D型人m1叉頭蛋白異構(gòu)體及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的D型人M1叉頭蛋白異構(gòu)體——FOXM1D，編碼FOXM1D的多核苷酸序列以及FOXM1D蛋白序列。本發(fā)明還公開了FOXM1D的多核苷酸和蛋白的用途，包括FOXM1D具有誘導(dǎo)腫瘤出現(xiàn)上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲的功能，故FOXM1D可用于臨床診斷標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)。
【專利說明】
D型人M1叉頭蛋白異構(gòu)體及其編碼基因
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種D型人Ml叉頭蛋白異構(gòu)體蛋白 (Forkhead box protein M1D，F(xiàn)0XM1D)及其編碼的多核苷酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，惡性腫瘤仍是危害人類健康的全球衛(wèi)生問題之一。在我國，隨著人口老齡化 進(jìn)程、工業(yè)化、不良生活方式及環(huán)境污染等原因，惡性腫瘤病人每年呈遞增趨勢。腫瘤轉(zhuǎn)移 是患者死亡的關(guān)鍵原因，是決定治療和預(yù)后的重要指標(biāo)。外科手術(shù)及輔助治療能夠治愈界 限清晰的原位腫瘤，而腫瘤轉(zhuǎn)移灶由于其特殊的系統(tǒng)特征導(dǎo)致絕大多數(shù)不可治愈 (Valastyan and Weinberg,2011)。因此，大于90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的(Gupta and ]\&88&8116,2006;3七668,2006;\^1&8七5^11&11(1?6；[油6坪，2011)。此外，臨床上60%以上的惡 性腫瘤患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)轉(zhuǎn)移?；诖耍瑢τ趷盒阅[瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制闡明將為治療惡性腫瘤 提供重要的理論基礎(chǔ)。
[0003] 腫瘤轉(zhuǎn)移分為如下幾步復(fù)雜的過程:原發(fā)腫瘤發(fā)展為侵襲性腫瘤，腫瘤細(xì)胞侵襲 床頭基底膜，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴系統(tǒng)及血液循環(huán)系統(tǒng)，在循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到靶 器官，腫瘤細(xì)胞穿出血管形成微小轉(zhuǎn)移灶，腫瘤血管新生及在繼發(fā)灶定居生長等這幾個階 段。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT，epi the lial-mesenchymal transit ion)是在協(xié)助腫瘤轉(zhuǎn)移中至關(guān) 重要的細(xì)胞學(xué)事件，這種細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換允許腫瘤細(xì)胞擺脫細(xì)胞與細(xì)胞間連接而更具有侵襲 性。EMT的發(fā)生是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，涉及到多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和復(fù)雜的分子機(jī)制，而其 具體調(diào)控機(jī)制并未完全闡明。
[0004] Ml叉頭蛋白（F0XM1，F(xiàn)orkhead box protein Ml)屬于一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族， 因其包含共有的叉頭DNA結(jié)合域而得名（Halasi and Gartel，2013;Katoh et al. ,2013; Wierstra，2013a;Wierstra，2013b)。目前，F(xiàn)0XM1 已有三種可變剪切體，即F0XM1A，F(xiàn)0XM1B和 FOXMIGFOXMIB及F0XM1C作為轉(zhuǎn)錄活性分子，而F0XM1A則作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。
[0005] 此外，Kim YH報道了一個新的F0XM1轉(zhuǎn)錄本--F0XM1 Δ C，在多種腫瘤細(xì)胞中存在 (Kim et al.，2013)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0XM1在幾乎所有腫瘤中均異常表達(dá)。通過控制一系列在細(xì) 胞周期進(jìn)程相關(guān)基因，F(xiàn)0XM1作為誘導(dǎo)有絲分裂及特異調(diào)控增殖的癌基因發(fā)揮作用。近來的 一些研究顯示F0XM1在侵襲及血管生成等方面發(fā)揮重要作用。F0XM1同樣能夠上調(diào)L0X及 Slug的表達(dá)水平，進(jìn)而減少E-cadherin的表達(dá)。綜上，F(xiàn)0XM1是EMT及腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控分 子。但是，對于F0XM1調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步闡述。
[0006] 隨著近年來免疫治療和生物治療的發(fā)展，惡性腫瘤的治療取得了突破性進(jìn)展。但 是對于晚期轉(zhuǎn)移腫瘤病人，其生存期及生活質(zhì)量仍是目前惡性腫瘤治療面臨的嚴(yán)峻問題。 因此，對于腫瘤轉(zhuǎn)移患者的早期診斷和治療仍是腫瘤領(lǐng)域亟待解決的問題，而缺乏合適的 診斷標(biāo)志物和有效的藥物治療靶點(diǎn)是重要原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述腫瘤治療中的問題，本發(fā)明利用分子生物學(xué)手段發(fā)現(xiàn)了 F0XM1的一 個新的異構(gòu)體一一F0XM1D，并發(fā)現(xiàn)了其在誘導(dǎo)EMT、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等方面的顯著功能。
[0008] -方面，本發(fā)明通過GeneRace的手段發(fā)現(xiàn)了上述的異構(gòu)體，經(jīng)GeneRace后獲得的 核苷酸序列如SEQ ID勵:3所示，其中包含了？(《110的1￥、￥、￥1、￥11、￥11&的外顯子序列，該 異構(gòu)體F0XM1D能夠通過其外顯子IV-V-VI-VII-VIIa編碼的蛋白或多肽與R0CK1/2的 coiled-coil結(jié)構(gòu)域相互作用進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞骨架及EMT，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，該蛋白質(zhì)在大腸癌 病人的組織中顯示出與預(yù)后的顯著相關(guān)性。
[0009] 進(jìn)而，本發(fā)明提供了一種D型人Ml叉頭蛋白F0XM1D，該蛋白選自下組：
[0010] (a)具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的蛋白；
[0011] (b)將SEQ ID NO: 1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸參加的取代、缺失或添加而 形成的，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲迀移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽；
[0012] (c)與SEQ ID NO: 1氨基酸序列有2 95%同源性，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲迀移功 能的由(a)衍生的蛋白或多肽。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述人F0XM1D蛋白的編碼基因，該基因具有如SEQ ID N0:2 所示的多核苷酸序列，該序列的845-1332位對應(yīng)于SEQ ID NO: 3,其中包含了F0XM1D特有的 IV、V、VI、VII、VIIa 外顯子序列。
[0014]進(jìn)而，本發(fā)明提供了一種核酸，該核酸具有：
[0015] (a)如SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列；或
[0016] (b)與SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列互補(bǔ)的序列。
[0017]更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種核酸，其編碼氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋 白；優(yōu)選地，上述核酸具有：
[0018] (a)如SEQ ID N0:2所示的序列中845-1332位的序列；或
[0019] (b)如SEQ ID N0:2所示的序列中1-2361位的序列。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供了一種蛋白或多肽的制備方法，包括步驟：
[0021] 1)構(gòu)建含有如下(a)或(b)所述的核酸的載體：
[0022] (a)具有如SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列的核酸；
[0023] (b)具有與SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列互補(bǔ)序列的核酸；
[0024] 2)將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞；
[0025] 3)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；
[0026] 4)從培養(yǎng)物中分離出具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全長蛋白或部分片段的多 肽；
[0027] 5)人工合成具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全長蛋白或部分片段的多肽。
[0028]進(jìn)而，本發(fā)明提供了一種載體，其含有如下(a)或(b)所述的核酸：
[0029] (a)具有如SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列的核酸；
[0030] (b)具有與SEQ ID N0:2所示多核苷酸序列互補(bǔ)序列的核酸。
[0031 ]進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種遺傳工程化細(xì)胞，其含有上述的載體。
[0032]更進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種過表達(dá)具有如SEQ ID N0:2所示序列的核酸的細(xì) 胞，以及一種敲減具有如SEQ ID N0:2所示序列的核酸的細(xì)胞。
[0033]第三個方面，本發(fā)明還提供了 D型人Ml叉頭蛋白F0XM1D作為預(yù)后腫瘤病人的一種 標(biāo)志物的應(yīng)用，以及作為腫瘤治療靶點(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的應(yīng)用。
[0034] 上述的應(yīng)用的一種優(yōu)選實(shí)施方式表現(xiàn)為一種能與所述D型人Ml叉頭蛋白全長或部 分片段特異性結(jié)合的抗體、化合物或其他物質(zhì)；另一種優(yōu)選實(shí)施方式表現(xiàn)為一種藥物組合， 其含有安全有效量的所述D型人Ml叉頭蛋白的拮抗劑或激動劑，以及藥學(xué)上可接受的載體； 又一種優(yōu)選實(shí)施方式表現(xiàn)為一種用于藥物測試的動物模型，該模型通過基因工程方法外源 性轉(zhuǎn)入包含具有SEQ ID N0: 2核苷酸序列其互補(bǔ)序列的核酸，并外源性表達(dá)所述D型人Ml叉 頭蛋白；再一種優(yōu)選實(shí)施方式表現(xiàn)為一種檢測方法，檢測具有SEQ ID N0:2核苷酸序列或其 互補(bǔ)序列的核酸和/或所述D型人Ml叉頭蛋白在不同組織或體液中的含量。
[0035] 進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種確定測試化合物或抗體是否是人F0XM1D蛋白的拮抗 劑或激動劑的方法，其包括步驟：
[0036] 1)將測試化合物或抗體加入體外培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系作為測試組，并將體外培養(yǎng) 的相同細(xì)胞作為對照組，其中所述的細(xì)胞來自于哺乳動物，并且表達(dá)所述D型人Ml叉頭蛋 白；
[0037] 2)觀察測試組和對照組中細(xì)胞的迀移程度，如果測試組的細(xì)胞迀移程度大于對照 組，則表示測試化合物或抗體是人F0XM1D蛋白的激動劑;如果測試組的細(xì)胞迀移程度小于 對照組，則表示測試化合物是人F0XM1D蛋白的拮抗劑。
[0038] 鑒于與R0CK1/2相互作用而改變細(xì)胞的形態(tài)，參與細(xì)胞的運(yùn)動是F0XM1D發(fā)揮功能 的分子機(jī)制之一，因此，本發(fā)明還提供了以F0XM1D作為靶點(diǎn)在高血壓、糖尿病和生殖系統(tǒng)相 關(guān)等疾病中的診斷和藥物設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記物以及藥物靶點(diǎn)的應(yīng)用。
[0039] 以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0040] 圖1為釣取的F0XM1D基因的電泳結(jié)果；
[0041] 圖2為釣取的F0XM1D基因的測序鑒定結(jié)果；
[0042]圖3為F0XM1D在蛋白水平的鑒定結(jié)果；
[0043] 圖 4為 SW-480-control 及 F0XM1D 過表達(dá)細(xì)胞株的 E-cadher in、N_cadherin及 Vimentin蛋白水平鑒定結(jié)果；
[0044] 圖 5為He la-contro 1 及F0XM1D過表達(dá)細(xì)胞株的E-cadher in、N-cadherin及 Vimentin蛋白水平鑒定結(jié)果；
[0045] 圖 6為LoVo-shcontrol 及shFOXMlD 細(xì)胞株的E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 蛋白水平鑒定結(jié)果；
[0046] 圖 7為SW-480-control 及 F0XM1D 過表達(dá)、LoVo-shcontrol 及shFOXMlD 細(xì)胞株 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測侵襲能力的結(jié)果；
[0047] 圖8為SW-480-control及F0XM1D過表達(dá)組小鼠腸癌足墊轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果；
[0048] 圖9為SW-480-control及F0XM1D過表達(dá)組小鼠腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果；
[0049] 圖10為LoVo-shcontrol及shFOXMlD組小鼠腸癌足墊轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果；
[0050] 圖11為LoVo-shcontrol及shFOXMlD組小鼠腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移檢測結(jié)果；
[0051 ] 圖12為正常組和腫瘤未轉(zhuǎn)移組F0XM1D的mRNA水平檢測結(jié)果；
[0052] 圖13為腫瘤非轉(zhuǎn)移組和轉(zhuǎn)移組F0XM1D的mRNA水平檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 實(shí)施例1F0XM1D基因的鑒定、釣取及質(zhì)粒構(gòu)建 [0054] 1.儀器與材料
[0055] Mastercycler pro-Eppendorf PCR儀（德國Eppendorf公司），DK_8D型電熱恒溫水 槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），IQ350凝膠成像系（美國GE Healthcare公司），C02細(xì)胞培 養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），F(xiàn)R-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)（復(fù)日科技公司）、 NanoVue RNA/DNA濃度/純度檢測儀（德國 IKA公司），GeneRacer Kit(美國 Invitrogen公 司），pMD-19T載體(大連Takara公司），ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像儀(美國GE公司） 抗體訂制(上海睿星基因科技公司）。
[0056] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0057] 2.1 GeneRace 及基因釣取
[0058] Trizol法（Invitrogen)提取 Hela、293T或K562 細(xì)胞的總RNA，按照GeneRacer 試劑 盒說明書將總RNA去磷酸化、去帽子、加接頭oligo,反轉(zhuǎn)錄為cDNA(Promega)，進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增。 ACT_：3,。將第一輪PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，引物如下：5，_ AGAACTCCATCCGCCACAACC-3 ' ； 5 ' -TAAACAAAGAAAGATAAAATTAAAC-3 '。將第二輪PCR產(chǎn)物回收 后連入PMD-19T載體，測序后得到含有F0XM1外顯子V、VI、VII和Vila的片段。
[0060] 再以原CDNA為模板，通過第三次PCR擴(kuò)增后連入PMD-19T載體，引物如下：5'_ ATGAAAACTAGCCCCCG-3 ' ； 5 ' -CTACTGTAGCTCAGGAAT-3 '。通過挑取單克隆，得到含有F0XM1D全 長的克隆。
[0061 ] 2.2蛋白水平鑒定F0XM1D表達(dá)
[0062] 針對F0XM1D第五六外顯子銜接處及Vila外顯子所編碼蛋白序列設(shè)計(jì)表位多肽，免 疫兔子制備特異多克隆抗體。多肽序列如下：CPll(DQVFKQQKRP)及CP12(FSGDLRDFGTP)。理 論上CPI 1識別F0XM1B及F0XM1D，而CP12識別F0XM1A及F0XM1D，而由于F0XM1A異構(gòu)體在組織 及細(xì)胞中存在較少，因此CP12被認(rèn)為主要識別F0XM1D。將F0XM1D片段構(gòu)建入pEGFP-Nl載體， 在Hela細(xì)胞中用Lipo2000瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-Nl-FOXMlD載體，36小時后收取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行 western blot檢測。
[0063] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0064] 結(jié)果顯示，F(xiàn)0XM1D基因被成功釣?。▓D1和圖2)，并且CP12及商業(yè)化F0XM1抗體 (santacruz，K-19)均能夠檢測到F0XM1D在細(xì)胞中的明顯表達(dá)(圖3)。
[0065] 實(shí)施例2F0XM1D在EMT及腫瘤轉(zhuǎn)移中的功能檢測 [0066] 1.儀器與材料
[0067] siRNA片段合成（genepharma公司），G418及puromycin抗生素（德國Merck公司），E_ cadherin，N_cadherin，Vimentin抗體(Abeam公司），Transwell小室（BD公司），24孔細(xì)胞培 養(yǎng)板（Corning公司），BioRAD Mini protein Tera system(美國BioRAD公司）， ImageQuantLAS 4000化學(xué)發(fā)光成像儀（美國GE公司），C02細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），Matrigel基質(zhì)膠（BD falcon公司），BALB/c裸鼠（上海SLAC公司）， Luciferin(美國Perkin Elmer公司），小動物體內(nèi)成像儀(In-Vivo MS FX PRO,Bruker)。
[0068] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0069] 2.1 F0XM1D過表達(dá)及敲減細(xì)胞株的獲得
[0070] 將F0XM1D構(gòu)建入pLVX-IRES-Neo慢病毒載體，抽提質(zhì)粒后合并其余兩個包裝質(zhì)粒 用Lip〇2000轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞株中包裝病毒，收取病毒上清后感染SW-480細(xì)胞株以及Hela 細(xì)胞株，在G418篩選兩輪后得到穩(wěn)定過表達(dá)F0XM1D細(xì)胞株;敲減細(xì)胞株的獲得與上述過表 達(dá)細(xì)胞株相似，將合成的兩條siRNA片段煮沸后退火，連入pLKO.l載體，其余步驟同上述 (puromycin抗生素篩選）。
[0071] 2.2免疫印跡檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株EMT指標(biāo)
[0072] 將 SW-480-control 及F0XM1D過表達(dá)細(xì)胞株、Hela-control 及F0XM1D過表達(dá)細(xì)胞 株、LoVo-shcontrol及shFOXMlD細(xì)胞株收取細(xì)胞總蛋白，定量后取50yg蛋白總量上樣，進(jìn)行 western blot，分別孵育E-cadherin、N-cadherin及Vimentin抗體，過表達(dá)細(xì)胞株的檢測結(jié) 果如圖4-6所示。
[0073] 2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株侵襲能力
[0074]取Matrigel按照1:3稀釋鋪入24孔細(xì)胞板，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜凝膠。第二 日，將SW-480-control及F0XM1D過表達(dá)、LoVo-shcontrol及shFOXMlD細(xì)胞株消化后計(jì)數(shù)，用 無血清培養(yǎng)基稀釋后分別均取5X104細(xì)胞每孔進(jìn)行鋪板，置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱。48小時后 用4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色后拍照，然后計(jì)算各組的細(xì)胞數(shù)，其結(jié)果如圖7所示。 [0075] 2.4小動物體內(nèi)成像檢測F0XM1D對于腸癌轉(zhuǎn)移的功能測定
[0076]將 SW-480-control 及 F0XMlD、LoV〇-shcontrol 及 shFOXMlD 細(xì)胞株按照 1 X 106 細(xì) 胞/只小鼠進(jìn)行皮下種植腫瘤，約兩周后取出皮下腫瘤，切成1mm3小塊，將腫塊種植在BALB/ c裸鼠盲腸部位。大概40天后，將各組小鼠麻醉后腹腔注射luciferin底物后，進(jìn)行小動物體 內(nèi)成像監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果如圖8-11所示。
[0077] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0078] 免疫印跡結(jié)果顯示在過表達(dá)F0XM1D后E-cadherin顯著下降，N-cadherin及 Vimentin蛋白水平顯著上調(diào)，在F0XM1D敲減后結(jié)果相反，上述指標(biāo)提示F0XM1D誘導(dǎo)EMT發(fā)生 (圖4-6) Jranswell實(shí)驗(yàn)顯示F0XM1D顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力（圖7)。而腸癌原位模型 上，小動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示F0XM1D驅(qū)動腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，敲減F0XM1D后，腫瘤的轉(zhuǎn) 移能力極顯著降低（圖8-11)。
[0079] 實(shí)施例3 F0XM1D在腸癌病人組織中mRNA水平測定
[0080] 1.儀器與材料
[0081 ] ABI 7900HT型高通量實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Life Technology公司），Trizol RNA抽提試劑（美國Life Technology公司），PowerS:YBR?Green Master Mix(美國Life Technology公司），腸癌病人組織標(biāo)本(來自于復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫保存），384孔 板(美國Life Technology公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司）。
[0082] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0083]將從復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院組織庫得到的標(biāo)本(儲存于RNAlater中）進(jìn)行研磨，按 照Trizol法抽提總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以F0XM1D特異引物進(jìn)行熒光定量PCR，引物序 列如下：F-primer: 5 ' -CAGGTGTTTAAGCAGCAGA-3 ' ； R-primer: 5 ' -GGTGATGGGTGTACCAAAAT- 3' J0XM1D mRNA相對表達(dá)水平根據(jù)如下公式得到：2 -AAGt( Δ Δ Ct= Δ Ct腫観-Δ (^正離或Δ Δ Ct = Δ Ct繼-Δ Ct機(jī)紐)。
[0084] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0085] 熒光定量PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)移腸癌病人組織中F0XM1D的mRNA水平顯著高于未轉(zhuǎn) 移組(n = 24，P〈0.001)，提示了F0XMlD作為生物標(biāo)志物預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移的應(yīng)用前景（圖12- l3)o
[0086]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無 需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種D型人Ml叉頭蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組： (a) 具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的蛋白； (b) 將SEQ ID NO: 1氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸參加的取代、缺失或添加而形成 的，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲迀移功能的由(a)衍生的蛋白或多肽； (c) 與SEQ ID NO: 1氨基酸序列有2 95%同源性，且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲迀移功能的 由（a)衍生的蛋白或多肽。2. -種核酸，其特征在于具有： (a) 如SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列;或 (b) 與SEQ ID N0:2所示的多核苷酸序列互補(bǔ)的序列。3. -種核酸，其特征在于，其編碼氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白。4. 如權(quán)利要求3所述的核酸，其特征在于，該核酸具有： (a) 如SEQ ID N0:2所示的序列中845-1332位的序列;或 (b) 如SEQ ID N0:2所示的序列中1-2361位的序列。5. -種載體，其特征在于，其含有如權(quán)利要求2所述的核酸。6. -種遺傳工程化細(xì)胞，其特征在于，其含如有權(quán)利要求5所述的載體。7. -種蛋白或多肽的制備方法，其特征在于，包括步驟： 1) 構(gòu)建含有如權(quán)利要求5所述的載體； 2) 將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞； 3) 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞； 4) 從培養(yǎng)物中分離出具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全長蛋白或部分片段的多肽； 5) 人工合成具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的全長蛋白或部分片段的多肽。8. -種過表達(dá)或敲減具有如SEQ ID N0:2所示序列的核酸的細(xì)胞。9. 一種能與如權(quán)利要求1所述的D型人Ml叉頭蛋白全長或部分片段特異性結(jié)合的抗體 或化合物。10. -種藥物組合，其特征在于含有安全有效量的如權(quán)利要求1所述的D型人Ml叉頭蛋 白的拮抗劑或激動劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。11. 一種用于藥物測試的動物模型，其特征在于，通過基因工程方法外源性轉(zhuǎn)入包含權(quán) 利要求2中的核酸并外源性表達(dá)如權(quán)利要求1所述的D型人Ml叉頭蛋白。12. -種檢測方法，其特征在于，檢測如權(quán)利要求2所述的核酸和/或如權(quán)利要求1所述 的D型人Ml叉頭蛋白在不同組織或體液中的含量。13. -種確定測試化合物或抗體是否是人F0XM1D蛋白的拮抗劑或激動劑的方法，其特 征在于，包括步驟： 1) 將測試化合物或抗體等加入體外培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)體系作為測試組，并將體外培養(yǎng)的 相同細(xì)胞作為對照組，其中所述的細(xì)胞來自于哺乳動物，并且表達(dá)權(quán)利要求1所述的D型人 Ml叉頭蛋白； 2) 觀察測試組和對照組中細(xì)胞的迀移程度，如果測試組的細(xì)胞迀移程度大于對照組， 則表示測試化合物或抗體是F0XM1D蛋白的激動劑；如果測試組的細(xì)胞迀移程度小于對照 組，則表示測試化合物是F0XM1D蛋白的拮抗劑。14. 如權(quán)利要求1所述的D型人Ml叉頭蛋白作為腫瘤、高血壓、糖尿病和生殖系統(tǒng)相關(guān)疾 病診斷的一種標(biāo)志物，以及作為腫瘤、高血壓、糖尿病和生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病治療靶點(diǎn)進(jìn)行藥 物設(shè)計(jì)的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P35/00GK105837678SQ201610284798
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】胡維國, 張鑫
【申請人】復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院