新型微生物的制作方法
【專利摘要】提供黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)，其為弗拉特桿菌(Frateribacillus)屬的新種，具有如下特性：1)革蘭氏染色為陰性且形成孢子；2)氧化酶試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陽性，為需氧性；3)在包含1％的糖和0.2％的NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)中，作為該糖加入D?半乳糖或蔗糖時，不進行酸生成，但加入D?葡萄糖、乳糖、D?甘露糖醇、甘油或N?乙酰葡糖胺時，進行酸生成；等。上述新型微生物對屎尿、污泥等有機廢棄物的處理等是有用的。NITE BP-0176420131129
【專利說明】
新型微生物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及作為新弗拉特桿菌屬(Frateribaci Ilus屬）的新種的新型微生物。更 詳細而言，涉及具有新型的特性的黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus f Iavoalbus)。
【背景技術(shù)】
[0002] 以往的有機廢棄物的處理主要通過焚燒處理來進行。焚燒處理中，存在確保對有 機廢棄物焚燒時產(chǎn)生的廢氣、通過焚燒得到的灰燼進行填埋處理的場所等各種問題。作為 解決這些問題的手段，提出了使用微生物對有機廢棄物進行堆肥化的處理方法。如果利用 使用該堆肥化的處理方法，則可以使用所得處理物作為堆肥，因此可以減輕或消除由上述 焚燒所導(dǎo)致的各種問題，可以期待能夠持續(xù)的循環(huán)型社會的構(gòu)筑。
[0003] 以往的堆肥化的過程中，霉菌等真菌、被稱為放線菌的放線菌目 (Actinomycetales目）的細菌、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces屬）等高溫放線菌科 (Thermoactinomycetaceae科）的細菌、芽抱桿菌屬（Bacillus屬）、土芽抱桿菌屬 (Geobacillus屬）等芽孢桿菌科(Bacillaceae科）的細菌將有機物分解/同化而負責(zé)堆肥 化。這些微生物具有孢子形成能力，在升溫至自各個體的生長溫度以上的環(huán)境下，以孢子的 狀態(tài)表現(xiàn)出耐熱性，可以穩(wěn)定地保留于堆肥內(nèi)，因此，在生長最適溫度下將有機廢棄物分 解/同化后也重新形成堆肥，可以重復(fù)用于堆肥化。
[0004] 堆肥化中，與厭氧性發(fā)酵相比，需氧性發(fā)酵的有機物的分解快且能夠降低惡臭，所 以優(yōu)選。利用需氧性發(fā)酵的堆肥化的過程中，利用通氣的需氧性發(fā)酵開始，10天以內(nèi)堆肥內(nèi) 部的溫度變?yōu)槌^45 °C的高溫，高溫狀態(tài)被長期維持直至堆肥化結(jié)束。在45 °C~70 °C的堆 肥內(nèi)的高溫環(huán)境下，小單抱菌科(Micromonosporaceae科）、鏈霉菌科（Streptomycetaceae 科）、高溫單抱菌科（Thermomonosporanceae科）、鏈抱囊菌科（Streptosporangiaceae科）等 放線菌目的放線菌群、嗜熱性且具有絲狀形態(tài)的高溫放線菌科的細菌群負責(zé)有機物的分解 (非專利文獻1)。另外，土芽孢桿菌屬所屬的芽孢桿菌科的細菌群也存在于高溫環(huán)境下的堆 肥內(nèi)（非專利文獻2、非專利文獻3)。在高溫狀態(tài)的堆肥內(nèi)部，屬于限于這些的分類群的菌群 主要負責(zé)堆肥化，各科(family)內(nèi)的菌種由性狀類似的菌構(gòu)成，因此一般在變?yōu)楦邷匾院?的堆肥內(nèi)部的菌群為多樣性低的狀態(tài)。
[0005] 專利文獻1中記載了使用無氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)屬的菌株制造堆肥的方 法，專利文獻2中記載了使用芽孢桿菌(Bacillus)屬的菌株制造堆肥的方法，但均利用芽孢 桿菌科的細菌。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻1:日本特開2011-24569號公報 [0009] 專利文獻2:日本特開2008-278890號公報 [0010] 專利文獻3:日本特開2005-13063號公報 [0011]非專利文獻
[0012] 非專利文獻1:生物科學(xué)和生物工程雜志（Journal of bioscience and bioengineering)，Vol·99，ρ1_11，2005
[0013] 非專利文獻2:系統(tǒng)與進化微生物學(xué)國際雜志（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)，Vol·52，p2251_2255，2002
[0014] 非專利文獻3:系統(tǒng)和應(yīng)用微生物學(xué)（Systematic and Applied Microbiology)， Vol.34，p419-423,2011

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 發(fā)明要解決的問題
[0016] 此處，廢棄物處理中產(chǎn)出的有機廢棄物遍及有機性污泥、食品殘渣物、動物糞尿等 多種形式，根據(jù)廢棄物原料的種類而堆肥內(nèi)的PH、鹽濃度、腐植酸濃度、C/N比(碳率)有較大 變化。因此，為了有效地對多樣的有機廢棄物進行堆肥化處理，期望添加與已有的菌群不同 的菌群使其在堆肥中生長，通過多樣的菌種將有機物分解/同化。另外，添加的菌群具有孢 子形成能力，因此可以維持休眠狀態(tài)，可以期望耐于環(huán)境的變化。這是由于，穩(wěn)定的孢子的 狀態(tài)容易保管、搬運進而能夠重新形成堆肥重復(fù)使用，從該方面出發(fā)是經(jīng)濟的。
[0017] 為了解決上述課題，迄今為止本發(fā)明人等探索了能夠用于堆肥化的新型的細菌， 發(fā)現(xiàn)了屬于在80°C以上的環(huán)境下生長的新型的屬的超嗜熱菌(專利文獻3)。
[0018] 然而，為了更有效地將有機廢棄物進行堆肥化，正在尋求新型的微生物。
[0019] 本發(fā)明的課題在于，提供對屎尿、污泥等有機廢棄物的處理等有用的新型微生物。
[0020] 用于解決問題的方案
[0021] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了新型微生物，通過將其分離、鑒定，從而完成了本發(fā)明。
[0022] 即，本發(fā)明如以下所述。
[0023] 〔 1〕黃白弗拉特桿菌（Frateribaci I Ius f Iavoalbus )，其為弗拉特桿菌屬 (Frateribaci Ilus屬）的新種，具有如下1)~10)的特性：
[0024] 1)革蘭氏染色為陰性的桿菌且形成孢子；
[0025] 2)氧化酶試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陽性，為需氧性；
[0026] 3)在包含1 %的糖和2%的NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)中，作為該糖加入D-半乳糖或 蔗糖時不進行酸生成，但在加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺時進行 酸生成；
[0027] 4)最適生長溫度為45°C~55°C，在35°C以下或65°C以上沒有確認到增殖；
[0028] 5)最適pH為7 · 0~8 · 0，在pH5 · 7以下或pHIO · 0以上沒有確認到增殖；
[0029] 6)在CYC培養(yǎng)基中添加 NaCl直至終濃度達到7 %也確認到增殖；
[0030] 7)主要的甲基萘醌類為甲基萘醌類(MK)7;
[0031] 8)作為細胞壁肽聚糖的氨基酸組成，包含丙氨酸、谷氨酸和內(nèi)消旋型二氨基庚二 酸(meso-DAP);
[0032] 9)基因組DNA的鳥嘌呤和胞嘧啶(GC)含量為51.2%~52.4%;
[0033] 10)最主要的菌體脂肪酸為異（iso)-C16:0〇
[0034] 〔2〕根據(jù)上述〔1〕所述的黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)，其具有 16S rRNA基因，所述16S rRNA基因由與序列號1或序列號8~序列號19中的任一者所示的堿 基序列具有98.7%以上的同源性的喊基序列構(gòu)成。
[0035] 〔3〕根據(jù)上述〔1〕或〔2〕所述的黃白弗拉特桿菌(？抑七61"；^3(3；[11118；1^13￥03113118)， 其與YM17株：NITE BP-01764;YM17-2株：NITE BP-01948;YM17-3株：NITE BP-01949;YM17-4 株:NITE BP-01950或YM17-5株:NITE BP-01925的DNA-DNA雜交同源值為70% 以上。
[0036] 〔 4〕根據(jù)上述〔1〕~〔3〕中任一項所述的黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus flavoalbus)，其中，作為菌體脂肪酸，進一步包含反異-(：15:0、(：16 :0、反異-(：17:0、異-(：17: 0中的任一種以上。
[0037] 〔 5〕根據(jù)上述〔1〕~〔4〕中任一項所述的黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus flavoalbus)，其為作為菌體脂肪酸包含異-C16 :0進而包含反異(anteiso)-C15:0、反異-C17:0、異-C17:0的黃白弗拉特桿菌亞種黃白菌（Frate;ribacillusflavoalbus subsp·flavoalbus)〇
[0038] 〔 6〕根據(jù)上述〔1〕~〔4〕中任一項所述的黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus flavoalbus)，其為作為菌體脂肪酸包含異-C16:0進而包含反異-(：15:0、(：16 :0、反異-(：17:0 的黃白弗拉特桿菌亞種奠球菌(Frateribaci Ilus f lavoalbu ssubsp · fimetarium) 〇
[0039] 〔 7〕根據(jù)上述〔1〕~〔6〕中任一項所述的黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus flavoalbus)，其用于有機廢棄物的處理。
[0040] 〔8〕根據(jù)上述〔7〕所述的黃白弗拉特桿菌，其中，有機廢棄物為屎尿、有機性污泥、 食品殘渣物或動物糞尿。
[0041 ] 〔9〕根據(jù)上述〔1〕~〔8〕中任一項所述的黃白弗拉特桿菌，其為YM17株(NITE BP- 01764)、NaCl_20131016_04株、YM17-2株（NITE BP-01948)、YM17-3株（NITE BP-01949)、 YM17-4株（NITE BP-01950)、NaCl_20131016_19株、YM17-5株（NITE BP-01925)、NaCl_ 20131016_24 株、NaCl_20131016_28 株、NaCl_20131016_30 株、NaCl_20131016_34 株、NaCl-20131016-37株或 NaCl-20131016-38株中的任一者。
[0042] 〔 10〕一種有機廢棄物的處理方法，其中，使用上述〔1〕~〔9〕中任一項所述的黃白 弗拉特桿囷。
[0043] 〔11〕一種蛋白質(zhì)的分解方法，其中，使用上述〔1〕~〔9〕中任一項所述的黃白弗拉 特桿囷。
[0044] 〔12〕一種堆肥的制造方法，其具備如下工序:將〔1〕~〔9〕中任一項所述的前述黃 白弗拉特桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物添加/混合到有機廢棄物中得到第一混合物的工序；調(diào)整第一混 合物的水分量的工序;將第一混合物作為原料進行需氧性發(fā)酵得到第一發(fā)酵產(chǎn)物的工序； 和，得到第一發(fā)酵產(chǎn)物的總重量中的水分率滿足基準值的物質(zhì)作為堆肥的工序。
[0045] 〔13〕根據(jù)〔12〕所述的堆肥的制造方法，其還具備如下工序:將堆肥的一部分加入 到其他有機廢棄物中得到第二混合物的工序;調(diào)整第二混合物的水分量的工序;將第二混 合物作為原料進行需氧性發(fā)酵得到第二發(fā)酵產(chǎn)物的工序;和，得到第二發(fā)酵產(chǎn)物的總重量 中的水分率滿足基準值的物質(zhì)作為堆肥的工序。
[0046] 發(fā)明的效果
[0047] 根據(jù)本發(fā)明得到的新型微生物為新屬弗拉特桿菌(Frateribaci I Ius)屬的新種。 該新型微生物對屎尿、污泥等有機廢棄物的處理、蛋白質(zhì)的分解等是有用的，另外，可以用 于各種用途。
【附圖說明】
[0048] 圖1為示出YM17株的細胞照片的圖（實施例1)。
[0049] 圖2為示出通過鄰接法制成的系統(tǒng)樹的圖（實施例1)。
[0050] 圖3為示出與YM17株分離的12株的16S rRNA基因的系統(tǒng)樹的圖（實施例2)。
[0051] 圖4的A、圖4的B為示出堆肥培養(yǎng)中的菌的狀態(tài)的圖（實施例2)。
[0052]圖5的A、圖5的B為示出明膠酶譜法的結(jié)果的圖（實施例2)。
[0053]圖6為堆肥的制造方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0054]以下，列舉實施方式對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明不限定于以下的實施方式。
[0055][新型微生物]
[0056] 本發(fā)明的實施方式的黃白弗拉特桿菌是指具有如下1)~10)的特性的新型弗拉特 桿菌屬(弗拉特桿菌屬）：
[0057] 1)革蘭氏染色為陰性的桿菌且形成孢子；
[0058] 2)氧化酶試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陽性，為需氧性；
[0059] 3)在包含1 %的糖和2.0%的NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)中，作為該糖加入D-半乳糖 或蔗糖時，不進行酸生成，但加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺時，進 行酸生成；
[0060] 4)最適生長溫度為45°C~55°C，在35°C以下或65°C以上沒有確認到增殖；
[0061 ] 5)最適pH為7 · 0~8 · 0，在pH5 · 7以下或ρΗ10· 0以上沒有確認到增殖；
[0062] 6)在CYC培養(yǎng)基中添加 NaCl直至終濃度7 %也確認到增殖；
[0063] 7)主要的甲基萘醌類為MK7;
[0064] 8)作為細胞壁肽聚糖的氨基酸組成，包含丙氨酸、谷氨酸和內(nèi)消旋型二氨基庚二 酸(meso-DAP);
[0065] 9)基因組DNA的GC含量為51.2%~52.4%;
[0066] 10)最主要的菌體脂肪酸為異_C16:0。
[0067]作為該"主要的甲基萘醌類"，可以舉出：包含81.8%以上的MK7的物質(zhì)。
[0068]另外，作為"主要的菌體脂肪酸"，可以舉出：包含34.1%以上且42.6%以下的異_ C16:0的物質(zhì)。
[0069] 進而，作為"菌體脂肪酸"包含異-C16:0進而包含反異-C15:0、C16:0、反異-C17:0、 異-C17:0中的任一種以上。本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus fIavoalbus)優(yōu)選 包含總計86.1 %以上的這些脂肪酸。
[0070] 進而，本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus flavoalbus)優(yōu)選具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因由對序列號1或序列號8~19中的任一者所示的堿基序列具有 98.7%以上的同源性的喊基序列構(gòu)成。
[0071 ] 進而，本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)優(yōu)選與YM17株、 YMl 7-2株、YMl 7-3株、YMl 7-4株或YMl 7-5株的DNA-DNA雜交的同源值為70 %以上。
[0072] 作為這樣的本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)，可列舉 出：具有上述1)~10)的性質(zhì)且作為菌體脂肪酸包含異_C16:0進而包含反異-C15:0、反異-C17 :0、異-C17 :0的黃白弗拉特桿菌亞種黃白菌（Frateribacillus flavoalbus subsp.flavoalbus)〇
[0073] 作為這樣的黃白弗拉特桿菌亞種黃白菌（Frateribacillus flavoalbus subsp · flavoalbus)，可以舉出：后述的YM17株、YM17-5株等D
[0074] 另外，作為本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus flavoalbus)，具有上述 1)~10)的性質(zhì)，進而還可以舉出：作為菌體脂肪酸包含異_C16:0進而包含反異-C15:0、 C16:0、反異-C17 :0的黃白弗拉特桿菌亞種類球菌（Frateribacillus flavoalbus subsp·f imetarium)〇
[0075] 作為這樣的黃白弗拉特桿菌亞種糞球菌，可以舉出：NaCl_20131016_04株、 YM17-2 株、YM17-3 株、YM17-4 株、NaCl_20131016_19 株、NaCl_20131016_24 株、NaCl_ 20131016_28 株、NaCl_20131016_30 株、NaCl_20131016_34 株、NaCl_20131016_37 株 和 NaCl_20131016_38 株等。
[0076] 作為本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)所列舉的YM17株 具有上述特性，且16SrRNA的堿基序列與序列表序列號1中記載的堿基序列為100%相同。
[0077] 本菌株根據(jù)本
【申請人】的申請、在獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)(NITE)專利 微生物保藏中心基于布達佩斯條約進行了國際保藏。以下，記載規(guī)定保藏的內(nèi)容。
[0078] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0079] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0080] 電話號碼0438-20-5580
[0081] (3)保藏編號：NITE BP-01764
[0082] (4)用于識別的標識:YM17
[0083] (5)原保藏日：2013年11月29日
[0084]另外，同樣地對于作為本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌所列舉的YM17-2株、YM17-3株、 YMl 7-4株和YM17-5株，也根據(jù)本
【申請人】的申請，在獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu) (NITE)專利微生物保藏中心基于布達佩斯條約進行了國際保藏。實施例等中示出規(guī)定它們 的保藏的內(nèi)容。
[0085] 本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌中也包括相當(dāng)于該黃白弗拉特桿菌的菌株的突變株。另 外，黃白弗拉特桿菌中，也包括黃白弗拉特桿菌亞種、黃白弗拉特桿菌亞種糞球菌的突變 株。
[0086] 本發(fā)明中的該突變株是指通過導(dǎo)入化學(xué)突變、自然突變、形態(tài)突變、轉(zhuǎn)染等基因工 程學(xué)手法改變了其物理特性、化學(xué)特性且具有上述1)~10)的全部特性的菌株。
[0087][有機廢棄物的處理方法/堆肥的制造方法]
[0088] 本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌可以用于有機性污泥、食品殘渣物或動物糞尿等有機廢 棄物的處理。通過在這些有機廢棄物中加入黃白弗拉特桿菌，也可以制造堆肥等。
[0089] 使用本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌的有機廢棄物的處理方法中，不僅在有機廢棄物中 加入黃白弗拉特桿菌，還可以在有機廢棄物的處理中包括有用的其他工序。
[0090] 此處，參照圖6,并且作為有機廢棄物的處理方法的1個方式，對堆肥的制造方法進 行說明。此處，示出使用了堆積型發(fā)酵槽的例子，但制造設(shè)備不限定于此。需要說明的是，作 為堆積型發(fā)酵槽，優(yōu)選使用：以俯視被3面分隔成大致"二"字狀的、堆積型發(fā)酵槽。
[0091] 首先，在步驟101中，作為發(fā)酵產(chǎn)物，準備包含上述黃白弗拉特桿菌的黃白弗拉特 桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物。另外，準備有機廢棄物。然后，將準備好的有機廢棄物配置于堆積型發(fā)酵 槽內(nèi)。
[0092] 接著，步驟103中，在有機廢棄物中添加?混合規(guī)定量的發(fā)酵產(chǎn)物，得到第一混合 物。需要說明的是，作為任意工序的步驟102中，可以從數(shù)據(jù)庫取出期望的數(shù)據(jù)，對有機廢棄 物規(guī)定最佳的發(fā)酵產(chǎn)物的添加量、需氧性發(fā)酵條件后，進行步驟103以后的工序。
[0093] 步驟105中，調(diào)整第一混合物的水分量。通常，剛剛制備后的第一混合物的總重量 中的水分率為40~80%左右。由此，高于上限值時添加回流堆肥（后述的步驟112中取出的 堆肥），低于下限值時添加水分。
[0094] 步驟108中，例如從配置于堆積型發(fā)酵槽的床的空氣管對第一混合物進行強制通 氣(換氣），或使用裝載機翻動第一混合物，由此對第一混合物進行需氧性發(fā)酵得到第一發(fā) 酵產(chǎn)物。作為需氧性發(fā)酵的條件，優(yōu)選1周內(nèi)翻動1次左右。
[0095] 步驟110中，判斷第一發(fā)酵產(chǎn)物的總重量中的水分率是否滿足基準值。水分率不滿 足基準值時，重復(fù)步驟105或步驟108。水分率以第一發(fā)酵產(chǎn)物的總重量基準計優(yōu)選小于 30%。這是由于，為了維持作為堆肥的性能，優(yōu)選以堆肥總重量中的固體成分量變?yōu)?0%以 上的方式進行調(diào)整。水分率以第一發(fā)酵產(chǎn)物的總重量基準計更優(yōu)選為20~30%。需要說明 的是，作為任意工序，可以在步驟111中關(guān)聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)物的添加量、需氧性發(fā)酵的條件等而存 儲于數(shù)據(jù)庫。
[0096]步驟112中，取出水分率滿足基準值的物質(zhì)作為堆肥。至此的發(fā)酵時間為45~60天 左右。由以上，可以由有機廢棄物制造堆肥。
[0097]可以直接使用所得堆肥，也可以在步驟203中將堆肥的一部分加入到其他有機廢 棄物中得到第二混合物，進而進行與上述步驟103~步驟112同樣的工序，從而進一步制造 堆肥。
[0098]以往的有機廢棄物的處理中，焚燒有機廢棄物、填埋處理所得灰燼，因此，存在確 保廢氣、填埋處理場所等由焚燒所導(dǎo)致的各種問題。然而，根據(jù)實施方式的有機廢棄物的處 理方法，可以使用所得處理物作為肥料，因此，可以減輕或消除上述由焚燒所導(dǎo)致的各種問 題，實現(xiàn)能夠持續(xù)的循環(huán)型社會的構(gòu)筑。進而，通過上述方法得到的堆肥的礦物質(zhì)豐富。
[0099] 假定對堆肥進行焚燒處理時，堆肥的水分量低，從而即使不加入礦物燃料，也能夠 焚燒，因此，與如果不加入礦物燃料則無法焚燒的以往的焚燒處理方法相比，可以大幅削減 被認為是溫室效應(yīng)氣體的二氧化碳(CO 2)氣體排出量。另外，堆肥的重量為原來的有機廢棄 物的重量的10~30%左右，因此可以將進行焚燒時的燃料費抑制得較低而且可以減小埋設(shè) 焚燒后的堆肥時的用地面積。
[0100] 以往的使用微生物的有機廢棄物的處理(堆肥的制造）中，必須根據(jù)有機廢棄物原 料而仔細調(diào)整發(fā)酵條件。這是由于，根據(jù)廢棄物原料的種類而堆肥內(nèi)的PH、鹽濃度、腐植酸 濃度、C/N比有較大變化。然而，利用上述新型微生物則不需要仔細調(diào)整發(fā)酵條件，因此例如 可以將圖6的步驟10 2、步驟111簡略化或省略。
[0101] 進而，由于可以使用大量包含對堆肥化有效的菌的回流堆肥，因此，步驟103中，將 廢棄物原料和回流堆肥混合后的堆肥化進行的初期的開始變快。另外，由于附帶設(shè)備簡單， 因此可以將附帶設(shè)備費抑制為較低，且可以將運轉(zhuǎn)費用抑制為較低。
[0102] [其他實施方式]
[0103] 進而，本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)可以用于蛋白質(zhì) 的分解。另外，使用本發(fā)明的黃白弗拉特桿菌(FrateribacilIus f Iavoalbus)的蛋白質(zhì)的 分解方法中，不僅在蛋白質(zhì)、包含蛋白質(zhì)的分解對象中加入黃白弗拉特桿菌 (Frateribacillus flavoalbus)，而且在蛋白質(zhì)的分解中也可以包括有用的其他工序。 [0104]以下，列舉實施例更具體地說明本發(fā)明，當(dāng)然本發(fā)明并不限定于此。
[0105] 實施例
[0106] 〔實施例1〕
[0107] 黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)的分離?鑒定
[0108] 1.菌株的分離
[0109]從鹿兒島縣曾于市的堆肥化場的堆肥中分離出YM17株。
[0110] 即，在包含50yg/mL新生霉素（Novobiocin)的4mL的1/2營養(yǎng)培養(yǎng)基（Nutrient medium)(蛋白胨:0.25%、氯化鈉:0.25%、酵母提取物:0.1%、肉提取物:0·05%、ρΗ7·4)中 加入該堆肥400mg，在55 °C下培養(yǎng)2天，然后將該液體培養(yǎng)液涂布于包含50yg/mL新生霉素的 1/2營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天，分離出YMl 7株的菌落。
[0111] 2.分類學(xué)性質(zhì)
[0112] A.試驗方法
[0113]菌株的分類學(xué)性質(zhì)按照"新生化學(xué)實驗講座第17卷微生物實驗法（東京化學(xué)同人 發(fā)行)"、"修訂版微生物的分類和鑒定<下>(學(xué)會出版中心發(fā)行)"、"微生物的分類?鑒定 實驗法（Springer Japan發(fā)行）"、BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology所述的 方法進行分析。分離菌株的分類和鑒定通過與International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology雜志所述的種的比較來進行。
[0114] 將通過該解析得到的形態(tài)性質(zhì)、培養(yǎng)性質(zhì)、生理學(xué)性質(zhì)、生長范圍和化學(xué)分類學(xué)性 質(zhì)示于表2-1、表2-5。另外，將在55°C下培養(yǎng)YM17株的細胞照片示于圖1。圖1中，可以確認， YM17株為桿菌，在細胞的末端形成孢子。圖1的條表示ΙΟμπι。需要說明的是，表2(表2-1~表 2-5)中也一并示出實施例2中分離出的12個菌株的分類學(xué)性質(zhì)。
[0115] Β.試驗培養(yǎng)基
[0116] 各培養(yǎng)基的pH如表2-1中所述。除了石蕊牛奶以外，各培養(yǎng)基在121°C下進行15分 鐘的高壓釜滅菌。石蕊牛奶在ll〇°C下進行10分鐘的高壓釜滅菌。對克里斯坦森尿素培養(yǎng)基 的尿素、OF試驗培養(yǎng)基的糖、考察了來自糖的酸生成的糖類進行過濾器滅菌，以成為記載的 終濃度的方式加入到各培養(yǎng)基中。需要說明的是，來自糖的酸生成使用包含1%的糖和2% 的NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)進行考察。
[0117] (I)CYC瓊脂培養(yǎng)基(鹿糖:3%、酪蛋白氨基酸:0.6%、硝酸鈉:0.3%、酵母提取物： 0.2 %、磷酸氫二鉀：0.1 %、硫酸鎂七水合物：0.05 %、氯化鉀：0.05 %、硫酸鐵七水合物： 0.001 %、瓊脂：1.5%)
[0118] (2)CYC液體培養(yǎng)基(蔗糖:3 %、酪蛋白氨基酸:0.6 %、硝酸鈉:0.3 %、酵母提取物： 0.2 %、磷酸氫二鉀：0.1 %、硫酸鎂七水合物：0.05 %、氯化鉀：0.05 %、硫酸鐵七水合物： 0.001%)
[0119] (3)肉汁瓊脂培養(yǎng)基（肉提取物:1 %、蛋白胨:1 %、氯化鈉:0.5%、瓊脂:1.5%)
[0120] (4)肉汁液體培養(yǎng)基（肉提取物:1 %、蛋白胨:1 %、氯化鈉 :0.5% )
[0121] (5)石蕊牛奶(脫脂牛奶:10%、1 %石蕊液:數(shù)滴）
[0122] (6) VP培養(yǎng)基(酵母提取物:0 · 1 %、胰蛋白胨:0 · 7 %、大豆蛋白胨:0 · 5 %、葡萄糖： 1 %、氯化鈉:0.5%、瓊脂:0.3%)
[0123] (7) SM培養(yǎng)基（肉提取物:0.3 %、蛋白胨：3 %、硫代硫酸鈉 :0.005 %、鹽酸半胱氨 酸:0.02%、檸檬酸鐵銨:0.058、瓊脂:0.5%)
[0124] (8) LB瓊脂培養(yǎng)基（胰蛋白胨：1 %、氯化鈉：0.5 %、酵母提取物：0.5 %、瓊脂： 1.5%)
[0125] (9) SY瓊脂培養(yǎng)基(硫酸銨:0 · 2 %、磷酸氫二鈉 :0 · 14 %、磷酸二氫鉀:0 · 07 %、硫酸 鎂七水合物:0.02 %、硫酸鐵七水合物:0.0005 %、硫酸錳五水合物:0.0005 %、葡萄糖:1 % )
[0126] (10)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（肉提取物:0.3%、蛋白胨:0.5%、瓊脂:1.5% )
[0127] (11)西蒙氏培養(yǎng)基(Simmons Medium)(磷酸二氫銨:0.1 %、磷酸氫二鉀:0.1 %、氯 化鈉:0.5%、檸檬酸鈉:0.2%、硫酸鎂七水合物:0.02%、瓊脂：1.5%、ΒΤΒ:0.008%)
[0128] (12)克氏培養(yǎng)基(Christensen Medium)(酵母提取物:0.05%、半胱氨酸鹽酸鹽： 0.01 %、氯化鈉:0.5%、檸檬酸鈉:0.3%、葡萄糖:0.02%、磷酸二氫鉀:0.1 %、瓊脂：1.5%、 酚紅：0.0012%)
[0129] (13)硝酸鹽培養(yǎng)基(葡萄糖：1.0 %、磷酸二氫鉀:0.1 %、硫酸鎂七水合物:0.05 %、 氯化鉀:0.02%、硝酸鈉:0.1%)
[0130] (14)銨鹽培養(yǎng)基(葡萄糖：1 · 0%、磷酸二氫鉀:0 · 1 %、硫酸鎂七水合物:0 · 05%、氯 化鉀:0 · 02 %、硫酸銨:0 · 078 % )
[0131 ] (15)克里斯坦森尿素培養(yǎng)基（Christensen's urea medium)(蛋白胨：0· 1%、氯化 鈉:0.5%、葡萄糖:0.18、1012?〇4:0.2%、酚紅 :0.0008%、瓊脂：1.5%、尿素:2%)
[0132] (16)OF試驗培養(yǎng)基（蛋白胨：0.2 %、氯化鈉：0.5 %、磷酸氫二鉀：0.03 %、瓊脂： 0·2%、ΒΤΒ:0·008%、糖：1%)
[0133] C.脂肪酸的分析
[0134] 1)試樣調(diào)整和利用氣相色譜法的分析
[0135] 在5L的三角燒瓶中加入了3L的CYC液體培養(yǎng)基的主培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種經(jīng)過種子培 養(yǎng)的菌，在52°C下從對數(shù)增殖期后期進行培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期，通過離心回收菌體。
[0136] 將經(jīng)過回收的菌體用生理鹽水清洗2次。將約500mg~700mg的濕菌體加入至帶螺 旋蓋的離心管中。加入ImL的堿皂化液，進行密封，在100°C下保持5分鐘。5分鐘后，充分振蕩 10秒，進一步在100 °C下保持30分鐘。將離心管冷卻，然后加入2mL的鹽酸甲醇試劑，進行密 封，在80°C下保持10分鐘。將離心管冷卻后，加入1.25mL的抽提用溶劑，緩慢攪拌10分鐘。將 離心管以1000 rpm進行5分鐘離心，然后將上層移至其他帶螺旋蓋的離心管，加入3mL的清洗 液。再次進行密封，攪拌5分鐘。將該離心管以1000 rpm進行5分鐘離心，然后將溶劑層取至玻 璃安瓿，用氮氣使其干燥。各試劑的組成如下述所示。將所得干燥試樣作為脂肪酸分析試 樣，通過TechnoSuruga Laboratory Co.，Ltd.的氣相色譜儀進行分析。將所得結(jié)果示于表 1〇
[0137] 2)試劑
[0138] (I)堿皂化液(氫氧化鈉:7 · 5g、甲醇:25mL、超純水:25mL)
[0139] (2)鹽酸甲醇試劑(6 N鹽酸:21 · 7 m L、甲醇：18 · 3m L)
[0140] (3)抽提用溶劑(己烷:IOmL、叔丁基甲基醚:IOmL)
[0141] (4)清洗液(氫氧化鈉:0 · 586g、超純水:48 · 8mL)
[0142] [表 1]
[0143] 黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus fIavoalbus)的菌體脂肪酸組成
[0145] D ·細胞壁肽聚糖
[0146] 1)試樣調(diào)整
[0147] 將約2g的濕菌體懸浮于6mL的50mM磷酸鹽緩沖液（pH7.2)，通過超聲波破碎機 (TAITEC株式會社制造的VP-30S)進行30分鐘處理，將細胞破碎。將破碎液在溫度4°C下、以 3000rpm進行10分鐘離心，回收上清。將上清在溫度4°C下、以9000rpm進行60分鐘離心，去除 上清，將沉淀物移至新的離心管。在沉淀物中加入6mL的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)并進行 清洗，然后在溫度4°C下、以9000rpm進行60分鐘離心，去除上清。在沉淀物中加入2mL的50mM 磷酸鹽緩沖液(pH7.2)和400yL的25 %十二烷基硫酸鈉(SDS)，在100°C下保持40分鐘。進一 步加入預(yù)先加熱至65°C的IOmL的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)，進行攪拌，然后在溫度30°C 下、以9000rpm進行60分鐘離心。
[0148] 去除上清，在沉淀物中加入預(yù)先加熱至65°C的5mL的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)并 進行清洗，然后在溫度30°C下、以9000rpm進行30分鐘離心，去除上清。進行該清洗操作2次。 清洗后，在沉淀物中加入2mL的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.6)和IOOyL的lmg/mL鏈霉蛋白酶液， 在37 °C下保持2小時。在該鏈霉蛋白酶反應(yīng)后的液體中加入5mL的5OmM磷酸鹽緩沖液 (PH7.6)，清洗細胞壁成分，然后在溫度4°C下、以9000rpm進行30分鐘離心，去除上清。進行 該清洗操作2次。
[0149] 在清洗后的沉淀物中加入2mL的5 %三氯乙酸水溶液，在100 °C下保持20分鐘。將該 懸浮液移至玻璃制的帶螺旋蓋的離心管，加入5mL的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)并進行清 洗，然后在室溫下、以1000 rpm進行1分鐘離心，去除上清。進行該清洗操作2次。在清洗后的 沉淀物中加入3mL的乙醇，在室溫下、以1000 rpm進行1分鐘離心，去除上清。在沉淀物中加入 3mL的二乙醚，在室溫下、以1000 rpm進行1分鐘離心，去除上清，使沉淀物干燥，將其作為細 胞壁試樣。
[0150] 2)利用薄層色譜法(TLC)的分析
[0151] 在5mg的細胞壁試樣中加入250yL的4N鹽酸，在100 °C下進行16小時水解反應(yīng)。水解 反應(yīng)后，在裝有氫氧化鉀的干燥器內(nèi)去除鹽酸，將所得處理液供試于TLC。
[0152] TLC板使用Merck株式會社制造、TLC纖維素板、Cat.No. 1.05716.0001。構(gòu)成氨基酸 的檢測中，將第一維用異丙醇：乙酸:超純水= 75:10:15的展開溶劑展開，將第二維用甲醇： 吡啶：ION鹽酸:超純水=64:8:2:14展開。展開后，對TLC板噴涂茚三酮試劑，檢測細胞壁肽 聚糖中所含的氨基酸。另外，二氨基庚二酸的異構(gòu)型的檢測使用相同的TLC板，用甲醇：吡 啶：ION鹽酸:超純水= 64:8:2:14進行展開，通過與標準品的迀移率的比較進行特定。其結(jié) 果確認了，作為細胞壁肽聚糖的氨基酸組成，包含丙氨酸、谷氨酸和內(nèi)消旋型二氨基庚二酸 (meso-DAP)〇
[0153] E.甲基萘醌類
[0154] 1)試樣調(diào)整
[0155] 在約500mg的干燥菌體中加入20mL的氯仿：甲醇= 2:1液體，在冷暗處緩慢攪拌一 晚。將該懸浮液過濾，將濾液用熱水浴溫度30°C的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮干固。將干固物溶于 3mL的丙酮，在氮氣中濃縮至約200yL。將該濃縮液供試于Merck株式會社制造、HPTLC硅膠 60F254板、Cat. No. 1.05628.0001，將甲苯作為展開溶劑進行展開。展開后，將TLC板干燥，在 UV燈(254nm)下確認甲基萘醌類的譜帶，將該部分的硅膠用刮鏟刮下，放入試驗管中。在刮 下的硅膠中加入4mL的丙酮，緩慢攪拌，進行過濾器過濾，去除硅膠顆粒。將所得上清通過氮 氣濃縮至約200yL，將其作為HPLC的試樣。
[0156] 2)利用高效液相色譜法(HPLC)的分析
[0157] 將試樣25yL注入到HPLC中。柱使用ODS柱(株式會社資生堂制造 、CAPCELL PAK C18 UG120 HPLC PACKED COLUMN Cat.No.61504)，展開溶劑使用甲醇：異丙醇= 2:1液體。以移 動速度1.5mL/分鐘、柱溫40°C進行展開，在UV(270nm)下進行檢測。HPLC的機械使用 Hewlett-Packard Company制造的Series 1100 HPLC System。進行該分析多次，結(jié)果MK7的 含量在第1次為83.9 %、在第2次為85.2 %，因此確認了，主要的甲基萘醌類為MK7。
[0158] F.GC 含量
[0159] 1)DNA 調(diào)整
[0160] 基因組DNA的提取按照參考文獻1的方法進行。
[0161] 即，將0.9g~1.6g的濕菌體用生理鹽水-0.1 M EDTA(pH8.0)進行清洗，然后懸浮于 5mL的同一溶液。以終濃度lmg/mL添加蛋清溶菌酶，在35 °C下使其溶菌，然后使溶菌液冷凍。 在冷凍品中加入等量的三羥基甲基氨基甲烷(Tri s) -SDS (pH 9.0 )，在60 °C的熱水浴中進行 融化，保持10分鐘。之后，進行冰冷，加入等量的水飽和苯酚，振蕩10分鐘。離心并回收上清， 加入2倍量的乙醇，將纖維狀的DNA用玻璃棒卷取。將卷取的DNA用70%、90%、99.5%的乙醇 進行階段性清洗，去除苯酚。將DNA干燥后，用適量的0.1 X SSC溶液溶解，加入RNase，在35°C 下使其反應(yīng)30分鐘以上，去除RNA。冰冷后，加入1/5量的水飽和苯酚，同樣地進行振蕩、離 心，去除乙醇沉淀、苯酚，用0.1 X SSC溶液進行溶解、RNase處理。
[0162] 對RNase處理后的DNA進行苯酚處理，離心，分離回收DNA溶解級分，在DNA溶解級分 中加入1/10量的乙酸EDTA和0.6倍量的異丙醇，再次卷取DNA。將卷取后的DNA用70%、90%、 99.5%的乙醇進行清洗，干燥，然后以DNA濃度變?yōu)?00yg/mL以上的方式用0.1 X SSC溶液進 行溶解。DNA的純度低時，重復(fù)利用苯酚的蛋白質(zhì)的去除和RNas e處理。
[0163] 參考文獻 I : Sa i to，H · &Miura，K · 1963 · Pr eparat i on of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment.Biochim.Biophys.Acta 72:619-629.
[0164] 2)試劑
[0165] (I)生理鹽水-〇· IM EDTA(NaCl:8.77g、EDTA · 2Na · 2出0:37.2284!1:8.0、超純 水：以總液量成為1000 mL的方式加入）
[0166] (2)Tris-SDS(Tris:12.1g、SDS:20.0g、pH9.0、超純水：以總液量成為1000 mL的方 式加入）
[0167] (3)20 X SSC(NaCl :175g、檸檬酸三鈉 :77.4g、超純水：以總液量變?yōu)?000 mL的方式 加入。0.1 X SSC和I X SSC是將20 X SSC用超純水稀釋而制成的）
[0168] (4)乙酸EDTA(A液：CH3COONa · 3H20:81.65g/超純水200mL、B液：CH3⑶0H:36.03g/ 超純水200mL。將A液和B液混合調(diào)整為pHT.iLEDTA · 2Na · 2H20:74.45mg/形成作為調(diào)整液 2OOmL 的乙酸EDTA)
[0169] 3)GC含量的測定
[0170] GC含量的測定使用DNA GC kit(YAMASA CORPORATION制造）。將7yg相當(dāng)量的DNA溶 解于20yL的0.1 X SSC，在100°C使其熱變性10分鐘，立即進行冰冷。冰冷后，加入20yL的4U/ mL核酸酶Pl溶液，在50°C下使其反應(yīng)1小時。核酸酶Pl處理后，加入20yL的2.4U/mL堿性磷酸 酶溶液，在37 °C下使其反應(yīng)1小時，將其供試于HPLC。
[0171] HPLC的柱使用ODS柱（株式會社資生堂制造 、CAPCELL PAK C18 UG120 HPLC PACKED COLUMN Cat.No.61504)，展開溶劑使用0.02M NH4H2P〇4:乙腈= 20:1 液體。以移動速 度1.0 mL/分鐘、柱溫40°C進行展開，在UV(270nm)下進行檢測。以附屬于DNA GC kit的標準 作為基準，計算YM17株的GC含量，結(jié)果GC含量為51.4%。
[0172] [表 2-1]
[0173] 黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus fIavoalbus)的分類學(xué)解析的結(jié)果
[0175] *除了生長溫度和化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)的其他試驗在培養(yǎng)溫度55°C下進行。
[0176] [表 2-2]
[0177] 黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus fIavoalbus)的分類學(xué)解析的結(jié)果
[0179] *除了生長溫度和化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)的其他試驗在培養(yǎng)溫度55°C下進行。
[0180] [表 2-3]
[0181] 黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus fIavoalbus)的分類學(xué)解析的結(jié)果
[0183] *除了生長溫度和化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)的其他試驗在培養(yǎng)溫度55°C下進行。
[0184] [表 2-4]
[0185] 黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus fIavoalbus)的分類學(xué)解析的結(jié)果
[0187] *除了生長溫度和化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)的其他試驗在培養(yǎng)溫度55°C下進行。
[0188] [表 2-5]
[0190] G.16S rRNA基因的堿基序列的解析
[0191] 1)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR反應(yīng)）
[0192] 通過菌落直接PCR法擴增YM17株的16S rRNA基因。PCR反應(yīng)使用Tks GfIex(商標） DNA Polymerase(TAKARA BIO INC.制造）和EUlOF引物（序列表序列號2)、EU1500R引物（序 列表序列號3)。PCR反應(yīng)液的組成按照Tks Gf I ex (商標)DNA Po I ymeras e的說明書所述的混 合比例。PCR反應(yīng)如下:進行94°C下1分鐘的熱處理1個循環(huán)，然后進行98°C下10秒、55 °C下15 秒、68 °C下1分鐘30秒的反應(yīng)30個循環(huán)。
[0193] 2)序列反應(yīng)
[0194] 所得PCR反應(yīng)物通過Wizard(注冊商標）SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation制造)進行純化。使用純化產(chǎn)物和EUlOF引物、EU520F引物(序列表序 列號4)、EU907R引物（序列表序列號5)或EU1500R引物進行序列反應(yīng)，確定分離菌株的16S rRNA基因的堿基序列。
[0195] 將YM17株的16S rRNA基因的堿基序列示于序列表序列號1。
[0196] 對于YM17株的16S rRNA基因堿基序列，進行作為基因數(shù)據(jù)庫的國家生物技術(shù)信息 中心（The National Center for Biotechnology Information)的BLAST 同源檢索 (http://blast.Ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結(jié)果與YM17株的 16S rRNA基因顯不出最 高同源性的種為無孢子阜硫-洛克菌(Mechercharimyces asporophorigenens)，同源性為 91%〇
[0197] 接著，通過國家生物技術(shù)信息中心（The National Center for Biotechnology Information)的基因數(shù)據(jù)庫收集與YM17株近緣種的16S rRNA基因，進行系統(tǒng)解析。
[0198] 將收集好的16S rRNA基因堿基序列通過Clustal X 2.0.12程序進行比對，通過鄰 接法制成系統(tǒng)樹。將所得系統(tǒng)樹示于圖2。括號內(nèi)的數(shù)字表示GenBank的登記號，YM16表示利 用與本發(fā)明同樣的方法由本發(fā)明人等分離出的菌株。
[0199] H.YM17株的鑒定和分類
[0200] 1)YM17株
[0201] 如圖2的系統(tǒng)解析所示那樣，YM17株的16S rRNA基因形成大致分為芽孢桿菌科、環(huán) 脂酸芽孢桿菌科(Alicyclobaci Ilaceae科)、高溫放線菌科的分支。
[0202] YM17株所示的桿菌的形態(tài)、細胞內(nèi)進行芽胞形成的形態(tài)為在芽孢桿菌科、環(huán)脂酸 芽孢桿菌科中可見的性質(zhì)，與形成絲狀性的菌絲的高溫放線菌科 (Thermoactinomycetaceae科）明顯不同。
[0203]將YM17株與屬于芽孢桿菌科和環(huán)脂酸芽孢桿菌科的種的16S rRNA基因序列的同 源性進行比較。將結(jié)果示于表3。全部屬中同源性變?yōu)?9%以下，YM17株與屬于芽孢桿菌科 和環(huán)脂酸芽孢桿菌科的種在分類學(xué)上有較大不同。圖2的系統(tǒng)樹中，進行與YM17株分支接近 的酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius)、極端嗜熱砂地菌 (Calditerricola satsumensis)、嗜熱卡達卡利桿菌（Caldalkalibacillus thermarum)、 馬兜鈴熱桿菌屬(CaldibaciIlus debiIis)和YMl7株的分類學(xué)性質(zhì)的比較。將結(jié)果示于表 4〇
[0204]表4中，除了YM17株以外的數(shù)據(jù)由 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2002),52,1681-1685；Journal of General Microbiology (1971),67,9-15；International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2011),61,631-636；International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2006)，56，1217-1221和International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2004)，54,2197_2201 獲得。
[0205]環(huán)脂酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus屬），在主要的脂肪酸的特征性質(zhì)是具有 〇-環(huán)己烷-(：17:0、〇-環(huán)己烷-(：19:0作為主要脂肪酸，與￥117株不同。
[0206]極端嗜熱菌屬(Calditerricola屬)為能夠在75°C以上生長的高度嗜熱性細菌，與 YMl 7株不同。
[0207] 卡達卡利桿菌(Caldalkalibacillus屬)在革蘭氏染色為陽性、DNA的堿基組成為 45%的方面與YM17株不同。
[0208]熱桿菌屬(Caldibaci Ilus屬)在65 °C以上也生長，未見來自葡萄糖的酸生成，因此 與YM17株不同。
[0209]由以上判定，YM17株為新科(弗拉特桿菌科，F(xiàn)rateribacillus)、新屬(弗拉特桿菌 屬，F(xiàn)rateribacilIus)的新種，將YM17株命名為黃白弗拉特桿菌（以下，有時簡單稱為黃白 弗拉特桿菌，F(xiàn)rateribacillus flavoalbus) 〇
[0210] [表 3]
[0211] YM17株與屬于芽孢桿菌科和環(huán)脂酸芽孢桿菌科的種的16S rRNA基因的同源性
[0213] *括號內(nèi)的數(shù)字表;^GenBank的登記號D
[0214][表 4]
[0216] 〔實施例2〕
[0217] 黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus fIavoalbus)種的分離
[0218] 根據(jù)上述實施例1表明，黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus f Iavoalbus)種與已 知的科/屬/種不同。因此，為了明確黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)種的 特性，進行YM17株以外的屬于黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus fIavoalbus)種的菌株的 分離。
[0219] 1 ·黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)種的分離
[0220]將鹿兒島縣曾于市的堆肥化場和鹿兒島市的堆肥化場的堆肥作為分離源，嘗試了 黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus flavoalbus)種的菌株的分離。
[0221] 將上述實施例1中的YM17株的培養(yǎng)性狀作為參考，將CYC瓊脂培養(yǎng)基中添加或沒有 添加7 %或10 %的氯化鈉和50yg/mL氨節(jié)西林的培養(yǎng)基作為分尚培養(yǎng)基，在55 °C的培養(yǎng)溫度 下培養(yǎng)6天，進行菌的分離，結(jié)果絲狀細菌的大量的菌落和桿菌狀的細菌的菌落出現(xiàn)在分離 培養(yǎng)基上。
[0222] 從其中分離桿菌狀的細菌的菌落，通過用于檢測如下2.所示的黃白弗拉特桿菌 (Frateribacillus flavoalbus)種的特異性PCR進行判定，結(jié)果如表5所示那樣，總計12個 菌株判定為黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)種。
[0223] 特別是，CYC瓊脂培養(yǎng)基中添加有7%氯化鈉和50yg/mL氨芐西林的培養(yǎng)基中的分 離頻率高，使用該培養(yǎng)基，在55 °C下進行培養(yǎng)，由此可以有效地分離黃白弗拉特桿菌 (Frateribacillus flavoalbus)種。
[0224] 對于分離出的12個菌株，分別設(shè)為NaCl_20131016_04株、YM17-2株、YM17-3株、 YM17-4 株、NaCl_20131016_19 株、YM17-5 株、NaCl_20131016_24 株、NaCl_20131016_ 28 株、NaCl_20131016_30 株、NaCl_20131016_34 株、NaCl_20131016_37 株或 NaCl_ 20131016_38 株。
[0225] 其中，對于YMl7-2株、YMl7-3株、YMl7-4株和YMl7-5株，根據(jù)本
【申請人】的申請，在獨 立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)(NITE)專利微生物保藏中心基于布達佩斯條約進行國 際保藏。以下，記載規(guī)定保藏的內(nèi)容。
[0226] YM17-2株
[0227] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0228] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0229] 電話號碼0438-20-5580
[0230] (3)保藏編號：NITE BP-01948
[0231] (4)用于識別的標識:YM17-2
[0232] (5)原保藏日：2014年10月6日
[0233] YM17-3株
[0234] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0235] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0236] 電話號碼0438-20-5580
[0237] (3)保藏編號：NITE BP-01949
[0238] (4)用于識別的標識:YMl 7-3
[0239] (5)原保藏日：2014年10月6日
[0240] YM17-4株
[0241 ] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0242] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0243] 電話號碼0438-20-5580
[0244] (3)保藏編號：NITE BP-Ol95O
[0245] (4)用于識別的標識:YM17-4
[0246] (5)原保藏日：2014年10月6日
[0247] YM17-5株
[0248] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0249] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0250] 電話號碼0438-20-5580
[0251] (3)保藏編號：NITE BP_01925
[0252] (4)用于識別的標識:YMl 7-5
[0253] (5)原保藏日：2014年8月28日
[0254] 2 ·用于檢測黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus f Iavoalbus)種的特異性PCR
[0255] 如下進行用于檢測黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus fIavoalbus)種的特異性 PCR。首先，YM17株的16S rRNA基因使用特異性的堿基序列，制成TIP155F1引物（5'_ ATACCGGATAAGAGGCTTTT-3'）（序列表序列號 6)和 TIP155R1 引物（5'-TGGTACCGTCACGCTAAGA-3'）（序列表序列號7)。
[0256] PCR反應(yīng)中使用Tks Gflex(商標）DNA聚合酶（DNA Polymerase)、TIP155F1 引物、 TIP155R1引物和分離菌株的DNAc3PCR反應(yīng)液的組成按照Tks Gflex(商標)DNA Polymerase 的說明書記載的混合比例。PCR反應(yīng)如下：進行94°C下1分鐘的熱處理1個循環(huán)，然后進行98 °C下10秒、55 °C下15秒、68 °C下1分鐘的反應(yīng)25個循環(huán)，將電泳中在328bp附近確認到擴增產(chǎn) 物的菌株判定為黃白弗拉特桿菌(Frater ibaci I Ius f Iavoalbus)種。
[0257] [表 5]
[0259] 3.分離菌株的分類學(xué)解析
[0260]利用與針對YM17株的實施例1同樣的方法考察通過上述1.和2.分離出的12個菌株 的分類學(xué)性質(zhì)，將結(jié)果示于表2-1~表2-5。
[0261] 4.分離菌株的16S rRNA基因的堿基序列的解析
[0262] 針對YM17株利用與實施例1同樣的方法考察通過上述1.和2.分離出的12個菌株的 16S rRNA基因的堿基序列。各株的16S rRNA基因的堿基序列分別示于序列表序列號8~19。 序列號8與NaCl_20131016_04株對應(yīng)，序列號9與YM17-2株對應(yīng)，序列號10與YM17-3株對 應(yīng)，序列號11與YM17-4株對應(yīng)，序列號12與NaCl_20131016_19株對應(yīng)，序列號13與YM17-5 株對應(yīng)，序列號14與NaCl_20131016_24株對應(yīng)，序列號15與NaCl_20131016_28株對應(yīng)， 序列號16與NaCl_20131016_30株對應(yīng)，序列號17與NaCl_20131016_34株對應(yīng)，序列號 18 與 NaCl_20131016_37 株對應(yīng)，序列號 19 與 NaCl_20131016_38 株對應(yīng)。
[0263] 將YM17株的16S rRNA基因和這些12個菌株的16S rRNA基因的堿基序列的同源性 示于表6。如表6所示那樣，分離出的12個菌株的16S rRNA基因的堿基序列與YM17株的16S rRNA基因的堿基序列具有98.7 %以上的同源性。
[0264] [表6]
[0266] 5 .DNA-DNA 雜交
[0267] 使用通過上述I.和2.分離出的6個菌株和YM17株的基因組DNA進行DNA-DNA雜交試 驗。另外，作為陰性對照，使用作為近緣屬的極端嗜熱砂地菌（Ca I d i t err i co Ia satsumensis)YM081株的DNA13DNA的調(diào)整通過與〔實施例1〕的利用GC含量測定調(diào)整的方法相 同的方法進行。
[0268] 所得基因組DNA濃度均為500yg/mL以上、0D260/0D280值為1.8以上、0D260/0D230 值為2.0以上且是沒有RNA混入、能夠用于DNA-DNA雜交試驗的高品質(zhì)。
[0269] DNA-DNA雜交試驗按照參考文獻2和微生物的分類?鑒定實驗法（Springer Japan 發(fā)行)所述的方法。
[0270] 首先，進行DNA板的制作。將基因組DNA溶液用0.1 XSSC稀釋制成100yg/mL。將稀釋 后的DNA溶液在100°C下進行5分鐘加熱形成一條鏈，然后立即進行冰冷。將熱變性后的DNA 溶液用PBS-Mg溶液進行10倍稀釋制成10yg/mL。將制成10yg/mL的DNA溶液分別注入微板的 孔中各IOOyL，微板上加封，在30 °C下靜置3小時以上。之后，棄去孔內(nèi)的DNA溶液，作為試驗 用的DNA板。背景對照使用鮭魚精子DNA。
[0271]與DNA板的準備并行地進行DNA的光敏生物素標記。配制500yg/mL的DNA溶液30yL， 在超聲波清洗機中進行10分鐘處理，切斷DNA。在切斷后的DNA溶液中加入25yL的lmg/mL光 敏生物素液，使DNA完全溶解，然后邊冰冷邊在250W的低壓汞燈下照射30分鐘，對DNA進行光 敏生物素標記。為了去除剩余的光敏生物素，在照射后的D N A溶液中加入5 4 0 μ L的0.1M Tris-HCl緩沖液(ρΗ9.0)，然后加入600yL的2-丁醇并混合。以15000rpm進行5秒離心，棄去 包含過剩的光敏生物素的上清。加入2-丁醇去除過剩的光敏生物素的操作總計進行2次。將 光敏生物素標記后的DNA溶液在100°C下加熱5分鐘，然后立即進行冰冷，用于雜交。
[0272]接著，進行雜交操作。在DNA板的各孔中分別注入200yL的預(yù)雜交溶液，在37 °C下靜 置15分鐘。將熱變性后的300yL的光敏生物素標記DNA溶液與6mL的雜交溶液混合。從DNA板 的各孔去除預(yù)雜交溶液，將包含光敏生物素標記DNA的雜交溶液分別各注入IOOyL，密封DNA 板。將該DNA板在46 °C下靜置2小時以上，進行雜交處理。雜交處理后，棄去包含光敏生物素 標記DNA的雜交溶液，用300yL的I X SSC溶液清洗各孔的操作總計進行3次。
[0273]在清洗后的各孔中分別注入IOOyL的鏈霉親和素酶溶液。在37°C下靜置30分鐘，然 后棄去鏈霉親和素酶溶液。用IOOyL的I X SSC溶液清洗各孔，然后進一步用300yL的I X SSC 溶液清洗各孔總計3次。在清洗后的各孔中加入IOOyL的熒光基質(zhì)溶液，用酶標儀測定熒光 強度(激發(fā)波長360nm，測定波長450nm)。在37°C下保溫，每隔1分鐘測定熒光強度。DNA的各 組合的熒光強度從6孔的反復(fù)中算出中央值4孔的平均值，將粘附有鮭魚精子DNA的孔的平 均熒光強度值作為背景值減去從而算出。同源值用相對于將相同菌株的DNA用于孔和標記 的同源的數(shù)值的百分率來表示。
[0274]參考文獻2 : Ezaki，T ·，Hashimoto，Y ·&Yabuuchi，E ·，1989 · Fluorometr ic deoxyribonucleic acid-deoxyribonucleic acid hybridization in microdilution wells as an alternative to membrane filter hybridization in which radioisotopes are used to determine genetic relatedness among bacterial strains. International journal of systematic bacteriology.39：p224~229 [0275] 試劑
[0276] (I )PBS-Mg 溶液(MgCl2:0 · 95g/PBS100mL)
[0277] (2)0.1M Tris-HCl緩沖液(Tris:12.lg、EDTA · 2Na:0.4g、pH9.0、超純水：以總液 量成為1000 mL的方式加入）
[0278] (3)預(yù)雜交溶液（20 X SSC: lmL、50 X Denhardt液：lmL、10mg/mL變性鞋魚DNA: O. lmL、甲酰胺:5mL、超純水:2.9mL)
[0279] (4)雜交溶液（20 X SSC: lmL、50 X Denhardt液：lmL、10mg/mL變性娃魚DNA: 0 · lmL、 甲酰胺:5mL、硫酸葡聚糖:0.25g、超純水:2.8mL)
[0280] (5)鏈霉親和素酶溶液(鏈霉親和素 -β-D-半乳糖苷酶結(jié)合物：10yL、0.5%牛血清 白蛋白（級分V，fraction V)/PBS溶液：10mL)
[0281] (6)焚光基質(zhì)溶液（10mg/mL 4-甲基傘形酮-β-D-P比喃半乳糖苷（4- MethylumbeIliferyΙ-β-D-galactopyranoside)溶液：IOOyL、PBS+lmmoIMgCh溶液：10mT,)
[0282] 將DNA-DNA雜交試驗的結(jié)果示于表7。
[0283] 如表 7所示那樣，YM-17株、YM17-2 株、YM17-3 株、YM17-4 株、YM17-5 株、NaCl_ 20131016_37株和NaCl_20131016_38株的彼此的DNA-DNA同源值全部為70%以上。
[0284] 如參考文獻3所示那樣，微生物分類學(xué)中，如果DNA-DNA同源值為70%以上，則可以 認為是同種，因此，確認了這些7個株為同種。
[0285] 參考文獻3 : Stackebrandt，E · &Ebers，J ·，2006 · Taxonomi c parameters revisited：tarnished gold standards.Microbiol.Today Nov.：pl52-155
[0286] [表 7]
[0288] 6.黃白弗拉特桿菌的性質(zhì)
[0289] 根據(jù)上述的各解析、試驗，確認了黃白弗拉特桿菌為具有如下1)~10)的特征作為 性質(zhì)的種：
[0290] 1)革蘭氏染色為陰性的桿菌且形成孢子；
[0291 ] 2)氧化酶試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陽性，為需氧性；
[0292] 3)向包含1 %的糖和2%的NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)中，作為該糖加入D-半乳糖或 蔗糖時不進行酸生成，但在加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺時進行 酸生成；
[0293] 4)最適生長溫度為45°C~55°C，在35°C以下或65°C以上沒有確認到增殖；
[0294] 5)最適pH為7.0~8.0，在pH5.7以下或pHI0.0 以上沒有確認到增殖；
[0295] 6)在CYC培養(yǎng)基中添加 NaCl直至終濃度達到7 %也確認到增殖；
[0296] 7)主要的甲基萘醌類為MK7;
[0297] 8)作為細胞壁肽聚糖的氨基酸組成，包含丙氨酸、谷氨酸和內(nèi)消旋型二氨基庚二 酸(meso-DAP);
[0298] 9)基因組DNA的胞嘧啶(GC)含量為51.2%~52.4%;
[0299] 10)最主要的菌體脂肪酸為異_C16:0。
[0300] 7.黃白弗拉特桿菌種內(nèi)的亞種分類
[0301] 將 YM17 株和分離出的 12 株（NaCl-20131016-04株、YM17-2 株、YM17-3 株、YM17-4 株、NaCl_20131016_19 株、YM17-5 株、NaCl_20131016_24 株、NaCl_20131016_28 株、 NaCl-20131016-30 株、NaCl-20131016-34 株、NaCl-20131016-37 株和 NaCl - 20131016_38株)的16S rRNA基因的系統(tǒng)樹示于圖3。如圖3所示那樣，YM17株和YM17-5株的 16S rRNA基因與其他菌株分支。
[0302]另外，如表8所示那樣，YM17株和YM17-5株的主要菌體脂肪酸上位4種為異-C16:0、 反異-C17:0、反異-C15:0、異-C17:0,與此相對，YM17-2株、YM17-3株、YM17-4株、NaCl_ 20131016_37 株和 NaCl_20131016_38 株為異-C16:0、C16:0、反異-C17:0、反異-C15:0,是 不同的。因此，YM17株· YM17-5株與其他菌株在黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus f Iavoalbus)中為同種，但為不同的亞種。
[0303][表 8]
[0305] 根據(jù)以上結(jié)果，將YMl 7株和YMl 7-5株這2株命名為弗拉特桿菌亞種黃白菌 (Frateribacillus flavoalbus subsp.flavoalbus)，將NaCl_20131016_04株、YM17-2 株、丫]?17-3株、￥]\117-4株、如(：1_20131016_19株、此(：1_20131016_24株、此(：1_ 20131016_28 株、NaCl_20131016_30 株、NaCl_20131016_34 株、NaCl_20131016_37 株 和NaCl_20131016_38株這11株命名為黃白弗拉特桿菌亞種糞球菌(Frateribaci Ilus flavoalbus subsp.fimetarium)〇
[0306] 即，黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)為由弗拉特桿菌的亞種黃白 菌和黃白弗拉特桿菌亞種糞球菌這2個亞種組成的新屬/新種。
[0307] 8.黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)的蛋白質(zhì)分解活性
[0308] 接著，考察黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)的蛋白質(zhì)分解活性。 在基本培養(yǎng)基(氯化鈉:2.0 %、酵母提取物:0.1 % )中加入2.0 %的明膠或0.4 %的酪蛋白， 將pH調(diào)整為8.0,然后加入1.5%的瓊脂，在120 °C下進行20分鐘高壓釜滅菌，制成試驗培養(yǎng) 基。
[0309] 在試驗培養(yǎng)基上涂布 YM17 株、NaCl_20131016_04 株、YM17-2 株、YM17-3 株、YM17-4 株、NaCl_20131016_19 株、YM17-5 株、NaCl_20131016_24 株、NaCl_20131016_28 株、 NaCl-20131016-30 株、NaCl-20131016-34 株、NaCl-20131016-37 株或 NaCl - 20131016_38株，在55°C下培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后，在試驗培養(yǎng)基中滴加鹽酸-氯化汞溶液(氯化 萊15g、濃鹽酸20mL、蒸餾水IOOmL)，通過暈圈形成，考察蛋白質(zhì)的分解活性。試驗的結(jié)果如 下：13個菌株中全部可見明膠和酪蛋白的分解活性。
[0310] 9·黃白弗拉特桿菌(Frateribacillus flavoalbus)的堆肥環(huán)境中的生長和有機 物分解活性
[0311] 考察黃白弗拉特桿菌(FrateribaciIlus flavoalbus)的堆肥中的生長和有機物 分解活性。
[0312] 使用經(jīng)過過濾器過濾滅菌的包含10%酵母提取物溶液lmL、l%酪蛋白溶液或滅菌 水3mL、2 %NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)在55 °C下培養(yǎng)1天菌種，對進行了 2次120 °C、30分鐘的高 壓釜滅菌的IOg堆肥添加該培養(yǎng)1天后的菌的培養(yǎng)液lmL，用經(jīng)過滅菌的藥勺混合以使水分 遍布在整個堆肥中。混合物以氣相處于充分的狀態(tài)密閉容器，在55°C下進行3天培養(yǎng)（以下， 稱為堆肥培養(yǎng)）。將代替菌的培養(yǎng)液添加有經(jīng)過滅菌的包含2%NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)的 樣品作為陰性對照。作為試驗菌，使用YMl 7株、YMl 7-2株、YMl 7-3株、YMl 7-4株、YMl 7-5株、 NaCl_20131016_37 株和 NaCl_20131016_38 株。
[0313] 通過顯微鏡觀察堆肥培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)物，結(jié)果添加有YM17株、YM17-2株、YM17-3 株、YM17-4 株、YM17-5 株、NaCl_20131016_37 株或 NaCl_20131016_38 株的培養(yǎng)液的試驗 區(qū)中，全部確認到菌的良好的生長。另一方面，沒有添加菌的培養(yǎng)物的陰性對照中沒有見菌 體。圖4的A、圖4的B中示出YM17株或陰性對照的酪蛋白添加堆肥培養(yǎng)3天后的顯微鏡照片。 [0 314]如圖4的A的圓所示那樣，對于YM17株，可以確認菌體的良好的生長。另一方面，如 圖4的B所示那樣，陰性對照中，僅觀察到堆肥的固體物，未見菌體。
[0315]從堆肥培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)物中提取蛋白質(zhì)。首先，在培養(yǎng)物中加入30mL的Tris-HCl (pH8.0)形成懸浮液，在室溫下靜置3小時。將靜置后的懸浮液過濾（濾紙:ADVANTEC MFS， INC.，型號NO. 5B，11Omm)，回收濾液。為了將殘留的殘渣物用Tr i s-HCl (pH8.0)清洗，將濾液 調(diào)整為總量30mL。在30mL的濾液中加入14.2g的硫酸銨，緩慢攪拌，使硫酸銨溶解。硫酸銨溶 解后，在冰上靜置一晚。將靜置后的液體以4°C、10000g離心30分鐘，去除上清，回收沉淀物。 將沉淀物用ImL的Tris-HCl(pH8.0)溶解，將溶解物放入透析膜Spectra/Por(注冊商標）1 (制造商Spectrum Laboratories，Inc.，），MW 6000-8000)中，在Tris_HCl(pH8.0)中透析并 進行脫鹽處理。脫鹽后，用TriS-HCl(pH8.0)調(diào)整，使液量為2mL，作為酶譜的供試試樣。
[0316] 在酶譜法用的電泳凝膠中加入作為基質(zhì)的終濃度0.1%的明膠。將脫鹽后的蛋白 質(zhì)溶解液15yL和加樣緩沖液5yL混合，將20yL的混合液供試于酶譜法。
[0317] 將電泳后的凝膠放置在包含0.2%Triton(特里同）X的Tris-HCl(pH8.0)中10分 鐘，然后棄取本緩沖液，用不含TritonX的Tris-HCl (pH8.0)進行2次清洗。將清洗后的凝膠 浸漬于包含2mM的CaCl2和2mM的MgS〇4的20mL的Tris-HCl(pH8.0)中，在55°C下靜置16小時， 進行活性培養(yǎng)?；钚耘囵B(yǎng)后，棄去包含2mM的CaCl 2和2mM的MgS〇4的20mL的Tris-HCl (pH8.0)， 對凝膠進行30分鐘的考馬斯染色，考馬斯染色后進行脫色，考察蛋白質(zhì)的分解活性。
[0318] 酶譜法的結(jié)果如下:從未添加酪蛋白的堆肥培養(yǎng)中提取出的蛋白質(zhì)也顯示出明膠 分解活性，但從添加酪蛋白的堆肥培養(yǎng)中提取出的蛋白質(zhì)顯示出更強的活性。另外，未添加 菌的培養(yǎng)液的陰性對照中，無論有無添加酪蛋白，從堆肥培養(yǎng)中提取出的蛋白質(zhì)都不顯示 明膠分解活性。
[0319] 這是由于，添加菌的培養(yǎng)液時，未添加酪蛋白的堆肥培養(yǎng)的情況下，也可見蛋白質(zhì) 的分解活性，蛋白質(zhì)殘留在作為基材的堆肥中，活性被誘導(dǎo)。另外，通過添加酪蛋白進行堆 肥培養(yǎng)，更強地體現(xiàn)出活性誘導(dǎo)。
[0320] 根據(jù)以上的結(jié)果表明，YM17 株、YM17-2 株、YM17-3 株、YM17-4 株、YM17-5 株、NaCl_ 20131016_37株或NaCl_20131016_38株等黃白弗拉特桿菌（Frateribaci Ilus flavoalbus)種在堆肥中也生長，具有蛋白質(zhì)分解活性。圖5的A、圖5的B中示出明膠酶譜法 的結(jié)果。圖5的A為使用通過未添加酪蛋白堆肥培養(yǎng)提取出的蛋白質(zhì)的酶譜法的結(jié)果，圖5的 B為使用通過添加酪蛋白的堆肥培養(yǎng)提取出的蛋白質(zhì)的酶譜法的結(jié)果。
[0321] 試劑
[0322] (l)Tris-HCl(pH8.0)(Tris:6.1g、用濃鹽酸調(diào)整為ρΗ8·0、超純水：以總液量變?yōu)?1000 mL的方式加入）
[0323] (2)酶譜用電泳凝膠
[0324] 分隔層（30 % 丙烯酰胺：2000yL、1 · 5Μ Tris-HCl (ρΗ8 · 5): 1500yL、超純水：1800yL、 10 % SDS: 60yL、10 % APS: 50yL、TEMED: 5yL、1 % 明膠：600yL)
[0325] 堆積層（30%丙烯酰胺：450yL、0.5M Tris-HCl(pH6.5):750yL、超純水：1700yL、 10 % SDS：30yL ^ 10 % APS：50yL ^ TEMED：5yL)
[0326] 分隔層固化后，將堆積層重疊并使其固化。
[0327] (3) 10 X酶譜用電泳緩沖液（Tri s : 30.3g、甘氨酸：144g、超純水：以總液量變?yōu)?1000 mL的方式加入）。酶譜的電泳中，將10 X酶譜用電泳緩沖液用超純水稀釋形成I X緩沖 液，以終濃度變?yōu)?.1 %的方式加入SDS。
[0328] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0329]根據(jù)本發(fā)明得到的新型微生物作為新屬弗拉特桿菌(Frateribaci Ilus)屬的新種 對屎尿、污泥等有機廢棄物的處理等是有用的，另外，可以用于各種用途。
[0330]保藏編號
[0331][對于保藏生物材料的記載]
[0332] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0333] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0334] 電話號碼0438-20-5580
[0335] (3)保藏編號：NITE BP-01764
[0336] (4)用于識別的標識:YM17
[0337] (5)原保藏日：2013年11月29日 [0338][對于保藏生物材料的記載]
[0339] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0340] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0341] 電話號碼0438-20-5580
[0342] (3)保藏編號：NITE BP-01948
[0343] (4)用于識別的標識:YMl 7-2
[0344] (5)原保藏日：2014年10月6日
[0345] [對于保藏生物材料的記載]
[0346] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0347] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0348] 電話號碼0438-20-5580
[0349] (3)保藏編號：NITE BP-01949
[0350] (4)用于識別的標識:YM17-3
[0351] (5)原保藏日：2014年10月6日
[0352][對于保藏生物材料的記載]
[0353] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0354] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0355] 電話號碼0438-20-5580
[0356] (3)保藏編號：NITE BP-01950
[0357] (4)用于識別的標識:YM17-4
[0358] (5)原保藏日：2014年10月6日 [0359][對于保藏生物材料的記載]
[0360] (1)保藏機構(gòu)名稱:獨立行政法人制品評價技術(shù)基盤機構(gòu)專利微生物保藏中心
[0361] (2)聯(lián)系地址：〒292-0818千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8
[0362] 電話號碼0438-20-5580
[0363] (3)保藏編號：NITE BP-01925
[0364] (4)用于識別的標識:YMl 7-5
[0365] (5)原保藏日：2014年8月28日
【主權(quán)項】
1. 黃白弗拉特桿菌（Frateribacillus flavoalbus)，其為弗拉特桿菌 (Frateribacillus)屬的新種； 具有16S rRNA基因，所述16S rRNA基因由對序列號1或序列號8~序列號19中的任一者 所不的喊基序列具有98.7%以上的同源性的喊基序列構(gòu)成； 與YM17株：NITE BP-01764;YM17-2株：NITE BP-01948;YM17-3株：NITE BP-01949; YM17-4株:NITE BP-01950或YM17-5株：NITE BP-01925的DNA-DNA雜交同源值為70% 以上； 并且 具有如下1)~10)的特性： 1) 革蘭氏染色為陰性的桿菌且形成孢子； 2) 氧化酶試驗為陰性，過氧化氫酶試驗為陽性，為需氧性； 3) 在包含1 %的糖和2.0 %的NaCl的LB培養(yǎng)基(pH8.0)中，作為該糖加入D-半乳糖或蔗 糖時，不進行酸生成，但加入D-葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、甘油或N-乙酰葡糖胺時，進行酸 生成； 4) 最適生長溫度為45°C~55°C，在35°C以下或65°C以上沒有確認到增殖； 5) 最適pH為7.0~8.0，在pH5.7以下或pHI0.0 以上沒有確認到增殖； 6) 在CYC培養(yǎng)基中添加 NaCl直至終濃度達到7 %也確認到增殖； 7) 主要的甲基萘醌類為MK7; 8) 作為細胞壁肽聚糖的氨基酸組成，包含丙氨酸、谷氨酸和內(nèi)消旋型二氨基庚二酸； 9) 基因組DNA的GC含量為51.2%~52.4%; 10) 最主要的菌體脂肪酸為異-C16:0。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃白弗拉特桿菌，其中，作為菌體脂肪酸，進一步包含反異-(：15:0、(：16:0、反異-(：17 :0、異-(：17:0中的任一種以上。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃白弗拉特桿菌，其為作為菌體脂肪酸包含異-C16:0進而 包含反異-C15:0、反異-C17:0、異-C17:0的黃白弗拉特桿菌亞種黃白菌(Frateribacillus flavoalbus subsp·flavoalbus)〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃白弗拉特桿菌，其為作為菌體脂肪酸包含異-C16:0進而 包含反異-C15 : 0、C16 :0、反異-C17 :0的黃白弗拉特桿菌亞種奠球菌(Frateribacillus flavoalbus subsp.fimetarium)〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的黃白弗拉特桿菌，其用于有機廢棄物的處理。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃白弗拉特桿菌，其中，有機廢棄物為屎尿、有機性污泥、食品 殘渣物或動物糞尿。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項所述的黃白弗拉特桿菌，其為YM17株:NITE BP-01764; YM17-2株：NITE BP-01948;YM17-3株：NITE BP-01949;YM17-4株：NITE BP-01950或YM17-5 株:NITE BP-01925中的任一者。8. -種有機廢棄物的處理方法，其使用權(quán)利要求1~7中任一項所述的黃白弗拉特桿 菌。9. 一種蛋白質(zhì)的分解方法，其使用權(quán)利要求1~7中任一項所述的黃白弗拉特桿菌。10. -種堆肥的制造方法，其具備如下工序： 將利用權(quán)利要求1~7中任一項所述的黃白弗拉特桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物添加并混合到有機 廢棄物中得到第一混合物的工序； 調(diào)整所述第一混合物的水分量的工序； 將所述第一混合物作為原料進行需氧性發(fā)酵得到第一發(fā)酵產(chǎn)物的工序;和， 得到所述第一發(fā)酵產(chǎn)物的總重量中的水分率滿足基準值的物質(zhì)作為堆肥的工序。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的堆肥的制造方法，其還具備如下工序： 將所述堆肥的一部分加入到其他有機廢棄物中得到第二混合物的工序； 調(diào)整所述第二混合物的水分量的工序； 將所述第二混合物作為原料進行需氧性發(fā)酵得到第二發(fā)酵產(chǎn)物的工序;和， 得到所述第二發(fā)酵產(chǎn)物的總重量中的水分率滿足基準值的物質(zhì)作為堆肥的工序。
【文檔編號】C12N1/20GK105829522SQ201580002483
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年10月26日
【發(fā)明人】岡村好倫, 山村正, 山村正一
【申請人】株式會社山有