì)的三組引物將其編號(hào)為[1]、[2]、[3]，其中第[1]組引物為11基因引物，第[2]組和第
[3]組為M基因引物。利用3組引物對(duì)CIV RNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，用LAMP Real Time Turbidimeter實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C檢測(cè)3組引物擴(kuò)增效率，以篩選最優(yōu)的一組引物，所篩選 的三組引物的序列見表1。
[0073] 表1第[1]、[2]、[3]組引物序列
[0075] 3 ?引物稀釋：引物以ddH20稀釋，內(nèi)引物FIP/BIP使用濃度為40wn〇l/L，外引物F3/ B3使用濃度為5wiiol/L，環(huán)引物L(fēng)B使用濃度為20wiiol/L。在25yL體系中每種引物加入lyL，使 各引物在反應(yīng)體系中的終濃度如下：內(nèi)引物FIP和BIP的終濃度為1.6wiiol/L，外引物F3和B3 的終濃度為0.2mi 〇1/L，環(huán)引物L(fēng)B的終濃度為0.8mi〇1/L。
[0076] 4.RT-LAMP 反應(yīng)：
[0077] 反應(yīng)體系（21此預(yù)混液）：反應(yīng)緩沖混合液12.5此，反應(yīng)引物混合液(不添加環(huán)引物 時(shí)混合液為4yL，加環(huán)引物時(shí)引物混合液相應(yīng)調(diào)整為5此或者6此），反應(yīng)酶類混合液2yL (BstDNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的等體積混合溶液），另加去離子水適量至21此。
[0078] 所述反應(yīng)緩沖混合液組分及濃度如下：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4， 50mmol/L KCl，16mmol/L MgS〇4,0?2%(v/v)Tween 20，1?6mol/L Betaine、2?8mmol/L dNTPs mixture。
[0079] 所述反應(yīng)酶類混合液:4U/liL Bst DNA polymerise;5U/liL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0080] 向預(yù)混液中加入樣本溶液4yL，使總量達(dá)25yL。對(duì)照反應(yīng)中，陰性對(duì)照加入去離子 水4yL，陽性對(duì)照加入陽性對(duì)照RNA 4yL。
[0081 ] 反應(yīng)溫度63 °C 40min后在80 °C下5min終止反應(yīng)。
[0082] 5?犬流感病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定：利用LAMP Real Time Turbidimeter實(shí)時(shí)濁 度儀LA-320C實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)情況，當(dāng)線性圖線性峰值超過預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)(0.1)時(shí)，柱形底部 顯示為紅色，即反應(yīng)判定陽性，藍(lán)色柱狀數(shù)值越高表示產(chǎn)物的量越多。曲線圖表示反應(yīng)速 率。
[0083]表2引物組合及驗(yàn)證條件
[0085] 柱狀圖1顯示，除第[2]組不含環(huán)引物陽性組（引物組合編號(hào)5)未出現(xiàn)陽性反應(yīng)外， 其他各陽性組均出現(xiàn)了藍(lán)色柱狀擴(kuò)增條帶（圖1)。通過曲線圖2,記錄反應(yīng)起始和結(jié)束時(shí)間， 第[1]組含環(huán)引物陽性組（引物組合編號(hào)1)在第20min左右開始擴(kuò)增，第[3]組含環(huán)引物陽性 組（引物組合編號(hào)7)在第llmin開始擴(kuò)增。綜合擴(kuò)增效率和檢測(cè)時(shí)間的要求，優(yōu)選第[3]組含 環(huán)引物（引物組合編號(hào)7)組成檢測(cè)引物組合。其中各條引物序列如下：
[0087] 6.反應(yīng)溫度的優(yōu)選：于LAMP Real Time Turbidimeter實(shí)時(shí)濁度儀LA-320C中，設(shè) 置溫度分別為65°C、63°C和60°C，采用第[3]組引物組合進(jìn)行溫度梯度試驗(yàn)，觀察反應(yīng)溫度 對(duì)擴(kuò)增效率的影響。
[0088]結(jié)果顯示，在三個(gè)溫度梯度下均可進(jìn)行高效的擴(kuò)增，63°C的核酸擴(kuò)增量最高（圖 3 )，因此選擇63 °C作為最佳反應(yīng)溫度。
[0089] 7 .檢測(cè)時(shí)間的界定:根據(jù)多次檢測(cè)中的RT-LAMP擴(kuò)增曲線圖，在20min內(nèi)可以有效 完成整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)，以有效擴(kuò)增時(shí)間的2倍作為臨床檢測(cè)時(shí)間。因此將檢測(cè)時(shí)間界定為 40min〇
[0090] 8.優(yōu)化后的反應(yīng)體系及條件如下：
[0091] (1)以第[3]組含環(huán)引物組成檢測(cè)引物組合，包含5條引物。
[0092] (2)優(yōu)化后的反應(yīng)體系：反應(yīng)緩沖混合液12.5yL，反應(yīng)引物混合液5yL，反應(yīng)酶類混 合液2此，去離子水1.5此，新鮮提取的樣本RNA 4此，總體系25此。
[0093]當(dāng)需要進(jìn)行熒光目視檢測(cè)時(shí)，體系調(diào)整為:反應(yīng)緩沖混合液12.5此，反應(yīng)引物混合 液5yL，反應(yīng)酶類混合液2yL，去離子水0.5yL(DW)，熒光目視檢測(cè)染料1此，新鮮提取的樣本 RNA 4yL，總體系25yL。熒光目視檢測(cè)染料為鈣黃綠素/氯化錳染料溶液（625mio1/L Calcein，12.5mmol/L MnCl2)〇
[0094] (3)置63 °C 恒溫 40min進(jìn)行 RT-LAMP擴(kuò)增。
[0095] 實(shí)施例2犬流感病毒LAMP的特異性試驗(yàn)
[0096] 采用本研究設(shè)計(jì)篩選出的CIV LAMP引物，以背景明確的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV),犬副流感病毒（Canine Para-influenza Virus，CPIV)，犬腺狀病 毒（Canine adenovirus，CAV)，H9亞型禽流感病毒，犬細(xì)小病毒（Canine Parvovirus，CPV)、 支氣管鮑特桿菌ATCC 31124株、巴氏桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌為待測(cè)樣本，以CIV病毒 RNA為陽性對(duì)照，以雙蒸水為陰性對(duì)照，按照所建立的CIV LAMP檢測(cè)方法，檢驗(yàn)該方法的特 異性。
[0097] 本實(shí)施例中的LAMP反應(yīng)體系按照實(shí)施例1中優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行。
[0098] 結(jié)果所有測(cè)定樣本中，以CIV病毒RNA樣本呈陽性，其他樣品均呈陰性，陰性對(duì)照成 立(圖4、圖5)。表明試驗(yàn)所用引物特異性良好。
[0099] 實(shí)施例3犬流感病毒LAMP的靈敏度試驗(yàn)
[0100] 首先利用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit提取的CIV的總RNA， 再利用eppendorf RS-232C檢測(cè)RNA濃度，用雙蒸餾水進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取HT1到1(T7的 7個(gè)不同梯度為模板，并用蒸餾水作空白對(duì)照，按照所建立的CIV LAMP檢測(cè)方法，進(jìn)行靈敏 度試驗(yàn)。
[0101] 同時(shí)以相同的RNA樣本，以M基因通用引物進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，并對(duì)產(chǎn)物做瓊脂糖凝 膠電泳，將結(jié)果與LAMP試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。
[0102]檢測(cè)所提取的RNA濃度為4.3mg/L，用雙蒸水進(jìn)行10倍梯度稀釋，按照實(shí)施例1中優(yōu) 化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。用LAMP濁度儀實(shí)時(shí)檢測(cè)60min，得到結(jié)果如圖6，1至7分別 代表7個(gè)不同梯度，8為陰性對(duì)照。結(jié)果圖顯示7個(gè)梯度中1CT 1至1(T6梯度均能檢測(cè)到有效擴(kuò) 增，至1(T7梯度時(shí)不能進(jìn)行有效擴(kuò)增。以10倍梯度稀釋后的RNA為樣本，以M基因通用引物進(jìn) 行RT-PCR驗(yàn)證，并對(duì)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示最小檢測(cè)限為1(T 4(圖7)。
[0103] 與LAMP試驗(yàn)結(jié)果比較，LAMP的靈敏度比PCR靈敏度提高了100倍。
[0104] 實(shí)施例4臨床樣本的目視化鑒定
[0105] 收集臨床疑似犬流感感染犬的鼻拭子3份，以血凝/血凝抑制方法對(duì)3份樣本進(jìn)行 初步篩查，并按照常規(guī)方法提取病毒RNA，按照實(shí)施例1中建立的目視化LAMP檢測(cè)體系和條 件進(jìn)行3份臨床樣本的RT-LAMP檢測(cè)，設(shè)立陽性對(duì)照、陰性對(duì)照。在自然光、熒光照射裝置下， 進(jìn)行目視化的結(jié)果判定。比較血凝/血凝抑制方法和RT-LAMP的符合性。
[0106] 結(jié)果顯示:擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后在自然光或紫外線照射下觀察產(chǎn)物的顏色變化。陽性 反應(yīng)呈綠色，陰性反應(yīng)呈橘色（圖8、圖9)，3份樣本中樣本a為陽性，樣本b、c為陰性，檢測(cè)結(jié) 果與血凝/血凝抑制方法結(jié)果相符。證明實(shí)施例1中建立的目視化LAMP檢測(cè)體系和條件，能 夠準(zhǔn)確快速的檢測(cè)鼻拭子樣本中的流感病毒的有無。犬流感病毒H3N2RT-LAMP目視化檢測(cè) 試劑盒的效果良好。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)犬流感病毒的LAMP引物組合物，其特征在于:所述LAMP引物組合物包括SEQ IDN0.1所示的正向外引物F3、SEQIDN0.2所示的反向外引物B3、SEQIDN0.3所示的正向 內(nèi)引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向內(nèi)引物BIP和SEQ ID NO.5所示的環(huán)引物L(fēng)B。2. 權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測(cè)犬流感病毒中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在制備檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用。4. 一種檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒，其特征在于包含反應(yīng)緩沖混合液、 反應(yīng)引物混合液、反應(yīng)酶類混合液； 所述的反應(yīng)緩沖混合液的組成為：40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L(NH4)2S〇4,50mmol/L KCl，16mmol/L MgS〇4,0.2%Tween 20,1.6mol/L Betaine,2.8mmol/L dNTPs mixture； 所述的反應(yīng)引物混合液為權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物中各引物組成的混合液， 其中各引物的濃度為：lymol/L的正向外引物F3，lymol/L的反向外引物B3,8ymol/L的正向 內(nèi)引物FIP，8ymol/L的反向內(nèi)引物BIP，4ymol/L的環(huán)引物L(fēng)B; 所述的反應(yīng)酶類混合液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的混合溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)犬流感病毒的試劑盒，其特征在于還包含熒光目視檢測(cè) 試劑。7. -種檢測(cè)犬流感病毒的方法，其特征在于提取待檢樣本RNA，以該RNA為模板，利用權(quán) 利要求1所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后觀察結(jié)果，陽性反應(yīng)呈綠 色。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系包含權(quán)利要求5中 所述的反應(yīng)緩沖混合液12.5yL，權(quán)利要求5中所述的反應(yīng)引物混合液5yL，權(quán)利要求5中所述 的反應(yīng)酶類混合液2yL，模板溶液4yL，加去離子水適量至25yL。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?60°C~65°C，40min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK105821158SQ201610221926
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月11日
【發(fā)明人】秦海斌, 溫海, 朱騫, 強(qiáng)京寧, 張匯東, 宋珍華, 劉永杰, 賀星亮, 高龍, 高一龍
【申請(qǐng)人】公安部南京警犬研究所