用于富集具有dha的破囊壺菌屬微藻的生物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于通過氧的控制添加來富集具有二十二碳六烯酸(或DHA)的破囊壺菌屬微藻，具體地是裂殖壺菌屬或紅樹林裂殖壺菌的生物質(zhì)的發(fā)酵方法。CNCM I-470220121122
【專利說明】用于富集具有DHA的破囊壺菌屬微藻的生物質(zhì)的方法
[0001]本發(fā)明涉及用于富集具有二十二碳六烯酸（DHA)的破囊壺菌屬 (Thraustochytrium)，更具體地是裂殖壺菌屬（Schizochytrium sp.)或紅樹林裂殖壺菌 (Schizochytrium mangrovei)的微藻的生物質(zhì)的新穎發(fā)酵方法，并且還涉及從這種微藻生 物質(zhì)提取的油。
[0002] 脂質(zhì)與蛋白質(zhì)和碳水化合物一起構(gòu)成了大量營(yíng)養(yǎng)元素的三個(gè)主要家族。
[0003] 在脂質(zhì)中，甘油三酸酯和磷脂尤其突出：
[0004] -甘油三酸脂(也稱為三酰甘油酯或三酸甘油酯或TAG)是這樣的甘油酯，其中甘油 的三個(gè)羥基被脂肪酸酯化。它們是植物油與動(dòng)物脂肪的主要成分。
[0005] 甘油三酸脂代表了被人類攝取的大約95%的飲食脂肪。在生物體內(nèi)，它們主要存 在于脂肪組織中并構(gòu)成能量存儲(chǔ)的主要形式。
[0006] -磷脂是兩親的脂質(zhì)，也就是說，由極性的（親水的）"頭部"和兩個(gè)脂肪族的（疏水 的）"尾部"組成的脂質(zhì)。
[0007] 磷脂是結(jié)構(gòu)性脂質(zhì)，因?yàn)樗鼈兪羌?xì)胞膜的成分，它們尤其為細(xì)胞膜提供流動(dòng)性。
[0008] 甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸組成，這些脂肪酸都是由飲食提供，并且對(duì)于它 們中的一些，是由生物合成的。
[0009] 生物化學(xué)分類(基于脂肪酸分子中包含的雙鍵數(shù)量）區(qū)分飽和脂肪酸（SFA)、單不 飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)。
[0010]從生理學(xué)角度，區(qū)分為以下內(nèi)容：
[0011]-必需脂肪酸，人體成長(zhǎng)和正常運(yùn)行所必需的，但我們身體不能夠產(chǎn)生；
[0012] 條件性"必需脂肪酸，其對(duì)于細(xì)胞正常生長(zhǎng)和生理功能是必要的，但如果通過飲 食提供的話，其可以從它們的前體中產(chǎn)生。因此，如果它們必需的前體不存在，它們是絕對(duì) 必需的；
[0013] -非必需脂肪酸。
[0014] 所有必需脂肪酸和"條件性"必需脂肪酸構(gòu)成了必需脂肪酸。
[0015] 其他脂肪酸稱為非必需脂肪酸。
[0016] 非必需脂肪酸尤其包括：
[0017] - ω 3脂肪酸家族的二十碳五烯酸(EPA)，
[0018] -油酸，我們飲食中的主要單不飽和脂肪酸，和棕櫚油酸，
[0019] -飽和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸或棕櫚酸。
[0020] 多不飽和脂肪酸
[0021] 多不飽和脂肪酸是根據(jù)第一雙鍵的位置(從最終甲基官能起始)歸類的。
[0022] 因此，在命名中對(duì)于ω "X"或"ηχ"，"X"對(duì)應(yīng)于第一不飽和的位置。
[0023]將必需脂肪酸分為兩個(gè)主要家族：ω6脂肪酸（或n-6PUFA)，其前體和主要代表是 亞油酸(LA)，以及ω 3脂肪酸(或n-3PUFA)，其前體是α-亞麻酸(ALA)。
[0024]生物學(xué)上感興趣的大部分多不飽和脂肪酸屬于ω 6家族(花生四烯酸或ARA)或ω 3 家族(二十碳五烯酸或EPA，二十二碳六烯酸或DHA)。
[0025] 此外，在命名中，構(gòu)成鏈的碳的數(shù)目也被定義:從而EPA被描述為C20: 5并且DHA被 描述為C22:6。
[0026] 因此"5"和"6"對(duì)應(yīng)于碳鏈的不飽和數(shù)目，碳鏈分別由EPA和DHA表示。
[0027] ω 3脂肪酸家族的DHA是生物可以從α-亞麻酸合成的或通過消耗富含油脂的魚(金 槍魚、鮭魚、鯡魚等)提供的一種脂肪酸。
[0028] DHA在膜的結(jié)構(gòu)中以及在腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用。
[0029] 魚油主要用作ω 3脂肪酸例如DHA和EPA的來源，但ω 3脂肪酸也發(fā)現(xiàn)于微藻油中， 其中它們是作為混合物或分開地進(jìn)行提取，如在這種情況下，例如這些油來源于某些選擇 的株系，例如裂殖壺菌屬的那些，其僅包含痕量的ΕΡΑ，但包含高DHA含量。
[0030] 飽和脂肪酸
[0031] 在飽和脂肪酸中，棕櫚酸（也稱十六烷酸或鯨蠟酸）是在動(dòng)物和植物中最常見的 C16:0飽和脂肪酸之一。
[0032] 棕櫚酸是在脂肪生成過程中產(chǎn)生的第一種脂肪酸;更長(zhǎng)的脂肪酸可以從所述棕櫚 酸產(chǎn)生。
[0033] 此外，脂肪酸被優(yōu)先用于合成ATP。其燃燒的能量平衡表示為129個(gè)ATP。因此，它構(gòu) 成了一種優(yōu)秀的能量食品。
[0034] 在工業(yè)上，棕櫚酸還被用于人造黃油和硬皂的生產(chǎn)。
[0035] 在涂料領(lǐng)域中，鑒于棕櫚酸是飽和的，它不能聚合并且一旦與大氣中的氧氣接觸 它就變得堅(jiān)硬(不像油酸、亞油酸和亞麻酸）。因此，它仍處于其軟固體形式并且(與硬脂酸） 作為聚合油粘合劑的增塑劑。因此，與硬脂酸一起，它針對(duì)隨時(shí)間推移的含油圖片材料的完 好保存提供了所需的彈性。
[0036]單不飽和脂肪酸
[0037] 作為單不飽和脂肪酸前體，棕櫚酸生成棕櫚油酸（16:1，n_7)，棕櫚油酸大量天然 存在于沙棘的果實(shí)或果肉中。
[0038] 此外，已經(jīng)描述了在食物中增加提供棕櫚油酸會(huì)具有降低血液膽固醇和降低血液 甘油三酸脂的作用，降低中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)，并且還改善血管平滑肌細(xì)胞中的代謝。
[0039] 通過微藻的脂質(zhì)，尤其是脂肪酸的生產(chǎn)
[0040] 常規(guī)地在發(fā)酵罐中培養(yǎng)裂殖壺菌屬的微藻(異養(yǎng)條件:在黑暗中并且在碳源存在 下)。
[0041]應(yīng)注意，這些微藻的有益利用一般需要控制發(fā)酵條件。
[0042]因此，為了實(shí)現(xiàn)這一結(jié)果，已經(jīng)大大發(fā)展了用于使得有可能獲得高細(xì)胞密度(HCD) 的發(fā)酵的第一方法，以便獲得脂質(zhì)的最大產(chǎn)量和生產(chǎn)率。
[0043]這些HCD培養(yǎng)的目標(biāo)是在盡可能最短的時(shí)間段內(nèi)，獲得所需脂質(zhì)的最尚可能濃度。
[0044] 然而，對(duì)于本領(lǐng)域?qū)＜叶?，很快變得清楚的是，例如，?dāng)希望使微藻產(chǎn)生大的脂 質(zhì)儲(chǔ)存時(shí)，有必要使這些微藻經(jīng)歷限制它們的生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)壓力。
[0045] 因此，在發(fā)酵方法中常規(guī)地分開了生長(zhǎng)與生產(chǎn)。
[0046] 例如，為了促進(jìn)多不飽和脂肪酸(在這種情況下是二十二碳六烯酸或DHA)的積累， 專利申請(qǐng)WO 01/54510推薦從多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)解離細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0047] 更具體地說，要求了用于生產(chǎn)微生物脂質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟，這些步驟 在于：
[0048] (a)進(jìn)行培養(yǎng)基的發(fā)酵，該培養(yǎng)基包括微生物、碳源和限制性營(yíng)養(yǎng)源，并且確保足 以維持在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中至少大約4%的飽和的溶解氧含量的條件，以便增加生物質(zhì)；
[0049] (b)然后提供足以維持在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中大約小于或等于1 %的飽和的溶解氧 含量的條件，并且提供足以允許所述微生物產(chǎn)生所述脂質(zhì)的條件;并且
[0050] (c)收集所述微生物脂質(zhì)，其中至少15%的所述微生物脂質(zhì)由多不飽和脂質(zhì)組成； [0051 ]并且其中在發(fā)酵過程中，獲得至少大約100g/l的生物質(zhì)密度。
[0052]在微藻裂殖壺菌屬(株系A(chǔ)TCC 20888)中，更具體地說在碳源和氮源存在下，但是 不限制氧的情況下進(jìn)行第一生長(zhǎng)階段，以便促進(jìn)獲得高細(xì)胞密度，然后在第二階段，停止氮 的供應(yīng)，并且逐漸減慢氧的供應(yīng)(溶解氧壓力或PO 2的管理從10%至4%，然后至0.5%)，以 便脅迫微藻，減慢其生長(zhǎng)并且觸發(fā)感興趣的脂肪酸的產(chǎn)生。
[0053] 在微藻寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)中，以低葡萄糖濃度（約5g/l)并且 因此以低生長(zhǎng)速率來獲得更高DHA含量（江（Jiang)和陳（Chen)，2000,生物化學(xué)工藝 (Process Biochem.)，35(10)，1205-1209)〇
[0054] 因此，在產(chǎn)物形成與高細(xì)胞生長(zhǎng)無關(guān)的情形中，教授控制細(xì)胞生長(zhǎng)速率是明智的。
[0055] 總的來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇通過控制發(fā)酵條件(溫度、pH)，或通過營(yíng)養(yǎng)組分至 發(fā)酵培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)的進(jìn)料(半連續(xù)條件稱為"補(bǔ)料分批"），來控制微藻的生長(zhǎng)。
[0056] 如果他們選擇在異養(yǎng)條件下通過碳源供應(yīng)來控制微藻生長(zhǎng)，那么本領(lǐng)域技術(shù)人員 一般選擇根據(jù)所產(chǎn)生的代謝物(例如，DHA型的多不飽和脂肪酸)來調(diào)整給予微藻(寇氏隱甲 藻、纖細(xì)裸藻(Euglena gracilis)等）的碳源(純葡萄糖、乙酸鹽、乙醇等）。
[0057]溫度還可以是關(guān)鍵參數(shù)。例如，已報(bào)道，在一些微藻物種中的多不飽和脂肪酸合 成，例如極微小球藻(Chlorella minutissima)的EPA合成，在低于所述微藻的最佳生長(zhǎng)所 需溫度的溫度下被促進(jìn)。
[0058]為了優(yōu)化甘油三酸酯生產(chǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員還通過作用于發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境 來優(yōu)化朝向油產(chǎn)生的碳流。
[0059] 因此，已知當(dāng)存在碳的充足供應(yīng)但是在氮缺乏的條件下時(shí)，油積累。
[0060] 因此，此處C/N比率是決定因素，并且已接受最佳結(jié)果是在葡萄糖含量不是限制因 素時(shí)通過直接作用于氮含量來獲得。
[0061]因此，為了優(yōu)化油生產(chǎn)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員至關(guān)重要的是通過移動(dòng)它朝向不利 于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的油生產(chǎn)，來控制碳流；當(dāng)將微藻放置在氮缺乏培養(yǎng)基中時(shí)，碳流被再分配并 且積累為脂質(zhì)儲(chǔ)存物質(zhì)。
[0062] 除了所有這些以外，憑借實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵條件，富含DHA和棕櫚酸的微藻生物質(zhì)的商 業(yè)制劑是可獲得的。
[0063] 然而，對(duì)于用于生產(chǎn)具有高DHA含量和控制含量的棕櫚酸和/或棕櫚油酸的品質(zhì)微 藻生物質(zhì)的替代方法仍存在未滿足的需要。
[0064] 發(fā)明概述
[0065]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)富含二十二碳六烯酸(DHA)的破囊壺菌屬的微藻的生物質(zhì)的 方法，其特征在于，在異養(yǎng)條件下的培養(yǎng)階段期間，控制氧的供應(yīng)，以便僅滿足以下需氧量： 1)細(xì)胞維持所必需的能量生產(chǎn)，2)基礎(chǔ)脂質(zhì)生產(chǎn)，以及3)除了脂肪酸的生物質(zhì)的增長(zhǎng)。
[0066] 優(yōu)選地，該方法的特征在于，通過以下等式2計(jì)算僅滿足要求1)、2)和3)所必需的
氧供應(yīng)
[0067]
[0068] 其中
[0069] q〇2目標(biāo)是按克/克的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)計(jì)的氧量；
[0070] qm是被表示為g的葡萄糖/克的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)的維持系數(shù)；
[0071 ] q趣fflgg是被表不為g的基礎(chǔ)脂質(zhì)/g的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)的基礎(chǔ)脂質(zhì)積累 率；
[0072] /2/職!是被表示為g的氧/g的脂質(zhì)的相對(duì)于脂質(zhì)形成的氧消耗系數(shù)；
[0073] μ是被表示為g的除了脂肪酸形成的生物質(zhì)/g的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)或(1Γ1) 的增長(zhǎng)速率；
[0074] y132八是被表示為g的氧/g的除了脂肪酸的生物質(zhì)的相對(duì)于除了脂肪酸的生物質(zhì)形 成的氧消耗系數(shù)。
[0075] 任選地，在該發(fā)酵方法期間，沒有限制營(yíng)養(yǎng)元素，尤其是碳源或氮源。
[0076]任選地，生長(zhǎng)階段和DHA生產(chǎn)階段是相伴的。
[0077]優(yōu)選地，這些微藻屬于裂殖壺菌屬或是紅樹林裂殖壺菌。更確切地說，這些微藻可 以是選自株系CNCM 1-4469和CNCM 1-4702的株系，其分別在2011年4月14日和2012年11月 22日存放在巴斯德研究所的法國(guó)微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心(ColIection Nationale de Cultures de Microorganismes)〇
[0078] 任選地，該方法還可以包括收獲生物質(zhì)，任選地從這種生物質(zhì)制備細(xì)胞提取物或 裂解物，然后任選地提取富含DHA的粗制油。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明所述的方法的特征可以在于獲得的生物質(zhì)包括
[0080] -按總脂肪酸的重量計(jì)至少40%的DHA;和/或 [0081 ]-按總脂肪酸的重量計(jì)至多40%的棕櫚酸;和/或 [0082]-按生物質(zhì)的干重計(jì)至少25%的脂肪酸。
[0083]發(fā)明詳細(xì)說明
[0084]在本發(fā)明背景下，
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)選擇通過提出本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)設(shè)想的那些 方案的替代性方案來探索一條用于優(yōu)化DHA生產(chǎn)的原路徑。
[0085]因此
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，悖逆本領(lǐng)域的技術(shù)先見，有可能通過發(fā)酵富含脂質(zhì)(按 生物質(zhì)的干重計(jì)多于45 % )的微藻生物質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)，其主要脂肪酸是二十二碳六烯酸 (DHA)，同時(shí)調(diào)節(jié)或控制棕櫚酸和棕櫚油酸的量：
[0086]-不需要將微藻生長(zhǎng)階段與脂質(zhì)生產(chǎn)階段分開;正相反，脂質(zhì)生產(chǎn)伴隨細(xì)胞生長(zhǎng)并 且因此是在單階段中進(jìn)行的，
[0087]-如現(xiàn)有技術(shù)所描述的，誘導(dǎo)氮限制或任何其他營(yíng)養(yǎng)元素的限制不是必需的，并且 [0088]-通過p〇2控制發(fā)酵也不是必需的。
[0089]因此
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，有可能憑借控制發(fā)酵培養(yǎng)基的氧合作用來控制生物質(zhì) 的脂質(zhì)組成，并且尤其是DHA以及棕櫚酸和棕櫚油酸的比例。
[0090]確實(shí)，
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)理解，根據(jù)以下優(yōu)先級(jí)，由微藻來使用氧：
[0091] -用于維持的能量生產(chǎn)，
[0092] - 一些稱為基礎(chǔ)脂質(zhì)的脂肪酸的生產(chǎn)，其中DHA是主要的，
[0093]-除了脂肪酸的生物質(zhì)的增長(zhǎng)，以及
[0094]-用余量氧生產(chǎn)棕櫚酸。
[0095]換言之，根據(jù)本發(fā)明所述的方法在于滿足對(duì)應(yīng)于前三點(diǎn)的需氧量，并且因此提供 最佳氧量，以獲得富含DHA的生物質(zhì)(不論它是由裂殖壺菌屬還是紅樹林裂殖壺菌產(chǎn)生的）。 [0096]接下來，如將在以下實(shí)驗(yàn)部分中證明的，可以供應(yīng)另外的氧，并且導(dǎo)致棕櫚酸的快 速過量產(chǎn)生(很好地用紅樹林裂殖壺菌說明），過量產(chǎn)生或不過量產(chǎn)生棕櫚油酸(很好地用 裂殖壺菌屬說明）。
[0097]
【申請(qǐng)人】公司基于裂殖壺菌屬株系A(chǔ)TCC 20888開始其工作。
[0098]按照現(xiàn)有技術(shù)的教授內(nèi)容，尤其是專利申請(qǐng)WO 01/54510的那些教授內(nèi)容，
【申請(qǐng)人】 公司首先發(fā)現(xiàn)，與披露的內(nèi)容相反，PO2至0%或多于10%的恒定調(diào)節(jié)持續(xù)發(fā)酵的整個(gè)持續(xù) 時(shí)間使得有可能產(chǎn)生脂肪酸中多于35%的PUFA(相對(duì)于總脂肪酸多于25%DHA)，正如同用 PO2的級(jí)聯(lián)下降（10 %，然后是4%，然后是0.5 %的飽和)進(jìn)行的管理操作的情況。
[0099] 從另一方面來說，應(yīng)用至株系CNCM 1-4702的后一種操作(根據(jù)申請(qǐng)WO 01/54510) 最終導(dǎo)致脂肪酸的產(chǎn)生，其中棕櫚酸以多于60%高度占優(yōu)，而DHA并未達(dá)到20%;這種操作 給出與通過在10%的恒定PO 2下操作，針對(duì)這種株系所獲得的那些結(jié)果相同的結(jié)果。
[0100]此外，從技術(shù)觀點(diǎn)看，當(dāng)實(shí)驗(yàn)方案從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模按比例擴(kuò)大至工業(yè)規(guī)模(換言之， 從2至201發(fā)酵罐按比例擴(kuò)大至1至200m3反應(yīng)器)時(shí)，測(cè)量p02造成了大問題。
[0101] 確實(shí)，p02是如在飽和時(shí)發(fā)酵液中溶解的相對(duì)氧濃度來限定。例如，如果水在室溫 和大氣壓下在空氣中曝氣足夠長(zhǎng)時(shí)間，就認(rèn)為p〇2等于100% (這對(duì)應(yīng)于發(fā)酵罐在t = 0時(shí)的 氧合作用狀態(tài)）。事實(shí)上，當(dāng)在發(fā)酵罐中，P〇2探頭被校準(zhǔn)時(shí)，溶解氧含量受到殘余鹽的濃度 的影響并且受發(fā)酵溫度的影響。
[0102] 此外，常規(guī)接受的是，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐，P02僅受由發(fā)酵液的高度產(chǎn)生的壓力的 影響，并且受混合效果的影響。然而，在中等容量(約Im 3)至大容量(約數(shù)百m3)的發(fā)酵罐上的 工業(yè)化期間，正相反，發(fā)酵液的高度將：
[0103] -對(duì)溶解氧壓力有影響;并且
[0104] -在"并未完美攪拌的"發(fā)酵罐中引起復(fù)雜的現(xiàn)象。
[0105] 從這個(gè)意義上來說，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上建立的P02值不能因此被外推至工業(yè)規(guī)模。
[0106] 此外，針對(duì)裂殖壺菌屬描述的專利WO 01/54510的建議看來似乎是不可推廣至破 囊壺菌屬的所有株系的。換言之，在本發(fā)明中，不存在氧供應(yīng)方面的減少，以便"脅迫"微藻， 從而使其產(chǎn)生其儲(chǔ)存脂質(zhì)（在這種情況下是DHA)，相反存在至由所述微藻用于調(diào)整其脂質(zhì) 生產(chǎn)方向表示的要求的程度的氧供應(yīng)控制，而不提及P〇2。
[0107] 此外，通過控制氧供應(yīng)來操作發(fā)酵的選擇已經(jīng)讓
【申請(qǐng)人】公司獲得非凡的結(jié)果，該 選擇的任何使用無需限制一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，或?qū)⑸L(zhǎng)階段與生產(chǎn)階段分開：
[0108] -感興趣的脂質(zhì)，尤其是DHA的總體含量的增加，以及
[0109] -氣味減少(收獲的CNCM 1-4469的生物質(zhì)的特別強(qiáng)烈的氣味的減少是明顯的）。 [0110] 微生物的選擇 待用于本發(fā)明的方法的株系屬于破囊壺菌屬，更具體地說是裂殖壺菌屬或紅樹林 裂殖壺菌。這類株系是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的。例如，可以提及的是裂殖壺菌屬株系A(chǔ)TCC 號(hào)20888,在申請(qǐng)WO 01/54510中做了描述和研究。
[0112]在其研究過程中，
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)鑒定了產(chǎn)生DHA的極感興趣的若干微藻株系。申 請(qǐng)人公司尤其對(duì)已經(jīng)鑒定的兩種株系相當(dāng)特別感興趣。
[0113] 第一種株系是裂殖壺菌屬的株系，在2011年4月14日在法國(guó)存放在巴斯德研究所 的法國(guó)微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心(CNCM)中編號(hào)I -4469下，并且還在中國(guó)存放在中國(guó)武漢 (430072)的武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE C0LLECTI0N，CCTCC)中編號(hào)M 209118下。這種株系主要產(chǎn)生DHA并且在較低程度上產(chǎn)生棕櫚 酸和棕櫚油酸。它由編碼18S RNA的基因
[0114] 的部分測(cè)序來表征（SEQ ID No 1):
[0115] 61 CTCStCaCtli CCTCGfGGAO tCCAC^TTGG GXMTXTACS CGCCfSCTGC CtTCCftCiGA 121 Τζ?ΤΟξ?Τ?δξΧ GTCTCTCftSG CTCCCTCTCC GG^GTCGAGC CCT^CTCCC CGTCACCCOT im. T^mGTCliCC Otasccca^t ^ccctaccgt CO^CA^CTGA 241 TiTCATCGCTC CGAMAGCGa TCTGCTCMT XATCATGACT C^CCM.G^GI< STTGSCTTAC 301 &CCTA?kT^M? IGCSGCCCTC CCCGAAAGTC GGGCCCSTAC ?GCACGTATT AATTCCASM 361 TTiiCTGCAGG IMOCGTAT^ AAGGAACTAC： CG^AGG?ATT ATAACTQMiA TAATG^GCCfi 421 TTOiSCACSTTT CACAfiTATA^ TTCGCTT^TA ΟΤΤ?€Α??Τ(? C^Ti?fiCTTA>3 TCTTIC3?v(m
[0116] 這使得有可能將其鑒定為裂殖壺菌屬類型的株系。在本申請(qǐng)中這種株系隨后將被 表示為 "CNCM 1-4469"。
[0117] 此外，第二種株系是紅樹林裂殖壺菌的株系。它產(chǎn)生相對(duì)相等比例的DHA和棕櫚 酸。它由
【申請(qǐng)人】公司在2012年11月22日在法國(guó)存放在巴斯德研究所的法國(guó)微生物培養(yǎng)物國(guó) 家保藏中心（CNCM)中編號(hào)1-4702下。它由編碼18S rRNA的基因的測(cè)列來表征（SEQ ID No 2)：
[0118] I GOITtT^CAT TGCTCTCATT CCGATaGCA^ AACGCATACA CCCTTCGCAT CGAI^TTTCT 61 CGtCCfACCl COtSsmGTCC AC&iStGG(5tA MtTACSCGC CtiSCXSCf AT CCttOSlvmx 121 GfSTAGCCGTC TCTCAGGCTi： CCTCTCCGGA GTCii^SCCCT A^CTCTCCGT CACC：CSTTAT ISl AfSICACCOTA <?Τ〇〇?ΑΤΑ<? Cl?vCC〇TC$A 〇ΑΑ€1(?&Ι：?β ΟΑ?λΟΟ^ΙΤΟ 241 ATCCiAGCAAi^ A?AC5T CA^TC TfSCTC^ATTA TC.AT0ATTCA CCMKTAAAM: (；Οβ〇Τ?€??Τ 301 ΟΤΛ?ΤΑΑβ?δ 〇a：GCCCCASii CASQGCTCT'I ?Cii(SCIi.'rGT& Tx^TTICCAS X^CIwCIi 36:1 GGTATCCIiTA t^CCGI\?GA^ lstTATmCTG AimtCAG CCiSttCGC^C 421 rCTCiiCAiJm CAAtCOCXTS r&CT：i'^CAC& {Χ：Μ?
[0119] 這使得有可能將其鑒定為紅樹林裂殖壺菌類型的株系。在本申請(qǐng)中這種株系隨后 將被表示為"CNCM 1-4702"。
[0120] 確定并且使用必需的氧量，特別是q02
[0121] 引入培養(yǎng)基中的總體氧流是可調(diào)節(jié)的并且本質(zhì)上取決于：
[0122] -引入的空氣的流速，
[0123]-促進(jìn)氧在培養(yǎng)基中溶解的攪拌速率。
[0124] 這種流稱為OTR(氧轉(zhuǎn)移率）。
[0125]氧由培養(yǎng)物的消耗稱為OUR(攝氧率）。
[0126] 當(dāng)生物質(zhì)在發(fā)酵罐中增長(zhǎng)時(shí)，其總體氧消耗增加，直至所有轉(zhuǎn)移的氧被吸收;然后 OUR被認(rèn)為等于OTR。
[0127] OTR和OUR是針對(duì)全部培養(yǎng)基的數(shù)據(jù)。因此，針對(duì)一個(gè)培養(yǎng)體積的OUR可以相對(duì)于占 有此體積的細(xì)胞的量。
[0128] 因此，細(xì)胞消耗稱為q02并且代表按吸收的克/克的細(xì)胞/小時(shí)計(jì)的O2量。然后針對(duì) 細(xì)胞照原樣的質(zhì)量，也就是說沒有脂肪酸的質(zhì)量，計(jì)算這種消耗，因?yàn)橹|(zhì)儲(chǔ)存在氧吸收方 面不具有積極作用。
[0129] 通過至培養(yǎng)基的控制的氧供應(yīng)，本發(fā)明的方法使得有可能影響脂質(zhì)生產(chǎn)并且根據(jù) 微藻生長(zhǎng)條件(接種量、藻齡等)將其優(yōu)化。
[0130] 總體O2消耗對(duì)應(yīng)于細(xì)胞的不同氧使用之和。
【申請(qǐng)人】公司區(qū)分了氧消耗的四個(gè)路 徑，它們對(duì)應(yīng)于細(xì)胞的基本要求，用氧供應(yīng)的程度的優(yōu)先順序依次滿足這些要求。
[0131] 按優(yōu)先順序，這些要求如下：
[0132] 1.細(xì)胞維持。
[0133] 2.基礎(chǔ)脂質(zhì)生產(chǎn)。
[0134] 3.除了脂肪酸的生物質(zhì)的形成。
[0135] 4.與代謝過量有關(guān)的脂質(zhì)積累。
[0136]
【申請(qǐng)人】公司發(fā)現(xiàn)，因此由以下公式確定q02:
[0137] 等式（1)
[0138]
1234567891011 (1)(2)(3)(4) 2
[0140]等式的項(xiàng)"qm"、"q識(shí)鵬f、W臟"、"μ" W/和"q_額"應(yīng)理解如下。 3
[0141]細(xì)胞維持。等式的項(xiàng)(1) 4 獨(dú)立于任何脂質(zhì)生產(chǎn)或生物質(zhì)增長(zhǎng)，細(xì)胞維持對(duì)應(yīng)于細(xì)胞用于其維持所需的能 量。 5 "qm"是用于產(chǎn)生這種能量的碳基底物(一般是葡萄糖）的量;它被表示為g的葡萄 糖/g的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)。在本領(lǐng)域中此項(xiàng)常規(guī)地由"維持能量"或"維持系數(shù)"表 不。 6 相關(guān)聯(lián)的需氧量是成比例的。確實(shí)，需要6分子的02(摩爾質(zhì)量:32g)來轉(zhuǎn)化一分子 的葡萄糖(摩爾質(zhì)量:180g)，因此是等式(1)中的項(xiàng) 7 基礎(chǔ)脂質(zhì)生產(chǎn)。等式的項(xiàng)(2) 8
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)觀察到，脂質(zhì)積累伴隨增長(zhǎng)并且不止是當(dāng)后者停止時(shí)才出現(xiàn)的現(xiàn) 象。脂質(zhì)積累是增長(zhǎng)的前兆，盡管只針對(duì)細(xì)胞膜形成。 9 這些基礎(chǔ)脂質(zhì)的組成隨著株系的變化而不同，并且尤其包括作為DHA生物合成前 體的棕櫚酸或棕櫚油酸，但是DHA總是主要成分，由實(shí)例2說明了其量化。 10 這些脂質(zhì)的積累率對(duì)應(yīng)于等式(1)中的稱為的流。 11 對(duì)于裂殖壺菌屬株系CNCM 1-4469和紅樹林裂殖壺菌株系CNCMI-4702,由以下實(shí) 例說明了這一積累率。
[0150]為了獲得相關(guān)聯(lián)的需氧量，這一流或積累率乘以脂質(zhì)形成的需氧量(也稱為相對(duì) 于脂質(zhì)形成的氧消耗系數(shù)），由等式(1)中的項(xiàng)?/職f表示。
[0151]因此，其次將氧供應(yīng)用于基礎(chǔ)脂質(zhì)生產(chǎn)。
[0152]除了脂肪酸的生物質(zhì)的形成。等式的項(xiàng)(3)
[0153] 總生物質(zhì)包括脂質(zhì)儲(chǔ)存。
[0154] 通過測(cè)定確定后者（由脂肪酸組成)并且將其從總生物質(zhì)中減去。
[0155] 除了脂肪酸（除了 "F.A"）的生物質(zhì)的形成對(duì)應(yīng)于富含蛋白質(zhì)并且因此是真正具活 性的生物質(zhì)的增長(zhǎng)。
[0156] 增長(zhǎng)速率用符號(hào)表示為等式（1)中的"μ"，它代表按形成的g/g的生物質(zhì)（除了 F.A)/小時(shí)或(1Γ1)計(jì)的生物質(zhì)(除了 F.A)。
[0157] 為了獲得相關(guān)聯(lián)的需氧量，這一增長(zhǎng)速率(μ)乘以形成除了 F.A的生物質(zhì)的需氧 量，由等式⑴中的項(xiàng)Wx"表示。
[0158] 因此，再次將氧供應(yīng)用于除了脂肪酸的生物質(zhì)的生產(chǎn)。
[0159] 計(jì)算除了脂肪酸的生物質(zhì)的濃度
[0160] 根據(jù)本發(fā)明的方法，因?yàn)椴淮嬖跔I(yíng)養(yǎng)的限制，所以增長(zhǎng)是連續(xù)的。然而，觀察到增 長(zhǎng)速率的減慢，這是獨(dú)立于培養(yǎng)基的耗盡的。
[0161] 除了 F.A的生物質(zhì)的濃度根據(jù)初始生物質(zhì)濃度而變化，并且根據(jù)其增長(zhǎng)速率而增 加。
[0162] 為了在每個(gè)瞬間使用計(jì)算預(yù)測(cè)生物質(zhì)濃度并且為了估計(jì)生長(zhǎng)速率值，
【申請(qǐng)人】公司 建議使用以下等式(3)。
[0163] 等式(3)
[0164]
[0165] 這一等式說明了觀察到的并且未解釋的增長(zhǎng)速率下降。
[0166] V代表增長(zhǎng)速率(以h-Ι表示），并且)(代表除了 F.A的細(xì)胞濃度（以g/Ι表示）。
[0167] 針對(duì)這兩種優(yōu)選株系，這些參數(shù)不同，并且在表1中重現(xiàn)。
[0168] 表1
[0170]這一現(xiàn)象還減少了q02,因?yàn)樵鲩L(zhǎng)速率(μ)有助于氧消耗(等式1)。
[0171]從引入并且已知的生物質(zhì)（接種物）的量和發(fā)生變化的其增長(zhǎng)速率來計(jì)算生物質(zhì) 濃度。
[0172]與代謝過量有關(guān)的脂質(zhì)積累。等式的項(xiàng)(4)
[0173]
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)確定，一旦已經(jīng)滿足上述要求并且供應(yīng)必需的氧，則僅存在后一 種流。
[0174]在等式（1)中由項(xiàng)"q_gg"x W職f表示的這一氧供應(yīng)引起葡萄糖消耗速率的增 加，葡萄糖將轉(zhuǎn)化為脂肪酸流?？梢哉{(diào)節(jié)這一另外的氧供應(yīng)，以便控制過量脂質(zhì)的產(chǎn)生。
[0175] 如在實(shí)例1中說明的，脂肪酸產(chǎn)生的這種加速引起代謝過量并且導(dǎo)致棕櫚酸的積 累（針對(duì)破囊壺菌屬），以及棕櫚酸和棕櫚油酸的積累（針對(duì)裂殖壺菌屬）。不受這一理論約 束，
【申請(qǐng)人】公司認(rèn)為這種過量與以下事實(shí)相關(guān):在代謝途徑下游的酶繼續(xù)以相同速率起作 用，而在代謝途徑開始處的酶加速了其活性。
[0176] 用來形成F. A和除了 F. A的生物質(zhì)的需〇2量的計(jì)算
[0177] O2轉(zhuǎn)化產(chǎn)率使得有可能獲知隨除了F. A的生物質(zhì)或脂質(zhì)的產(chǎn)生變化的O2消耗。
[0178] 轉(zhuǎn)化產(chǎn)率是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的參數(shù)，這些技術(shù)人員因此可以通過常規(guī)試驗(yàn)確 定它們。
[0179] 在表1I中給出這些值并且它們特異性針對(duì)這兩種優(yōu)選株系。
[0180] 表Π
[0182]獲得富含DHA的生物質(zhì)-計(jì)算目標(biāo)q02
[0183] 為了增加 DHA含量，
【申請(qǐng)人】公司確立，控制氧供應(yīng)至僅滿足前三個(gè)氧用途(維持、基 礎(chǔ)脂質(zhì)生產(chǎn)和除了 F.A的生物質(zhì)的增長(zhǎng))是適合的。可以通過確定對(duì)應(yīng)于按克/克的細(xì)胞/小 時(shí)計(jì)必需的〇2量的目標(biāo)q〇2來限定這一供應(yīng)。
[0184] 因此由等式(2)限定目標(biāo)q02,該等式僅包括等式(1)的前三個(gè)分量。
[0185] 等式 2:
[0186]
[0187] 接下來，通過使其乘以除了F. A的生物質(zhì)的濃度(可以通過針對(duì)每一瞬間的計(jì)算來 測(cè)量或預(yù)測(cè)該濃度)來將O2的細(xì)胞消耗的這一速率針對(duì)發(fā)酵罐按比例擴(kuò)大。這一速率對(duì)應(yīng) 于 OUR 〇
[0188] 鑒于條件是使得OTR對(duì)應(yīng)于0UR，因此它將是在發(fā)酵方法期間，針對(duì)每一瞬間將施 加的這一 OTR。
[0189]
【申請(qǐng)人】公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過考慮目標(biāo)氧合作用的這種控制，獲得了富含DHA的生物 質(zhì)。大于該目標(biāo)的氧合作用導(dǎo)致更多棕櫚酸和/或棕櫚油酸的產(chǎn)生，并且因此導(dǎo)致DHA的稀 釋。小于目標(biāo)氧合作用水平的氧合作用限制了產(chǎn)生的生物質(zhì)的量。
[0190]因?yàn)槟繕?biāo)q02隨著培養(yǎng)的進(jìn)展變化，所以在以下實(shí)例中參考觀察到的最大0UR。實(shí) 例1和2說明了控制氧合作用對(duì)裂殖壺菌屬株系CNCM 1-4469和對(duì)紅樹林裂殖壺菌株系CNCM 1-4702的作用，以及用于獲得比生產(chǎn)速率的方法。針對(duì)紅樹林裂殖壺菌株系CNCM 1-4702， 實(shí)例3說明了以下操作的作用，其中氧合作用的變化使得有可能改變生物質(zhì)的棕櫚酸和DHA 的比例。
[0191]在一個(gè)替代性實(shí)施例中，還可以憑經(jīng)驗(yàn)確定滿足前三個(gè)要求，即要求（1)、（2)和 (3)必需的氧供應(yīng)。如實(shí)例3中所說明的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行不同發(fā)酵方法，其中使用 一系列的0TR，并且測(cè)量脂質(zhì)和生物質(zhì)的量。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以限 定目標(biāo)OTR，該OTR使得有可能滿足前三個(gè)要求。
[0192] 根據(jù)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法使得有可能獲得富含脂肪酸的生物質(zhì)。具體地，該生 物質(zhì)包括按生物質(zhì)的干重計(jì)至少25%的脂肪酸，優(yōu)選是至少30%。針對(duì)株系1-4702,脂肪酸 含量可以取決于使用的株系并且可以達(dá)到按生物質(zhì)的干重計(jì)40%的最大值。
[0193] 此外，并且相當(dāng)有趣的是，這種富含脂質(zhì)的生物質(zhì)具有高DHA含量。具體地，根據(jù)本 發(fā)明所述的發(fā)酵方法使得有可能獲得包含相對(duì)于總脂肪酸按重量計(jì)至少40%的DHA的生物 質(zhì)。
[0194] 最終，根據(jù)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法使得有可能獲得具有減少的棕櫚酸含量的生物 質(zhì)。因此，該生物質(zhì)包括相對(duì)于總脂肪酸按重量計(jì)至多40%的DHA。棕櫚酸含量可以取決于 使用的株系，并且針對(duì)株系1-4469,棕櫚酸含量可以達(dá)到相對(duì)于總脂肪酸按重量計(jì)10%的 最大值。
[0195] 此外，本發(fā)明還考慮了以下發(fā)酵方法，其中氧供應(yīng)大于滿足前三個(gè)要求，即要求 (1)、（2)和(3)必需的氧供應(yīng)。具體地，將控制這種供應(yīng)，以便獲得DHA和棕櫚酸和/或棕櫚油 酸的希望的相對(duì)比例，同時(shí)優(yōu)化產(chǎn)生的生物質(zhì)的量。
[0196] 此外，在異養(yǎng)培養(yǎng)條件下進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法。適用于考慮的微藻而 且也適用于培養(yǎng)基的這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。微藻生長(zhǎng)必需的碳源優(yōu)選是葡萄 糖。氮源可以是酵母提取物、尿素、谷氨酸鈉、硫酸銨、經(jīng)PH調(diào)節(jié)的氨水，分開地或組合地使 用?？偟膩碇v，培養(yǎng)步驟包括預(yù)培養(yǎng)步驟(為了使株系復(fù)蘇），然后是適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)或發(fā)酵步 驟。后一步驟對(duì)應(yīng)于感興趣的脂質(zhì)，特別是DHA的產(chǎn)生步驟。
[0197] 除了生物質(zhì)，本發(fā)明還涉及制備自這種生物質(zhì)的細(xì)胞提取物或裂解物。特別地，這 種提取物或裂解物是從發(fā)酵后回收的生物質(zhì)制備的。這種提取物或裂解物富含DHA并且任 選地富含棕櫚酸和/或棕櫚油酸?？梢酝ㄟ^不同路徑(包括機(jī)械的、化學(xué)的和酶的路徑)將細(xì) 胞破裂，以提取脂質(zhì)內(nèi)容物。
[0198] 隨后，可以從細(xì)胞裂解物提取油，例如在若干連續(xù)提取中借助己烷/乙醇。隨后將 己烷部分分離，并且然后將己烷蒸發(fā)以分離粗制油。
[0199] 因此，用于生產(chǎn)感興趣的脂質(zhì)（優(yōu)選是DHA，以及任選地棕櫚酸和/或棕櫚油酸）的 方法包括根據(jù)本發(fā)明所述的發(fā)酵方法，收獲生物質(zhì)，制備細(xì)胞提取物或裂解物，并且提取粗 制油，該粗制油包括感興趣的脂質(zhì)，優(yōu)選是DHA以及任選地棕櫚酸和/或棕櫚油酸。
[0200] 實(shí)例
[0201] 實(shí)例1:用于培養(yǎng)株系CNCM 1-4469和CNCM 1-4702以及確定氧合作用過量時(shí)的比 生產(chǎn)速率的條件 [0202] 培養(yǎng)條件
[0203]實(shí)驗(yàn)方案包括在用于發(fā)酵罐的接種的錐形瓶中，以針對(duì)株系CNCM 1-4469的0.1 g 的生物質(zhì)/L，以及針對(duì)株系CNCM 1-4702的至少5g的生物質(zhì)/L，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
[0204]預(yù)培養(yǎng)
[0205]在28°C的溫度下，在500ml帶擋板的錐形瓶中，預(yù)培養(yǎng)(100ml的培養(yǎng)基)持續(xù)24h。
[0206] 通過過濾將培養(yǎng)基的所有組分在一起滅菌，并且在添加一滴Clearol FBA 3107消 泡劑后，將其引入在高壓釜中預(yù)先滅菌的錐形瓶中。
[0207] 表1II
[0209] 培養(yǎng)
[0210] 分三份將培養(yǎng)基滅菌。
[0211] 剛好在To之前，將葡萄糖與KH2PO4-起在用于添加的錐形瓶中滅菌。
[0212] 在發(fā)酵罐中，將剩余的鹽與0.05ml/l的Clearol FBA 3107-起滅菌。通過過濾將 微量元素和維生素滅菌。
[0213] To時(shí)的體積代表75%的最終體積。在To時(shí)使用氨水調(diào)節(jié)pH，然后仍用氨水調(diào)節(jié)為6。
[0214]表1V
[0216]在To時(shí)以恒定速率(待根據(jù)計(jì)算調(diào)整)開始連續(xù)供應(yīng)葡萄糖(濃度:500g/l的補(bǔ)料） 的分批補(bǔ)料，以便濃度不低于20g/l，并且在結(jié)束時(shí)濃度不低于5g/l。
[0217]在28°C的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)從65至85小時(shí)的持續(xù)時(shí)間。
[0218]將玉米浸液(CSL)或酵母提取物(YE)用作氮源是可能的，使得有可能獲得略微更 高的DHA結(jié)果。
[0219] 母液 [0220]表 V L0224J 確定比生產(chǎn)速率
[0225] 為了評(píng)估比生產(chǎn)速率，在10 %的p02下進(jìn)行第一培養(yǎng)，這意味著在培養(yǎng)基中總存在 溶解的氧。在不限制營(yíng)養(yǎng)源的情況下進(jìn)行這一培養(yǎng)。
[0226] 這種方法使得有可能證明在氧過量下，待測(cè)試的株系的特征（圖1)。
[0227] 在表VII中，給出的結(jié)果是在兩種株系CNCM 1-4469和CNCMI-4702的生物質(zhì)的培養(yǎng) 的T65時(shí)獲得的那些結(jié)果。
[0228] 表VII:生物質(zhì)和脂肪酸組成 123 F .A =脂肪酸
2 除了 DHA和棕櫚酸(尤其是棕櫚油酸）的不同脂肪酸被歸在標(biāo)題"其他脂肪酸"下， 3 以便證明對(duì)DHA和棕櫚酸的作用，但是在目標(biāo)q02的計(jì)算中，它們與DHA-起被包括在基礎(chǔ)脂 質(zhì)中。
[0232] 全局地進(jìn)行平均速率的計(jì)算。
[0233] 通過氣相色譜法(GC)來分析最終生物質(zhì)。然后獲知總生物質(zhì)濃度，每種脂肪酸的 含量和脂肪酸的總體含量。
[0234] 除了脂肪酸的生物質(zhì)（也稱為活性生物質(zhì)）是通過從總生物質(zhì)減去這些脂肪酸計(jì) 算的。
[0235] 然后用產(chǎn)生的每種脂肪酸的量除以存在的除了 F.A的生物質(zhì)的平均值并且除以時(shí) 間。獲得的結(jié)果是每單位時(shí)間每g的除了 F.A的生物質(zhì)的總體比生產(chǎn)速率。
[0236] 在下表VIII中給出了這些速率。
[0237] 表VIII:速率的計(jì)算
L〇239」 買例2:用控制的氧供應(yīng)培弄株糸CNCM 1-4469和CNCM 1-4702 [0240]使用相同的培養(yǎng)條件，但是控制氧供應(yīng)。
[0241 ]該方法在于在10 %下的培養(yǎng)期間，使用一半的觀察到的轉(zhuǎn)移值（OUR)(在此： 50mmol/l/h，參見圖 1，即25mml/l/h)(圖2)。
[0242] 此外，對(duì)于201發(fā)酵罐，不管氧合作用要求為了考慮發(fā)酵罐的適當(dāng)操作，在to時(shí)固 定約150rpm的最小攪拌，持續(xù)培養(yǎng)的前10至15小時(shí)。
[0243] 在表1X中，給出的結(jié)果是在兩種株系CNCM 1-4469和CNCMI-4702在控制的O2供應(yīng) 條件下的生物質(zhì)的培養(yǎng)的T65時(shí)獲得的那些結(jié)果。
[0244] 表1X:生物質(zhì)和脂肪酸組成
[0246] 如實(shí)例1中所示的，全局地計(jì)算平均速率。在表X中給出結(jié)果。 1 表X:速率的計(jì)算
[0249] 比較在氧過量條件下(來自表VIII的值)和在控制的氧條件下的全局比生產(chǎn)速率， 觀察到：
[0250] -氧供應(yīng)使得有可能降低棕櫚酸的生產(chǎn)速率，
[0251] -對(duì)于株系CNCM 1-4469,棕櫚酸的生產(chǎn)速率已經(jīng)降低了9倍，并且對(duì)于株系CNCM 1-4702,降低了 3倍。
[0252] 即使生物質(zhì)或DHA生產(chǎn)速率保持不變，仍獲得了這種結(jié)果。
[0253] 因此，防止了在代謝過量的背景下的脂質(zhì)生產(chǎn)。
[0254] 用這種方法評(píng)估的速率用作用于計(jì)算目標(biāo)q02的基礎(chǔ)。
[0255] 用等式1和2計(jì)算q02
[0256] 表X中的脂質(zhì)生產(chǎn)速率在此代表DHA是主要成分但是還包含少量的棕櫚酸的基礎(chǔ) 脂質(zhì)（等式1和2中的q基的恒流。
[0257] 針對(duì)代謝過量的流對(duì)應(yīng)于另外的流，在來自表VIII的速率和表X的那些速率之間。 [0258]在非脅迫培養(yǎng)條件下，qm是可忽略的;保持0.006g/g/h的值。
[0259]增長(zhǎng)速率隨著生物質(zhì)濃度增加而下降；最大增長(zhǎng)速率可以維持在4g的除了脂質(zhì)的 生物質(zhì)/K針對(duì)按5g/l接種的CNCM 1-4702)以及7g/l (針對(duì)按5g/l接種的CNCM 1-4469)。 [0260]通過將生物質(zhì)濃度考慮在內(nèi)，q02(在細(xì)胞水平下的消耗）可以按比例擴(kuò)大至OTR (對(duì)應(yīng)于在發(fā)酵罐水平下的供應(yīng)）。
[0261] 對(duì)于株系CNCM I-4469,在
[0262] EQ 2：
[0263] q〇2_=〇.〇〇6x 1·07+(0·011+0·001+0·009)χ 0·17+0·08χ 0.8 = 0.106g/g/h
[0264] 它對(duì)應(yīng)于：
[0265] 〇TR_=〇.l〇6x 7 = 0.74g的02/1 的培養(yǎng)物/小時(shí)
[0266] 或者
[0267] 0TR_=0.106x 7x 1000/32 = 23mmol的02/1 的培養(yǎng)物/h
[0268] 對(duì)于株系 CNCM 1-4702,在
[0269] EQ 2：
[0270] q〇2gtg=0.006x 1.07+(0.02+0.018+0,07)x 0.17+0.17x 0.8 = 0.218g/g/h
[0271] 它對(duì)應(yīng)于：
[0272] 〇TR_=〇.218x 4 = 0.87(g的02/l的培養(yǎng)物/小時(shí)）
[0273] 0TR_=0.218x 4x 1000/32 = 27.4mmol的02/1 的培養(yǎng)物/h
[0274] 將來自表X的數(shù)據(jù)用于這些等式使得有可能模擬培養(yǎng)并且確定要施加的0TR_。
[0275] 后者隨著增長(zhǎng)速率降低而降低，但是這部分地通過生物質(zhì)濃度增加進(jìn)行補(bǔ)償。 [0276]因此，OTRad呆持接近以上給出的0TR_，直至除了脂質(zhì)的生
[0277]物質(zhì)的增長(zhǎng)速率達(dá)到零。
[0278]實(shí)例3:使用不同OTR條件的發(fā)酵操作
[0279]在不限制營(yíng)養(yǎng)源的情況下在實(shí)例1和2中進(jìn)行的這些測(cè)試使得有可能產(chǎn)生以下模 型，借助該模型使得有可能通過考慮由等式2限定的目標(biāo)q〇2來控制脂質(zhì)生產(chǎn)（目標(biāo)q〇2等于 27.4mmol的02/1的培養(yǎng)物/h:參見實(shí)例2)。
[0280]從這一初始目標(biāo)q02，測(cè)試了變化。
[0281]在此通過在培養(yǎng)開始時(shí)的最大OTR說明了在這一目標(biāo)q02任一側(cè)上的變化程度。 [0282]在25和30之間的最大OTR值對(duì)應(yīng)于在本發(fā)明的背景內(nèi)限定的、用于控制氧供應(yīng)并 且為了考慮目標(biāo)q〇2的培養(yǎng)開始時(shí)的最佳0UR。
[0283] 表XI給出了在T65時(shí)測(cè)量的CNCM 1-4702的發(fā)酵參數(shù)。
[0284] 表XI
[0286] 因此，在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，可以觀察到，當(dāng)相對(duì)于由等式2限定的值過量供應(yīng)氧 時(shí)，觀察到DHA在過量脂質(zhì)，尤其是棕櫚酸中的稀釋。
[0287] 正相反，當(dāng)相對(duì)于由等式2限定的值氧供應(yīng)是次優(yōu)時(shí)，產(chǎn)生的DHA的量較小。
[0288] 實(shí)例4:限制和不限制氮缺乏的比較實(shí)例。
[0289] 用以下進(jìn)行測(cè)試：
[0290] -作為對(duì)照：株系CNCM 1-4702,在由專利申請(qǐng)WO 01/54510組成的現(xiàn)有技術(shù)限定的 條件下培養(yǎng)，也就是說，分開生長(zhǎng)階段與生產(chǎn)階段，在限制氮供應(yīng)的步驟期間誘導(dǎo)后者。在 此通過在培養(yǎng)的前三分之一結(jié)束時(shí)用氨水中斷PH調(diào)節(jié)來誘導(dǎo)這種限制。
[0291] 為了僅考慮在氮缺乏條件下株系CNCM 1-4702關(guān)于其脂質(zhì)產(chǎn)生的行為，不以級(jí)聯(lián) 的方式調(diào)節(jié)曝氣，而是維持在大于10 %的P〇2下。
[0292] -發(fā)酵，其中貫穿整個(gè)培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間，株系未經(jīng)歷任何營(yíng)養(yǎng)限制，并且還調(diào)節(jié)P02至 10%〇
[0293] 結(jié)果如下：
[0294] 表 XII
[0296] 在沒有營(yíng)養(yǎng)限制的情況下生物質(zhì)的脂肪酸豐度僅非常輕微地下降。與本領(lǐng)域的技 術(shù)先見相反，因此，對(duì)于誘導(dǎo)脂質(zhì)生產(chǎn)，限制氮源不是必需的。
[0297] 實(shí)例5:用株系A(chǔ)TCC 20888的比較實(shí)例。
[0298] 在專利申請(qǐng)WO 01/54510的實(shí)例4中描述了培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案。使用的株系是裂殖壺菌 屬ATCC 20888。
[0299] 按照所述申請(qǐng)的教授內(nèi)容，進(jìn)行以下兩個(gè)程序的比較：
[0300] 1.大于10%的固定調(diào)節(jié)
[0301] 2.0% 的恒定 p〇2。
[0302] 在下表XIII中給出了獲得的結(jié)果。
[0303] 表XIII
[0305] 通過按照現(xiàn)有技術(shù)的教授內(nèi)容，尤其是專利申請(qǐng)WO 01/54510的那些教授內(nèi)容，因 此發(fā)現(xiàn)，與披露的內(nèi)容相反，PO2至0%或多于10%的恒定調(diào)節(jié)持續(xù)發(fā)酵的整個(gè)持續(xù)時(shí)間使 得有可能產(chǎn)生脂肪酸中多于35%的PUFA，正與用p02的級(jí)聯(lián)下降（10%，然后是4%，然后是 0.5%的飽和)進(jìn)行的管理操作的情況相同。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于生產(chǎn)富含二十二碳六稀酸(DHA)的破囊壺菌屬(Thraustochytrium)的微藻 的生物質(zhì)的方法，其特征在于，在異養(yǎng)條件下的培養(yǎng)階段期間，控制氧的供應(yīng)，以便僅滿足 以下需氧量:1)細(xì)胞維持所必需的能量生產(chǎn)，2)基礎(chǔ)脂質(zhì)生產(chǎn)，以及3)除了脂肪酸的生物質(zhì) 的增長(zhǎng)。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過以下等式2計(jì)算僅滿足要求1)、2)和3)所 必需的氧供應(yīng)其中 q〇2目標(biāo)是按克/克的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)計(jì)的氧量； qm是被表示為g的葡萄糖/克的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)的維持系數(shù)； 是被表不為g的基礎(chǔ)脂質(zhì)/ g的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)的基礎(chǔ)脂質(zhì)積累率； 是被表示為g的氧/g的脂質(zhì)的相對(duì)于脂質(zhì)形成的氧消耗系數(shù)； μ是被表示為g的除了脂肪酸形成的生物質(zhì)/g的除了脂肪酸的生物質(zhì)/小時(shí)或(1Γ1)的增 長(zhǎng)速率； y132八是被表示為g的氧/g的除了脂肪酸的生物質(zhì)的相對(duì)于除了脂肪酸的生物質(zhì)形成的 氧消耗系數(shù)。3. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于在該發(fā)酵方法期間，不限制營(yíng)養(yǎng) 元素，尤其是碳源或氮源。4. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于生長(zhǎng)階段和DHA生產(chǎn)階段是相伴 的。5. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于這些微藻屬于裂殖壺菌屬 (Schizochytrium sp.)或是紅樹林裂殖壺菌（Schizochytrium mangrovei)。6. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于這些微藻是選自株系CNCM I-4469和CNCM 1-4702的株系，其分別在2011年4月14日和2012年11月22日存放在巴斯德研究 所的法國(guó)微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心。7. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于它還包括收獲該生物質(zhì)，任選地 從這種生物質(zhì)制備細(xì)胞提取物或裂解物，然后任選地提取富含DHA的粗制油。8. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于獲得的生物質(zhì)包括按總脂肪酸的 重量計(jì)至少40 %的DHA。9. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于獲得的生物質(zhì)包括按總脂肪酸的 重量計(jì)至多40 %的棕櫚酸。10. 如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于獲得的生物質(zhì)包括按生物質(zhì)的 干重計(jì)至少25%的脂肪酸。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK105829540SQ201480068877
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2014年12月18日
【發(fā)明人】伯納德·考利爾
【申請(qǐng)人】羅蓋特兄弟公司