MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及其制備方法和用圖
【專利摘要】一種MERS?CoV主蛋白酶小分子抑制劑，基于新型冠狀病毒MERS?CoV主蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)，本發(fā)明還提供了所述小分子抑制劑的合成方法，及其在制備用于治療和預(yù)防MERS?CoV感染的藥物中的用途。本發(fā)明的MERS?CoV主蛋白酶小分子抑制劑能夠顯著抑制MERS冠狀病毒主蛋白酶的活性，同時(shí)，對SARS、MHV等冠狀病毒主蛋白酶也有較好抑制活性，在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感染的藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明為生物制藥的技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及 其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠狀病毒（corona virus，Co V)為有膜單股正鏈RNA病毒，"Ni do viral es"目、 "Coronaviridae"科、"Coronavirinae"亞科，是目前所知最的大RNA病毒。根據(jù)血清學(xué)特性 和遺傳學(xué)差異，冠狀病毒亞科分為α、β、γ、δ4個(gè)屬，β屬再分為四個(gè)亞群(A-D)。自2012年9月 起，一種β屬C亞群新型冠狀病毒MERS_CoV(Middle East Respiratory Syndrome &31'〇1^￥；[1'118，中東呼吸綜合征），對全球公共衛(wèi)生安全造成了重大威脅。截止2015年5月25 日，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)公布數(shù)據(jù)顯示，全球累計(jì)實(shí)驗(yàn)室確診的感染MERS-CoV病例共1139 例，其中431例死亡(病死率37.8%)。而且，這種病毒已經(jīng)波及到中國，2015年5月，廣州省惠 州市出現(xiàn)首例輸入性中東呼吸綜合征確認(rèn)病例。因此針對新型冠狀病毒特效藥物的開發(fā)， 已迫在眉睫，這不僅是目前國際藥物開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，更是我國傳染病防治工作的重 要組成部分。
[0003] 針對冠狀病毒藥物研發(fā)的路程是比較緩慢的。早在非典之前，人們就開始對冠狀 病毒及其抑制劑進(jìn)行研究，有實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了 PMSF、TLCK和PefalocS等對人類冠狀病毒229E 主蛋白酶的活性有很強(qiáng)的抑制作用，因其專一性差、毒副作用大而沒有應(yīng)用于治療。非典期 間，科學(xué)家們試圖利用如針對RNA聚合酶、S蛋白、N蛋白等病毒重要組分研發(fā)抑制劑來阻斷 病毒的入侵、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，但開發(fā)新藥風(fēng)險(xiǎn)大、臨床試驗(yàn)用時(shí)長，至今仍無對應(yīng)靶點(diǎn)的特效 藥物。
[0004] 目前已對MERS-CoV的同族病毒SARS的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及增殖的過程有了相當(dāng)深入的了 解。冠狀病毒作為單股正鏈病毒，編碼約16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白介導(dǎo)自身的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程。這其 中，nsp5(即主蛋白酶)參與將冠狀病毒基因組編碼的復(fù)制酶多蛋白酶切水解為病毒基因組 復(fù)制所必需的16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的過程，因而在冠狀病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制中發(fā)揮了至關(guān)重要作 用。并且在人體內(nèi)不存在nsp5的同源蛋白，因而nsp5蛋白是一個(gè)良好的抗冠狀病毒革巴點(diǎn)。而 且，酶學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了冠狀病毒主蛋白酶的底物結(jié)合位點(diǎn)是保守的。如果能夠抑制 MERS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用，那么將會(huì)有效地抵御MERS冠狀病毒對人體的侵染。因 此，冠狀病毒主蛋白酶是抗新型冠狀病毒藥物設(shè)計(jì)的理想靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及其制備方法和用途。
[0006] 本發(fā)明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，結(jié)構(gòu)通式為如下通式⑴所示：
[0007]
I、I. I ^ J
[0008]
[0009] X為NH、0或S中任一種；
[0010] 心選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組心~以的烷基羰基或者環(huán)烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲 ?；?、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑 基幾基、啦陡基幾基、二氣甲基幾基
[0011] R2
選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Ci~〇5的烷基或者環(huán)烷基、氣原子、苯基、芐基、對甲基 tJ· 苯基、氟代苯基、氟代芐基、羥甲基
|R3選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:&~C 5 的烷基或者環(huán)烷基、氫原子、苯基、芐基、羥基、對甲基苯基、氟代苯基、氟代芐基、 * ? ·* ?
> - > · ， ，f J
[0012] R4選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Ci~〇6的烷基或者環(huán)烷基、氣原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基；
[0013] Rg選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Ci~〇5的烷基或者環(huán)烷基、氣原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基。
[0014] 進(jìn)一步地，
[0015] 辦優(yōu)選選自如下基團(tuán)構(gòu)成的鉅 、，OH
[0016] 糾尤選甲基、輕甲基或Y ! ；
[0017] X 優(yōu)選喊 NH;
[0018] R3優(yōu)選異丙基、叔丁基、芐基、苯基、羥基、對氟芐基、 ? %，、、
[0019] R4優(yōu)選環(huán)己基、異丙基、苯基、氫原子；
[0020]抱優(yōu)選異丁基。
[0021 ]所述抑制劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組：
[0023]
[0024] 本發(fā)明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0025] A、將通式（II)對應(yīng)化合物中的氨基保護(hù)基R6脫除，其中的R6選自如下基團(tuán)構(gòu)成的 組:叔丁氧羰基、三氟乙?；⑵S氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
[0026] B、在縮合劑的存在下，將步驟A的產(chǎn)物與通式（III)對應(yīng)化合物進(jìn)行縮合，得到通 式⑴，
[0027]
[0028] 其中，通式（II)和通式（III)中的辦、1?2、1?3、1]的定義都與通式（1)中的1? 1、1?2、1?3、1]定 義相同。
[0029] MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法中，還包括如下步驟:在有機(jī)溶劑中， 使通式（II)對應(yīng)化合物與酸或堿在室溫下反應(yīng)2~8小時(shí)，脫去氨基的保護(hù)基R6,抽去溶劑， 將得到的產(chǎn)物與通式（III)對應(yīng)化合物溶于非質(zhì)子性溶劑中，加入縮合試劑和有機(jī)堿，在室 溫下反應(yīng)16~24小時(shí)，得到通式（I)對應(yīng)化合物。
[0030] 所述的酸優(yōu)選三氟乙酸或者鹽酸；
[0031] 所述的堿優(yōu)選氫氧化鈉或甲醇鈉；
[0032] 所述有機(jī)溶劑優(yōu)選選自由如下成員構(gòu)成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環(huán) ；
[0033] 所述的非質(zhì)子性溶劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環(huán)、二甲 亞砜、苯；
[0034] 所述的縮合劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組:HATU、HBTU、EDCI、Η0ΒΤ;
[0035]所述的有機(jī)堿優(yōu)選自由如下成員構(gòu)成的組:LDA、三乙胺、DIEA。
[0036]本發(fā)明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑在制備用于治療或者預(yù)防冠狀病毒感 染的藥物用途。
[0037] 所述冠狀病毒為中東呼吸綜合征冠狀病毒、SARS冠狀病毒或鼠肝炎病毒中任一 種。
[0038] 本發(fā)明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑能夠顯著抑制MERS冠狀病毒主蛋白酶 的活性，同時(shí)，對SARS、MHV等冠狀病毒主蛋白酶也有較好抑制活性，在制備用于治療或者預(yù) 防冠狀病毒感染的藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0039] 附圖不一定是成比例的，其目的僅僅在于更好地解釋本發(fā)明，以便于讀者理解。
[0040] 圖1為小分子N3對MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲線；
[0041 ] 圖2為小分子Μ14對MERS-CoV Μ'的抑制活性曲線；
[0042] 圖3為小分子M18對MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲線；
[0043] 圖4為小分子Μ20對MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲線；
[0044] 圖5、圖6、圖7分別是 Μ14的1H-NMR、13C-NMR、MS 圖譜；
[0045] 圖 8、圖 9、圖 10分別是Μ18 的1H-NMR、13C-NMR、MS 圖譜；
[0046] 圖 11、圖 12、圖 13分別是M20 的1H-NMR、13C-NMR、MS 圖譜；
[0047] 附圖中的MERS-CoV Μρ?°代表MERS冠狀病毒主蛋白酶。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 以下通過附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳述：
[0049] 為了敘述上的方便，本文中使用了一些特定的術(shù)語，下面逐一對其進(jìn)行解釋。
[0050] "M14"、"M18"、"M20"是本發(fā)明特別優(yōu)選的小分子抑制劑，其結(jié)構(gòu)式分別為： LUU56J M20的結(jié)構(gòu)式
[0057]化合物N3是已有報(bào)道的對SARS主蛋白酶有較好酶活性抑制作用的化合物，其結(jié)構(gòu) 式為
[0058]
[0059] 本文中所使用的術(shù)語"MERS冠狀病毒主要蛋白水解酶"、"MERS-CoV Μρκι"、"MERS冠 狀病毒主蛋白酶"等，都是指MERS冠狀病毒的主要蛋白水解酶。
[0060] 的烷基"是指碳原子數(shù)在1到6之間的直鏈、支鏈或環(huán)烷基，包括但是不限 于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、環(huán)戊基、 正己基、異己基、環(huán)己基等。
[0061 ] "氟代芐基"包括對氟芐基、間氟芐基、鄰氟芐基等。
[0062] 在部分結(jié)構(gòu)式中，LDA代表二異丙基氨基鋰，Et代表乙基，"Bn"代表芐基，"Boc"代 表叔丁氧羰基。
[0063] "TFA"代表三氟乙酸，"THF"代表四氫呋喃，"DMF"代表N，N-二甲基甲酰胺，"DMS0" 代表二甲基亞砜，
[0064] "Et3N"代表三乙胺，"DIEA"代表N，N-二異丙基乙胺，"EDCI"代表1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，"HATU"代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲 六氟磷酸酯，"HBTU"代表0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，"Η0ΒΤ"代表1-羥基苯并三 唑。
[0065] 本發(fā)明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，結(jié)構(gòu)通式為如下通式⑴所示：
.即 '>〇 ,
[0066] 1234 2 X為ΝΗ、0或S中任一種； 3 心選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:心~以的烷基羰基或者環(huán)烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲 ?；?、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑 基幾基、啦陡基幾基、二氣甲基幾基

4 辦選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組的烷基或者環(huán)烷基、氫原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基、羥甲基、
J1r3選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:(^~ C5的烷基或者環(huán)烷基、氫原子、苯基、芐基、羥基、對甲基苯基、氟代苯基、氟代芐基、
[0071] R4選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:&~c6的烷基或者環(huán)烷基、氫原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基；
[0072]他選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:&~C5的烷基或者環(huán)烷基、氫原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基。
[0073] 本發(fā)明的某些優(yōu)選化合物符合下述通式，
[0074]
[0075] 進(jìn)一步地，
[0076] Ri優(yōu)選選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組：
[0077] 吣優(yōu)選甲基、羥甲基或
[0078] X 優(yōu)選 0 或 NH;
[0079] R3優(yōu)選異丙基、叔丁基、芐基、苯基、羥基、對氟芐基 v、
- .f、
[0080] R4優(yōu)選環(huán)己基、異丙基、苯基、氫原子；
[0081 ] R5優(yōu)選異丁基。
[0082]所述抑制劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組：
[0084]
[0085] 本發(fā)明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0086] A、將通式（II)對應(yīng)化合物中的氨基保護(hù)基R6脫除，其中的R6選自如下基團(tuán)構(gòu)成的 組:叔丁氧羰基、三氟乙酰基、芐氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
[0087] B、在縮合劑的存在下，將步驟A的產(chǎn)物與通式（III)對應(yīng)化合物進(jìn)行縮合，得到通 式⑴，
[0088]
[0089] 其中，通式（II)和通式（III)中的心辦^的定義都與通式⑴中的心上^定 義相同。
[0090] MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法中，還包括如下步驟:在有機(jī)溶劑中， 使通式（II)對應(yīng)化合物與酸或堿在室溫下反應(yīng)2~8小時(shí)，脫去氨基的保護(hù)基R6,抽去溶劑， 將得到的產(chǎn)物與通式（III)對應(yīng)化合物溶于非質(zhì)子性溶劑中，加入縮合試劑和有機(jī)堿，在室 溫下反應(yīng)16~24小時(shí)，得到通式（I)對應(yīng)化合物。
[0091] 所述的酸優(yōu)選三氟乙酸或者鹽酸；
[0092] 所述的堿優(yōu)選氫氧化鈉或甲醇鈉；
[0093] 所述有機(jī)溶劑優(yōu)選選自由如下成員構(gòu)成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環(huán)；
[0094] 所述的非質(zhì)子性溶劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環(huán)、二甲 亞砜、苯；
[0095] 所述的縮合劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組:HATU、HBTU、EDCI、Η0ΒΤ;
[0096]所述的有機(jī)堿優(yōu)選自由如下成員構(gòu)成的組:LDA、三乙胺、DIEA。
[0097] 通式（II)對應(yīng)化合物的合成可參考文獻(xiàn)：Qingping Tian，Naresh K.Nayyar, Srinivasan Babu,Lijian Chen,Junhua Tao, Steven Lee ,Anthony Tibbetts ,Terence Moran, Jason Liou,Ming Guo and Timothy P.Kennedy Tetrahedron Lett.2001,42, 6808-6809。通式（III)對應(yīng)化合物合成可參考文獻(xiàn):Dawei Ma，Weiqing Xie，Bin Zou， Qiong Lei and Duanqing Pei Tetrahedron Lett.2004,45,8103_8105〇
[0098] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施例中，將通式（II)化合物在有機(jī)溶劑中與酸室溫反應(yīng)4 ~6小時(shí);抽去溶劑，與通式（III)化合物溶于非質(zhì)子性溶劑中，加入縮合劑，然后加入有機(jī) 堿，在室溫下反應(yīng)12~24小時(shí)得到通式（I)化合物。
[0099]其中，上面所述的酸優(yōu)選為三氟乙酸或鹽酸;優(yōu)選的有機(jī)溶劑選自由下成員構(gòu)成 的組:0^12、1'冊、1^二甲基甲酰胺、01^0、苯;優(yōu)選的縮合試劑選自如下成員構(gòu)成的組 ：撤1'1]、耶1'1]40(：1、0此4;優(yōu)選的有機(jī)堿選自如下成員構(gòu)成的組:二異丙基乙基胺、三乙胺。
[0100] 本發(fā)明挑選化合物M14、M18、M20合成來對本發(fā)明的合成方法及應(yīng)用進(jìn)行說明，但 不意味著限制本發(fā)明其余化合物的應(yīng)用范圍：
[0101] 為了更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明，下面將結(jié)合附圖給本發(fā)明的具體實(shí)施例。在對這些 實(shí)施例進(jìn)行描述時(shí)，沒有對公知的實(shí)驗(yàn)方法、儀器、試劑和材料等進(jìn)行詳細(xì)的描述，以避免 喧賓奪主。
[0102] 實(shí)施例1:
[0103] 將 300m
容解在 3mL
[0104] 干燥CH2C12中，加入0.49g碳酸氫鈉，之后加入1.23g戴斯馬丁試劑，室溫下反應(yīng)8~
12小時(shí)，用硫代硫酸鈉溶液淬滅反應(yīng)，飽和食鹽水洗滌后旋干得： 。用干燥THF
? 5ml溶解后待用。將| 溶于5ml干燥THF中，-78°C冷卻攪拌，之后加入60% NaH 0.078g攪拌lh，隨即緩慢加入待用的
液，關(guān)閉制冷，反應(yīng)12h，用飽和氯 化銨淬滅反應(yīng)，旋干體系中的T H F，用E A萃取產(chǎn)物?？焖俟枘z柱層析，得到8 2 m g產(chǎn)物
將得到的產(chǎn)物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)， 抽干浴刑得到脫除Boc保護(hù)的產(chǎn)物，之后將其溶解在5ml的CH2C12中，加入158mg
[0105] 以及257uL DIEA，之后加入220mg HATU。體系于室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HC1、飽和NaHC03水溶液、飽和食鹽水洗滌，之后收集有機(jī)相，無水Na2S〇4干燥，將Na 2S〇4過濾 出去，有機(jī)相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析，得到5 0 m g產(chǎn)物Μ 1 4
[0106] 產(chǎn)物氫譜以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：
[0107] = 8.01-8.08(m，lH，NH)，7.86-7.95(m，lH，NH)，7.52-7.66(m，lH，NH)，6.77-6.88(m，lH，= CH)，6.54(d，J = 7.1Hz，lH，=CH)，5.75-5.89(m，lH，=CH)，4.89-4.98(m，lH，CH)，4.48- 4.57(m，2H，2CH),4.12-4.30(m，2H，2CH),3.01-3.18(m，2H，CH2)，2.46(s，3H，CH 3) ,2.10- 2.33(m，2H，CH2)，1.91-1.98(m，lH，CH)，1.78-1.90(m，lH，CH)，1.53-1.68(m，2H，CH2) ,1.40- 1.49(m,3H,CH2,CH),1.30(d J = 7.1Hz,3H,CH3) ,1.21(d J = 6.0Hz,6H,2CH3) ,0.91(d,J = 6.6Hz,3H,CH3),0.83(t J = 5.9Hz,9H,3CH3)〇
[0108] 13C-MlR(101MHz，DMS0-d6):Sl78.77(s)，172.11(s),172.03(s)，171.74(s)， 171.04(s),165.53(s),159.06(s),158.66(s),149.61(s),120.48(s),101.78(s),67.71 (s),57.87(s),51.86(s),49.12(s),47.73(s),41.19(s),38.00(s),35.45(s),31.25(s), 30.89(s),29.47(s),27.81(s),24.72(s),23.16(s),22.29(s),22.08(s),19.53(s),18.53 (s),18.44(s),12.29(s)〇
[0109] ESI-MS calcd for[C3iH48N608,M+H]+:633.35,Found:633.49〇
[0110] 實(shí)施例2:
[0111] 將
i 于 3ml CH2CI2 中，加入 220μ1 DIEA 和 140mg
常溫?cái)嚢?2h，硅膠柱層析得到1
[0112] 將得到的產(chǎn)物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，抽干溶劑得到 脫除Boc保護(hù)的產(chǎn)物，之后將其溶解在3ml的CH2C12中，加入192m:
[0113] 以及320ul DIEA，之后加入380mg HATU。體系于室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HC1、飽和NaHC03水溶液、飽和食鹽水洗滌，之后收集有機(jī)相，無水Na2S〇4干燥，將Na 2S〇4過濾 出去，有機(jī)相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析，得到80mg產(chǎn)物Ml
[0114] 產(chǎn)物氫譜以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：
[0115] 4 匪R(400MHz，DMS0-d6) :δ8.59((1, J = 7.5Hz，ΙΗ,ΝΗ)，8· 18-8 ·28(ι?，ΙΗ,ΝΗ)， 7.98-8.09(m，lH，NH)，7.89-7.97(m，lH，NH)，7.57(s，lH，NH)，7.13-7.46(m，4H，-Ph)，6.82- 6.93(m，1H，=CH)，6· 55(s，1H，=CH)，5.83-5.92(m，2H，=CH，CH) ,4.42-4.64(m，2H，2CH)， 4.14-4.31(m,2H,2CH),2.98-3.20(m,2H,CH2),2.47(s,3H,CH 3) ,2.22-2.36(m,lH,CH), 2.04-2.20(m,1H,CH),1.76-2.00(m,2H,CH2),1.60-1.71(m,lH,CH),1.39-1.58(m,7H, 2CH2,CH3),1.24-1.35(d,3H,CH3),0.88-0.94(m,3H,CH 3),0.78-0.85(m,9H,3CH3)〇
[0116] 13C NMR(101MHz,DMS0-d6):5178.76(s),172,02(s),171.74(s),171,04(s), 165.21(s),159.07(s),158.65(s),151.93(s),139.64(s),128.51((1,C-F),125.37(s), 120.04(s),115.78(2),115.57(2),101.78(s),71.60(s),57.86(s),51.88(s),49.12(s), 47.76(s),41.18(s),38.00(s),34.84(s),31.27(s),30.89(s),29.48(s),24.73(s),23.08 (s)，22.55(s)，21.49(s)，19.52(s)，18.54(s)，14.41(s)，12.29(s)。
[0117] ESI-MS calcd for[C36H49FN608，M+H]+:713.36，F(xiàn)ound:713.43 〇
[0118] 實(shí)施例3
[0119] 來
§于3mlCH2Cl2中，加入220yLDIEA和 140mg
常 溫?cái)嚢?2h，硅膠柱層析得到98n
[0120] 將得到的產(chǎn)物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，抽干溶劑得 到脫除Boc保護(hù)的產(chǎn)物，之后將其溶解在5ml的CH2C12中，加入192mg
[0121] 以及320yL DffiA，之后加入380mg HATU。體系于室溫下反應(yīng)12小時(shí)，依次用1M HC1、 飽和NaHC03水溶液、飽和食鹽水洗滌，之后收集有機(jī)相，無水Na2S04干燥，將Na 2S04過濾出去， 有機(jī)相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析，得到82mg產(chǎn)物M2I
[0122] 產(chǎn)物氫譜以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：
[0123] 匪R(400MHz，DMS0-d6) :δ8.58((1, J = 7.5Hz，ΙΗ,ΝΗ)，8· 17-8 ·32(ι?，ΙΗ,ΝΗ)， 8.06(d，J = 7.6Hz，lH，NH)，7.93(d，J = 8.8Hz，lH，NH)，7.58(s，lH，NH)，7.26-7.39(m，5H，- Ph),6.82-6.96(m,lH,=CH),6.55(s,lH,=CH),5.90(d ,J=15.7Hz,lH,=CH),5.61-5.70 (m,lH,CH),4.47-4.60(m,2H,2CH),4.17-4.32(m,2H,2CH),2.96-3.19(m,2H,CH2),2.47(s, 3H,CH3),2.26-2.34(m,lH,CH),2.05-2.14(m,lH,CH),1.77-1.98(m,4H,2CH 2) ,1.53-1.70 (m, 2H, CH2), 1.42-1.50(m,3H,CH2,CH),l. 31 (d,J = 7.1Hz,3H,CH3), 0.89-0.96(m,3H,CH3), 0.80-0.86(m,12H,4CH3)〇
[0124] 13C-NMR(101MHz,DMS0-d6):5178.76(s),172.01(s),171.73(s),167.43(s), 159.07(s),158.65(s),150.33(s),132.20(s),132.03(s),129.11(s),128.91(2),128.81 (2),126.61(s),126.55(s),101.78(s),67.87(s),57.85(s),51.90(s),49.12(s),47.77 (s),41.22(s),38.56(s),30.88(s),30.27(s),28.83(s),23.72(s),22.86(s),19.52(s), 19.29(s),18.54(s),18.46(s),14.33(s),12.28(s),11.25(s),10.12(s)〇
[0125] ESI-MS calcd for[C37H52N608，M+H]+:709.38，F(xiàn)ound:709.46。
[0126] 以上實(shí)施例均可由以下反應(yīng)過程進(jìn)行概括，本專利中其余化合物均可由相同或近 似過程進(jìn)行制備：
[0127]
....
[0128] 在對以上實(shí)施例彳進(jìn)行合成時(shí)，參考了如下的反應(yīng)式 U ·
,，、. 、一 (其中化合物下方的一位或二位阿拉伯?dāng)?shù)字為其編號(hào)）：
[0129
[0130」化合物2的制備：
[0131] 將lg氫氧化鈉溶于lOmL水中，加入5mL 1，4-二氧六環(huán)，在冰浴下冷卻后，加入lg化 合物1，然后加入1.83g(Boc)2〇,室溫下攪拌8~12小時(shí)，用1M鹽酸調(diào)節(jié)pH4-5,之后用乙酸乙 酯萃取，收集乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯得1.67g化合物2,產(chǎn)率 95%〇
[0132] 化合物3的制備：
[0133] 將1.67g化合物2溶于25mL DMF，加入2g無水碳酸鉀，反應(yīng)體系置于冰浴下冷卻，然 后加入lmL溴化芐，室溫?cái)嚢?~12小時(shí)，然后加入少量水，室溫?cái)嚢?0分鐘，將反應(yīng)體系過 濾，收集濾液，將體系用二氯甲烷稀釋，水洗滌，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去溶劑得2.09g化合物3，產(chǎn)率90 %。
[0134] 化合物5的制備：
[0135] 將2.044g化合物3溶于20ml二氯甲烷，然后加入5mL TFA室溫?cái)嚢?~4小時(shí)，將溶劑減 壓蒸去，油栗抽干，得到的油狀物溶于20ml二氯甲烷中，反應(yīng)體系置于冰浴中，冷卻后加入 5mL三乙胺，然后加入1.92!
1 .〇g H0BT以及1.46g EDCI，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。 將反應(yīng)體系依次用1M鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌，收集有機(jī)相，加 入無水硫酸鈉干燥，之后將硫酸鈉過濾除去，蒸去溶劑，快速硅膠柱層析得到2.64g化合物 5,產(chǎn)率90%。
[0136] 化合物7的制備：
[0137] 將0.61g化合物5溶于5mL二氯甲烷中，加入lmL TFA，室溫?cái)嚢?~4小時(shí)，減壓蒸去 溶劑，油栗抽干，得到的油狀物用5mL二氯甲烷溶解，之后加入l.lmL三乙胺以及0.25g
后加入0.21g Η0ΒΤ和0.3g EDCI，體系于室溫下攪拌過夜反應(yīng)。反應(yīng)完畢后 依次用1M的鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌，收集有機(jī)相，加入無水硫 酸鈉干燥，之后將硫酸鈉過濾除去，收集有機(jī)相蒸去溶劑，快速硅膠柱層析得〇 . 58g化合物 7,產(chǎn)率83%。
[0138] 化合物9的制備：
[0139] 將470mg化合物7溶于2ml二氯甲烷中，加入0.7mL TFA，室溫?cái)嚢?~4小時(shí)，反應(yīng)完 全之后，將溶劑減壓蒸去，油泵抽干，將得到的油狀物溶于2mL二氯甲烷中，之后依次加入 0.8mL三乙胺、0.11
).14g Η0ΒΤ以及0.2g EDCI，體系于室溫下攪拌反應(yīng)8~12小 時(shí)，反應(yīng)完全之后，依次用1M鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，收集有機(jī)相，加入無水 硫酸鈉干燥，之后將硫酸鈉過濾除去，收集有機(jī)相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析得到 〇.418化合物9，產(chǎn)率85%。
[0140] 化合物10的制備：
[0141] 將100mg化合物9溶于lmL THF中，加入9.3mg氫氧化鋰，加入2ml水，之后體系攪拌 過夜反應(yīng)，反應(yīng)完全后，加入1M鹽酸酸化，調(diào)節(jié)pH4-5，之后減壓蒸去溶劑，得到的白色固體 用水洗滌一次，收集固體，真空干燥得l〇〇mg化合物10，產(chǎn)率100%。
[0142] 小分子抑制劑對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性研究：
[0143] 一、原理與方法：
[0144] 酶的活性測定：
[0145] 用連續(xù)動(dòng)力學(xué)測定冠狀病毒主蛋白酶活性，使用熒光標(biāo)記底物MCA-AVLQSGFR-Lys (Dnp)-Lys_NH2(純度2 95%，上海吉爾生化有限公司）。用Fluoraskan Ascent焚光儀 (ThermoLabsystems，Helsinki，F(xiàn)inland)測定焚光強(qiáng)度，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為320nm 和405nm。
[0146] 酶反應(yīng)緩沖液體系為50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA。動(dòng)力學(xué)參數(shù)是在30°C測 定的。其中Vmax是最大反應(yīng)速度，[S]是底物的濃度，Km是米氏常數(shù)，利用1/V對1/[S]進(jìn)行線 性擬合即可求得VmajPKm。
[0147] Km的值是指酶促反應(yīng)速率達(dá)到一半時(shí)所對應(yīng)的底物濃度。Km反映的是酶的特性參 數(shù)，它的大小與酶濃度無關(guān)，只與酶的種類有關(guān)，會(huì)隨著體系中測定的參數(shù)變化而變化。Km 越小，酶對底物的親和力越高。
[0148] 1 /V = 1 /Vmax+Km/Vmax* 1 / [ S]
[0149] 在酶活性參數(shù)的實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)時(shí)向同一種蛋白酶體系同時(shí)分別加入不同濃度的底 物，由此計(jì)算主蛋白酶的KdPVmax，底物濃度一般選取5~8個(gè)不同的值，熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲 線用GraphPad Prism 5程序擬合。
[0150] MERS冠狀病毒主蛋白酶KjPVmax的測定：
[0151] 在酶反應(yīng)緩沖液中加入0.5μΜ (終濃度）的MERS冠狀病毒主蛋白酶，30 °C孵育lmin， 立即同時(shí)加入不同濃度的熒光標(biāo)記底物[50、40、30、20、10、5、2.5μΜ(終濃度）]，1200rpm/ min，震蕩15s，每4s記錄一次熒光讀數(shù)，總時(shí)間600s，利用熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲線用GraphPad Prism5 程序擬合。得到 Km=41 ·02±5.421yM，Vmax=42.84mol/L/s〇
[0152] 抑制劑活性的測定：
[0153] 當(dāng)初步篩選實(shí)驗(yàn)證明某種抑制劑有效后，我們即開始嚴(yán)格的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定。將 時(shí)間依賴型抑制劑的反應(yīng)過程曲線按照一階指數(shù)形式擬合，即可以得到表觀一級(jí)抑制速率 常數(shù)(k-。其中Vo是初始反應(yīng)速率，P是產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，t為時(shí)間，D是為了解決零時(shí)刻熒光 強(qiáng)度不為零而引入的位移參量。通過公式（1)可求得k〇bs。在公式(2)中，利用1/1^8對1/[1] 進(jìn)行線性擬合，即可求得KdPK3,我們用心/心表示二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)。其中[I]是抑制劑的 濃度，[S]是底物的濃度，Km是米氏常數(shù)，K3是抑制劑使酶失活的反應(yīng)速率常數(shù)，Ki是抑制劑 與酶之間非共價(jià)結(jié)合的平衡常數(shù)。
[0154] P = (vo/k〇bs) (1 -exp (-k〇bs t)) +D (1)
[0155]
[0156] 在抑制劑動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)時(shí)向同一種蛋白酶體系同時(shí)分別加入不同 濃度的抑制劑分子(同一抑制劑分子），根據(jù)酶活性的高低，底物濃度選擇20μΜ，由此計(jì)算不 可逆小分子抑制劑的Ki和Κ3的值。
[0157] 抑制劑濃度一般選取5~8個(gè)不同的值，熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲線用GraphPad Prism 5 程序擬合。
[0158] 化合物N3對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的測定：
[0159] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΜ90μ1(主蛋白酶 在終反應(yīng)體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標(biāo)記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-LyS-NH2(終 反應(yīng)體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物N3[5，3.75，2.81，2.10，1.58， 1.18，0.88，0· 66,0.50，0·37，0·28，0μΜ(終濃度）]，每個(gè)梯度 10μ1，將 90μ1 主蛋白酶溶液 30 °C孵育lmin，迅速同時(shí)加入已配制好的梯度濃度化合物Ν3溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數(shù)，總時(shí)間600s，利用熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki = 0 ·4872±0·0871μΜ，Κ3 = 0· 0151 ±0.00083s-^1(3/1 = 0.031^1^8^
[0160] 化合物M14對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的測定：
[0161] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΜ90μ1(主蛋白酶 在終反應(yīng)體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標(biāo)記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(終 反應(yīng)體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物M14[5，3.75，2.81，2.10，1.58， 1.18,0.88,0.66,0.50,0.37,0.28，0μΜ(終濃度）]，每個(gè)梯度 10μ1，將 90μ1 主蛋白酶溶液 30 °C孵育lmin，迅速同時(shí)加入已配制好的梯度濃度化合物Μ14溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數(shù)，總時(shí)間600s，利用熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki = 0 · 3050±0 ·0528μΜ，Κ3 = 0 ·0244±0· 0011s-^1(3/^ = 0.080241^8^
[0162] 化合物M18對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的測定：
[0163] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV Μρ?！?0μ1(主蛋白酶 在終反應(yīng)體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標(biāo)記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(終 反應(yīng)體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物M18 [3，2.25，1.68，1.26，0.95， 0.71，0.53,0.40,0.30,0.22,0.16，(^]?(終濃度）]，每個(gè)梯度1(^1，將9(^1主蛋白酶溶液30 °C孵育lmin，迅速同時(shí)加入已配制好的梯度濃度化合物M18溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數(shù)，總時(shí)間600s，利用熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki = 0 ·2784±0·0508μΜ，Κ3 = 0·0224±0· 0012s-^1(3/^ = 0.080541^8^
[0164] 化合物M20對MERS-CoV ]?_抑制活性的測定：
[0165] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV Μρ?！?0μ1(主蛋白酶 在終反應(yīng)體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標(biāo)記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(終 反應(yīng)體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物M20 [3，2.25，1.68，1.26，0.95， 0.71，0.53,0.40,0.30,0.22,0.16，(^]?(終濃度）]，每個(gè)梯度1(^1，將9(^1主蛋白酶溶液30 °C孵育lmin，迅速同時(shí)加入已配制好的梯度濃度化合物M20溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數(shù)，總時(shí)間600s，利用熒光強(qiáng)度對時(shí)間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki= 1 · 2087±0 · 2533μΜ, K3 = 0 · 05905±0 · 008083s-^1(3/1^ = 0.048841^8^
[0166] 二、結(jié)果與分析
[0167] M14、M18、M20對MERS-CoV Mpr。的抑制活性
[0168] 由附圖1至附圖13可以看出，M14、M18、M20對MERS-CoV Μρ?°都有顯著的抑制活性， 結(jié)合K3/Ki的值進(jìn)行比較，本專利中的優(yōu)選分子對MERS-CoV ΜΡΜ抑制活性均高于Ν3化合物。
[0169] 本文中所涉及的參考文獻(xiàn)，包括專利文件、學(xué)術(shù)論文、出版物等，均以引用的方式 將其全部內(nèi)容包括在本文中。應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常 規(guī)技術(shù)，如果在文中沒有特別說明，則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前 的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊等加以實(shí)施。本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn) 用品（包括但不限于:化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等)之中，對于那些特殊的或 者不宜獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法;未經(jīng)特別說明的，均 為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品，在本發(fā)明申請日之前，可以通過各種方式(例如購買、自行制備等)很方便 地獲得。
[0170]應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以 在形式和細(xì)節(jié)上對其做出各種改變和改進(jìn)，而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式為如下通式(I)所示：其中蝸X為NH、0或S中任一種； Ri選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Cl~C6的烷基幾基或者環(huán)烷基幾基、叔下氧幾基、苯甲酯基、 異嗯挫基幾基、巧喃基幾基、化咯基幾基、嚷吩基幾基、咪挫基幾基、化挫基幾基、嚷挫基幾 基、化晚基幾基、Ξ氣甲基幾基R2選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Cl~C5的烷基或者環(huán)烷基、氨原子、苯基、芐基、對甲基苯基、 氣代苯基、氣代芐基、徑甲基R3選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Cl~C5的烷基或者環(huán)烷基、氨原子、苯基、芐基、徑基、對甲基 苯基、氣代苯基、氣代芐基，R4選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Cl~C6的烷基或者環(huán)烷基、氨原子、苯基、芐基、對甲基苯基、 氣代苯基、氣代芐基； Rs選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:Cl~C5的烷基或者環(huán)烷基、氨原子、苯基、芐基、對甲基苯基、 氣代苯基、氣代芐基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，其特征在于： Ri優(yōu)選選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組：化優(yōu)選甲基、徑甲基或X優(yōu)選0或NH; R3優(yōu)選異丙基、叔下基、芐基、苯基、徑基、對氣芐基R4優(yōu)選環(huán)己基、異丙基、苯基、氨原子； 化優(yōu)選異下基。3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，其特征在于:所述抑制劑 優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組：4. 一種權(quán)利要求1所述MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟： A、 將通式(II)對應(yīng)化合物中的氨基保護(hù)基R6脫除，其中的R6選自如下基團(tuán)構(gòu)成的組:叔 下氧幾基、Ξ氣乙酷基、節(jié)氧幾基、贊甲氧幾基、締丙氧幾基； B、 在縮合劑的存在下，將步驟A的產(chǎn)物與通式（III)對應(yīng)化合物進(jìn)行縮合，得到通式 (I)，其中，通式（II)和通式（III)中的化、R2、R3、U的定義都與通式（I)中的化、R2、R3、U定義相 同。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟： 在有機(jī)溶劑中，使通式（II)對應(yīng)化合物與酸或堿在室溫下反應(yīng)2~8小時(shí)，脫去氨基的保護(hù) 基R6，抽去溶劑，將得到的產(chǎn)物與通式（III)對應(yīng)化合物溶于非質(zhì)子性溶劑中，加入縮合試 劑和有機(jī)堿，在室溫下反應(yīng)16~24小時(shí)，得到通式(I)對應(yīng)化合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，其特征在于： 所述的酸優(yōu)選Ξ氣乙酸或者鹽酸； 所述的堿優(yōu)選氨氧化鋼或甲醇鋼； 所述有機(jī)溶劑優(yōu)選選自由如下成員構(gòu)成的組:C出札、1^、01。、二氧六環(huán)； 所述的非質(zhì)子性溶劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組:C此〇2、1'邸、01。、二氧六環(huán)、二甲亞諷、 苯； 所述的縮合劑優(yōu)選自如下成員構(gòu)成的組:HATU、皿TU、EDCI、冊BT; 所述的有機(jī)堿優(yōu)選自由如下成員構(gòu)成的組:LDA、S乙胺、DIEA。7. 權(quán)利要求1~3中的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑在制備用于治療或者預(yù)防冠狀 病毒感染的藥物用途。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的用途，其中所述冠狀病毒 為中東呼吸綜合征冠狀病毒、SARS冠狀病毒或鼠肝炎病毒中任一種。
【文檔編號(hào)】A61K31/4025GK105837487SQ201610153875
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月17日
【發(fā)明人】饒子和, 傅晟, 楊海濤, 楊誠, 蔡巖, 王喆, 劉賀, 李爽, 徐楊
【申請人】天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院