獲自功能型蘋果的花青苷調(diào)控蛋白MsARF3及其編碼基因和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲自功能型蘋果的花青苷調(diào)控蛋白MsARF3及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自蘋果，命名為MsARF3蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花青苷含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。編碼所述MsARF3蛋白的基因(MsARF3基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)所述MsARF3蛋白的應(yīng)用，為如下(b1)或(b2)：(b1)調(diào)控植物的花青苷含量；(b2)降低植物的花青苷含量。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了MsARF3蛋白及其功能，可用于培育花青苷含量改變的轉(zhuǎn)基因植物，在植物育種中具有重大應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
獲自功能型蘋果的花青苷調(diào)控蛋白MsARF3及其編碼基因和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種獲自功能型蘋果的花青苷調(diào)控蛋白MsARF3及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] "醫(yī)食同源"是發(fā)展方向。蘋果耐貯性好，供應(yīng)周期長(zhǎng)，是世界性果品，尤其果實(shí)含 有較高比例的、人體比較容易吸收的游離多酚，具有很好的抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管 疾病及保肝等作用，營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值高，有"一天一蘋果，醫(yī)生遠(yuǎn)離我"（An apple a day keeps the doctor away!)的美譽(yù)，世界上相當(dāng)多的國(guó)家都將其列為主要消費(fèi)果品而大力 推薦。但近幾年的調(diào)研結(jié)果表明，一方面，在過(guò)去幾十年國(guó)內(nèi)外育成的1000多個(gè)蘋果品種， 80%是'金帥'等品種的雜交、實(shí)生或芽選后代，這種"近親繁殖"往往帶來(lái)品種的遺傳基礎(chǔ) 狹窄及抗逆性減退等問(wèn)題;另一方面，特色、多抗和多樣性果品成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。 [0003] 新疆野蘋果及其紅肉變型（Malus sieversii f.neidzwetzkyana)是世界栽培蘋 果的祖先種，不僅遺傳多樣性極為豐富，而且富含類黃酮等功能、保健成分，是進(jìn)行抗逆與 品質(zhì)育種的珍貴基因庫(kù)。但因農(nóng)田開墾等原因，新疆野蘋果的遺傳多樣性正遭到嚴(yán)重破壞， 瀕臨滅絕;我國(guó)是世界上最大的蘋果生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，其中2012年生產(chǎn)蘋果3950萬(wàn)噸，主要用 于鮮食，且近70 %是類黃酮含量較低的富士品種。
[0004] 因此，圍繞"新疆野蘋果資源的科學(xué)保護(hù)與持續(xù)高效利用、栽培品種遺傳基礎(chǔ)拓 展、蘋果產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)與共給側(cè)結(jié)構(gòu)改革和農(nóng)民持續(xù)增收以及人類健康水平提升"，進(jìn)行聯(lián) 合攻關(guān)與集成示范，本發(fā)明的發(fā)明人與美國(guó)康奈爾大學(xué)的教授合作，對(duì)新疆野蘋果及歐洲 森林蘋果等世界范圍內(nèi)的97份蘋果資源進(jìn)行了基因組重測(cè)序與生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了新 疆紅肉蘋果與蘋果品種雜種一代及回交一、二代分離群體，研究明確了新疆野蘋果群體遺 傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性特征、核心種質(zhì)構(gòu)建的技術(shù)參數(shù)、類黃酮含量等性狀的遺傳變異特點(diǎn) 及發(fā)育機(jī)理，提出了"功能型蘋果"的概念及"寬行高干、行間生草、給草施肥、肥田養(yǎng)根"的 現(xiàn)代果園管理理念，創(chuàng)建了常規(guī)雜交與生物技術(shù)有機(jī)結(jié)合的蘋果高效育種技術(shù)體系，創(chuàng)制 了一批新品種及優(yōu)異種質(zhì)，研發(fā)了蘋果新品種配套高效栽培技術(shù)體系。目前，已授權(quán)和申報(bào) 發(fā)明專利10余項(xiàng)，定植雜種實(shí)生苗4萬(wàn)余株，育成新品種（系）16個(gè);發(fā)表相關(guān)研究論文120 篇，其中SCI論文20余篇，這些研究成果總體處在國(guó)際同類研究的領(lǐng)先水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種獲自功能型蘋果的花青苷調(diào)控蛋白MsARF3及其編碼基 因和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自蘋果，命名為MsARF3蛋白，是如下(al)或(a2):
[0007] (al)由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且與植物花青苷含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 為了使(a)中的MsARF3蛋白便于純化和檢測(cè)，可在由序列表中序列1所示的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0010] 表1標(biāo)簽的序列
[0011]
[0012] ~上述(b)中的MSARF3蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得 至lj。上述(b)中的MsARF3蛋白的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所不的DNA序列中缺失一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端 和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0013] 編碼所述MsARF3蛋白的基因(MsARF3基因）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]所述基因?yàn)槿缦拢?)或(2)或(3):
[0015] ⑴編碼區(qū)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物花青苷含量相關(guān)的蛋白 質(zhì)的DNA分子；
[0017] (3)與（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與植物花青苷含量相關(guān)的蛋 白質(zhì)的DNA分子。
[0018] 上述嚴(yán)格條件可為用0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA雜 交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。
[0019] 含有所述MSARF3基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織或 重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有MSARF3基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載 體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用MsARF3基因構(gòu)建重組表達(dá)載 體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用;此外，使用MsARF3基因構(gòu)建重組表達(dá) 載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始 密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正 確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成 的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物 進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化 的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基 因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表 達(dá)載體的出發(fā)載體可為pRI 101載體。所述重組表達(dá)載體具體可為在pRI 101載體的Sail和 Xmal酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒pRI 101- MsARF3〇
[0021] 所述植物組織具體可為植物愈傷組織，更具體可為植物幼葉愈傷組織。所述植物 可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇科植物具 體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號(hào)'。
[0022] 本發(fā)明還保護(hù)所述MsARF3蛋白的應(yīng)用，為如下(bl)或(b2):
[0023] (bl)調(diào)控植物的花青苷含量；
[0024] (b2)降低植物的花青苷含量。
[0025]所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。 所述薔薇科植物具體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫 紅1號(hào)'。
[0026]本發(fā)明還保護(hù)所述MsARF3基因在培育花青苷含量降低的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所 述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇科 植物具體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號(hào)'。 [0027]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將所述MsARF3基因?qū)?入出發(fā)植物，得到花青苷含量低于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述出發(fā)植物可為單子葉 植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇科植物具體可為蘋果 屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號(hào)'。所述MsARF3基因具體 可通過(guò)以上任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物。所述方法中，具體可將所述MsARF3 基因?qū)氤霭l(fā)植物的愈傷組織，然后將愈傷組織培育為植株。所述愈傷組織具體可為幼葉 愈傷組織。攜帶有所述MsARF3基因的重組表達(dá)載體可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、 直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。 [0028]本發(fā)明還保護(hù)一種獲得轉(zhuǎn)基因植物組織的方法，包括如下步驟:將所述MsARF3基 因?qū)氤霭l(fā)植物組織，得到花青苷含量低于所述出發(fā)植物組織的轉(zhuǎn)基因植物組織。所述出 發(fā)植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為薔薇科植物。所述薔薇科 植物具體可為蘋果屬植物。所述蘋果屬植物具體可為蘋果，更具體可為蘋果'紫紅1號(hào)'。所 述MsARF3基因具體可通過(guò)以上任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物組織。所述植物組 織具體可為植物愈傷組織。所述愈傷組織具體可為幼葉愈傷組織。
[0029] 本發(fā)明還保護(hù)所述MsARF3蛋白或所述所述MsARF3基因或以上任一所述方法在植 物育種中的應(yīng)用。所述植物育種的目的為培育花青苷含量降低的植物。
[0030] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了MSARF3蛋白及其功能，可用于培育花青苷含量改變的轉(zhuǎn)基因植物， 在植物育種中具有重大應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1為表型鑒定的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0033] pRIlOl 載體（又稱"pRIHU-AN DNA"）：Takala 公司，Code No.3262。農(nóng)桿菌 LBA4404:Tiangen公司，產(chǎn)品目錄號(hào):CC2901。蘋果'紫紅1號(hào)'（又稱'紫紅1號(hào)'紅肉蘋果）：參 考文獻(xiàn):《'紫紅1號(hào)'紅肉蘋果果肉抗氧化性及花色苷分析》。
[0034] 制備幼葉愈傷組織的方法具體參見文獻(xiàn)：Ji X H，Zhang R，Wang N，Yang L&Chen X S.Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus(Malus sieversii f.niedzwetzkyana).Plant Cell Tiss Organ Cult，2015，123:389-404·。鹽酸甲醇溶液的制備方法:97·2ml甲醇中加入2·8ml濃鹽 酸。0.025M KC1緩沖液(pH = 1.0)的制備方法：1.86g KC1用980ml蒸餾水溶解，用濃鹽酸調(diào) pH到1.0，轉(zhuǎn)入1L容量瓶中，用蒸餾水定容。0.4M NaAc緩沖液(pH = 4.5)的制備方法：稱 54.43g NaAC用960ml蒸餾水溶解，用濃鹽酸調(diào)pH到4.5，轉(zhuǎn)移到1L容量瓶，用蒸餾水定容。
[0035] 實(shí)施例l、MsARF3蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)
[0036] 從'紅脆1號(hào)'蘋果中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新蛋白，如序列表的序列1所示，將其命名為 MsARF3蛋白。將編碼MsARF3蛋白的基因命名為MsARF3基因，其開放閱讀框如序列表的序列2 所示。
[0037] GENBANK中與序列1同源性最高的蛋白如序列表的序列3所示。將序列表的序列3所 示的蛋白質(zhì)命名為對(duì)照蛋白，其編碼基因命名為對(duì)照基因，如序列表的序列4所示(本實(shí)施 例的序列4中，r取g，y取t，k取g，s取g)。
[0038] 實(shí)施例2、MsARF3蛋白的功能鑒定 [0039] 一、構(gòu)建重組質(zhì)粒
[0040] 1、構(gòu)建重組質(zhì)粒 pRI101-MsARF3
[0041] (1)人工合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0042] (2)以步驟（1)得到的DNA分子為模板，采用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0043] F1:5 '-GCGTCGACATGGCGGGTCTAATTGATCT-3'；
[0044] Rl:5 '-CCCCCGGGTCATGCAGCAAAGAGGTTG-3'。
[0045] (3)用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xmal雙酶切步驟(2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn) 物。
[0046] (4)用限制性內(nèi)切酶Sail和Xmal雙酶切pRIlOl載體，回收約10000bp的載體骨架。 [0047] (5)將步驟（3)的酶切產(chǎn)物與步驟（4)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pRI 101 - MsARF3。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pRI101-MsARF3進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pRIlOl載體的 Sa 11和Xma頂每切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
[0048] 2、構(gòu)建對(duì)照質(zhì)粒
[0049] 將人工合成的序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子插入pRIlOl載體的Sail和Xmal 酶切位點(diǎn)之間，得到對(duì)照質(zhì)粒。
[0050] 二、轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織的獲得
[0051 ] 1、將重組質(zhì)粒pRI101-MsARF3導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404,得到重組農(nóng)桿菌。
[0052] 2、將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌接種至30ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的 YEP液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)至0D6QQnm = 0.6，12000rpm離心收集菌體，用30mlddH20懸浮， 加入乙酰丁香酮并使其濃度為1〇〇μΜ，得到侵染液。
[0053] 3、取蘋果'紫紅1號(hào)'的幼葉愈傷組織，浸沒到步驟2得到的侵染液中，室溫振蕩 30min〇
[0054] 4、完成步驟3后，取愈傷組織，置于含lmg/L 6-BA和0.3mg/L NAA的MS固體培養(yǎng)基 上，28°C暗培養(yǎng)2天，然后置于含lmg/L 6_BA、0 · 3mg/L NAA、50mg/L卡那霉素和50mg/L利福 平的MS固體培養(yǎng)基上光暗交替（16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)30天。
[0055] 5、完成步驟4后，取愈傷組織，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí) 熒光定量PCR，檢測(cè)MsARF3基因表達(dá)水平。將處于同一時(shí)期的蘋果'紫紅1號(hào)'幼葉愈傷組織 作為步驟4得到的愈傷組織的對(duì)照。
[0056] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用iCycler iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀器(Bio-Rad，美國(guó)）。實(shí)時(shí)熒光 定量PCR的反應(yīng)體系為20.0yL，含有l(wèi)O.OyL Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix(Fementas)，1.0yL cDNA模板(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋4倍），7yL ddH2〇,上下游引物各 lyL(引物濃度5μπι〇1 · Γ1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性3min，循環(huán)參數(shù)為 95 °C變性30s，55-60 °C退火30s，72 °C延伸30s，運(yùn)行40個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5min。以蘋果 MdAct in基因作為內(nèi)參，qPCR的數(shù)據(jù)分析采用2_Λ Λετ方法。
[0057] 用于鑒定MsARF3基因的引物如下：
[0058] F:5 '-GCCATAACCAAGAGGACCAT-3 '；R:5 '-GCTGCCACTAATTGTTGATTGA-3 '。
[0059] 用于鑒定MdActin基因的引物如下：
[0060] F:5 '-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3 '；R:5 '-TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3 '。 [00611結(jié)果表明，步驟4得到的愈傷組織中MsARF3基因的表達(dá)量是'紫紅1號(hào)'愈傷組織的 15倍左右，即步驟4得到了轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織。
[0062] 6、完成步驟4后，取轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織，置于含lmg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、 50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。
[0063]三、對(duì)照組織的獲得
[0064] 將對(duì)照質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒pRI 101-MsARF3進(jìn)行步驟二，得到轉(zhuǎn)對(duì)照基因愈傷組織。
[0065] 將pRIlOl載體代替重組質(zhì)粒pRI101-MsARF3進(jìn)行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體愈傷組織。
[0066]四、表型鑒定
[0067]觀察各個(gè)愈傷組織(步驟二的6中培養(yǎng)30天后的轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織、步驟三的 6中培養(yǎng)30天后的轉(zhuǎn)對(duì)照基因愈傷組織、步驟三的6中培養(yǎng)30天后的轉(zhuǎn)空載體愈傷組織和處 于同一時(shí)期的蘋果'紫紅1號(hào)'幼葉愈傷組織（用WT表示）的表型。部分照片見圖1。蘋果'紫紅 1號(hào)'的愈傷組織顯示為深紫色，表明其中花青苷含量較高。轉(zhuǎn)MsMYBlll基因愈傷組織顯示 為淺黃色，表明其花青苷含量相對(duì)'紫紅1號(hào)'大大降低。轉(zhuǎn)空載體愈傷組織與'紫紅1號(hào)'的 愈傷組織顏色基本一致。轉(zhuǎn)對(duì)照基因愈傷組織顯示為黃紫相間的顏色，其中花青苷含量高 于轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織且低于'紫紅1號(hào)'的愈傷組織。
[0068] 五、含量鑒定
[0069]待測(cè)愈傷組織分別為:步驟二的6中培養(yǎng)30天后的轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織、步驟三 的6中培養(yǎng)30天后的轉(zhuǎn)對(duì)照基因愈傷組織、步驟三的6中培養(yǎng)30天后的轉(zhuǎn)空載體愈傷組織和 處于同一時(shí)期的蘋果'紫紅1號(hào)'幼葉愈傷組織（用WT表示）。
[0070] 具體步驟如下：
[0071] 1、稱取0.5g待測(cè)愈傷組織，加入液氮并研磨成粉末，然后加入5ml 4°C預(yù)冷的鹽酸 甲醇溶液，然后4 °C避光靜置浸提24h，然后8000r/min離心1 Omin，收集上清液。
[0072] 2、取lml步驟1得到的上清液，加入4ml 0.025M KC1緩沖液(pH=1.0)并混勻，然后 4 °C避光靜置浸提15min，然后8000r/min離心1 Omin，收集上清液。
[0073] 3、取lml步驟1得到的上清液，加入4ml 0.4M NaAc緩沖液(pH=4.5)并混勻，然后4 °C避光靜置浸提15min，然后8000r/min離心1 Omin，收集上清液。
[0074] 4、分別取步驟2得到的上清液和步驟3得到的上清液，測(cè)定510nm和700nm下的吸光 值。
[0075] 花青苷含量(mg/g) = ΛΑX 5 X 0 · 005 X 1000 X 449 · 2/(26900 X 0 · 5);
[0076] ΔΑ= (A510nm-A700niii)(pH=1.0)-(A510n]ii-A700nm)(PH=4.5) 〇
[0077] 花青苷含量單位"mg/g"中的"g"指的是愈傷組織的鮮重。
[0078] 進(jìn)行五次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)中每個(gè)待測(cè)愈傷組織各取10份，結(jié)果取平均值。 [0079]結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)MsARF3基因愈傷組織的花青苷含量顯著低于轉(zhuǎn)對(duì)照基因愈傷組織、 轉(zhuǎn)空載體愈傷組織以及處于同一時(shí)期的蘋果'紫紅1號(hào)'幼葉愈傷組織。結(jié)果表明，MsARF3蛋 白可以降低植物的花青苷含量。
[0080] 表2各個(gè)待測(cè)愈傷組織中的花青苷含量
[0081]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白質(zhì)，是如下(al)或(a2): (al)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且 與植物花青苷含量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦拢?)或(2)或(3): (1) 編碼區(qū)序列表中序列2所示的DNA分子； (2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物花青苷含量相關(guān)的蛋白質(zhì)的 DNA分子； (3) 與（1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與植物花青苷含量相關(guān)的蛋白質(zhì) 的DNA分子。4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組 織或重組菌。5. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(bl)或(b2): (bl)調(diào)控植物的花青苷含量； (b2)降低植物的花青苷含量。6. 權(quán)利要求2或3所述基因在培育花青苷含量降低的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。7. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)氤霭l(fā)植 物，得到花青苷含量低于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物。8. -種培育轉(zhuǎn)基因植物組織的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)氤?發(fā)植物組織，得到花青苷含量低于所述出發(fā)植物組織的轉(zhuǎn)基因植物組織。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物組織為植物愈傷組織。10. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)，或，權(quán)利要求2或3所述基因，或，權(quán)利要求7或8或9所述方 法，在植物育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK105837669SQ201610293358
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月5日
【發(fā)明人】王意程, 陳學(xué)森, 王楠, 姜生輝, 許海峰, 毛志泉, 姜遠(yuǎn)茂
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)