一種小球藻濃縮液的保存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小球藻濃縮液的保存方法，包括以下步驟：(1)分別用120～200mg/L的明礬、30～60mg/L的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮小球藻，制備成小球藻濃縮液于4℃中保存?zhèn)溆茫?2)將制備好的小球藻濃縮液分裝于5ml的凍存管中，再將裝有小球藻濃縮液的凍存管用黑色塑料袋密封后分別置于4℃的冰箱中，保存時間為3個月。本發(fā)明操作簡單、保存效果好、應(yīng)用范圍廣泛、成本低。
【專利說明】
_種小球藻濃縮液的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種小球藻濃縮液的保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微藻是一類光合利用率高的單細(xì)胞真核生物，大小一般介于5~25μπι之間，直接用 肉眼是無法觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小及活動方式，需要通過于顯微鏡才能分辨出其細(xì)胞形 態(tài)、結(jié)構(gòu)等，故而得名微藻。普遍分布于各個溫度帶中，從淡水水域到海水均有微藻的存在。 因其光合作用強(qiáng)、增殖速度快、人工易培養(yǎng)、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，現(xiàn)微藻被大量的應(yīng)用于水產(chǎn) 養(yǎng)殖、藥物研發(fā)、污水凈化、食品行業(yè)、色素提取及能源開發(fā)等方面。大多數(shù)微藻都富含有二 十碳五婿酸(ΕΡΑ)、二十二碳六稀酸(DHA)等多不飽和脂肪酸，這些多不飽和脂肪酸具有降 血壓、抗血栓、治療冠也病等也腦血管疾病的功效，因而微藻的應(yīng)用越來越受到人們的重 視，現(xiàn)也成為篩選抗師瘤藥物及抑茵提取物的重要庫源。
[0003] 隨著低溫生物學(xué)的發(fā)展，低溫保存技術(shù)在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)上尤其是微生物 保存、精子冷凍等多方面均已有了廣泛的應(yīng)用，因微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的重要性曰益突顯，研 究開發(fā)低溫生物學(xué)在微藻中的應(yīng)用也越來越受到重視。小球藻的低溫保存是將藻液置于低 溫條件下保存，有的采用加入各種抗凍劑等的多種處理方法，保存一定長時間后，使藻細(xì)胞 盡可能的存擁有較高的存活率及保持原有的營養(yǎng)物質(zhì)含量不變，更加有利于各種研究的進(jìn) 行和微藻的商業(yè)性開發(fā)利用。目前對海洋單胞微藻進(jìn)行濃縮主要有四種常見的方法，分別 是自然沉降法、離心濃縮發(fā)、超濾濃縮法及化學(xué)濃縮法。
[0004] 餌料微藻在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的養(yǎng)殖及育苗的運(yùn)用中，廣泛采用的都是現(xiàn)養(yǎng)現(xiàn)喂的模 式即一般都是直接給水產(chǎn)動物投喂新鮮培養(yǎng)的藻液，這就要求微藻的培養(yǎng)必需與生產(chǎn)同時 進(jìn)行，又因?yàn)樵孱愐_(dá)到一定量需要一小段時間，故又要求藻類的培養(yǎng)要先于育苗進(jìn)行，這 樣餌料培養(yǎng)的量和供應(yīng)時間才能與幼苗的需求相吻合。但是，在實(shí)際的生產(chǎn)實(shí)踐中，餌料微 藻的培養(yǎng)常常會受到季節(jié)的更替、溫度變化、光照長短等因素的限制，常常會出現(xiàn)鮮藻無法 滿足水產(chǎn)動物需求的現(xiàn)象，或者某一段時間內(nèi)完全無餌料供應(yīng)的情況，這極其不利于水產(chǎn) 動物的生長尤其會給育苗帶來毀滅性的影響，從而給生產(chǎn)帶來極大的損失。
[0005] 隨著低溫生物學(xué)的快速發(fā)展，低溫保存技術(shù)在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)上尤其是微 生物保存、精子冷凍等多方面均有了廣泛的應(yīng)用。海洋微藻營養(yǎng)豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、 多糖、不飽和脂肪酸、多種維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛的應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，但微藻自身的生 長易受環(huán)境、氣候等因素的影響，往往會給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來很大的不便，故而研究開發(fā)低溫 生物學(xué)在微藻中的應(yīng)用也越來越受到重視。
[0006] 目前，缺乏一種保存效果好的小球藻濃縮液的保存方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種保存效果好的小球藻濃縮液的保存方 法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的一種小球藻濃縮液 的保存方法，包括以下步驟：
[0009] (1)分別用120~200mg/L的明礬、30~60mg/L的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮 小球藻，制備成小球藻濃縮液于4°C中保存?zhèn)溆茫?br>[0010] (2)將制備好的小球藻濃縮液分裝于5ml的凍存管中，再將裝有小球藻濃縮液的凍 存管用黑色塑料袋密封后分別置于4°C的冰箱中，保存時間為3個月。
[0011 ] 進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述明研^Ssoomg/L，所述氯化鐵為60mg/L。
[0012] 進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述明研^SlSOmg/L，所述氯化鐵為50mg/L。
[0013] 有益效果：本發(fā)明操作簡單、保存效果好、應(yīng)用范圍廣泛、成本低。與現(xiàn)有技術(shù)相 比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)小球藻的濃縮是采用高速離心機(jī)、超濾膜等物理方法或明礬、 氯化鐵等化學(xué)試劑進(jìn)行絮凝的化學(xué)方法將新鮮培養(yǎng)的低濃度藻液濃縮，保存效果好。
[0014] (2)由于4°C是零上溫度，處于該溫度下的藻細(xì)胞內(nèi)的自由水不易形成冰晶，故而 絕大部分細(xì)胞能夠保持完整結(jié)構(gòu)、存活率及恢復(fù)生長的能力;穩(wěn)定期的小球藻的存活率均 明顯較對數(shù)期的高。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例是本發(fā)明的闡釋 和舉例，并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 本發(fā)明的一種小球藻濃縮液的保存方法，包括以下步驟：
[0018] ⑴分別用120mg/L的明礬、30mg/L的氯化鐵絮凝球小球藻藻液，離心濃縮小球藻， 制備成小球藻濃縮液于4°C中保存?zhèn)溆茫?br>[0019] (2)將制備好的小球藻濃縮液分裝于5ml的凍存管中，再將裝有小球藻濃縮液的凍 存管用黑色塑料袋密封后分別置于4°C的冰箱中，保存時間為3個月。實(shí)施例2
[0020] 實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于:本發(fā)明的一種小球藻濃縮液的保存方法，包括以 下步驟:在步驟（1)中，分別用180mg/L的明研^、40π^/1的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮 小球藻，制備成小球藻濃縮液于4°C中保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 實(shí)施例3
[0022] 實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于:本發(fā)明的一種小球藻濃縮液的保存方法，包括以 下步驟:在步驟（1)中，分別用200mg/L的明研^ dOmg/l的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮 小球藻，制備成小球藻濃縮液于4°C中保存?zhèn)溆茫?br>[0023] 對比例1
[0024]本發(fā)明的一種小球藻濃縮液的保存方法，包括以下步驟：
[0025] ⑴分別用120mg/L的明礬、30mg/L的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮小球藻，制 備成小球藻濃縮液于10°c中保存?zhèn)溆茫?br>[0026] (2)小球藻的低溫保存
[0027]將制備好的小球藻濃縮液分裝于5ml的凍存管中，再將裝有小球藻濃縮液的凍存 管用黑色塑料袋密封后分別置于-10°c的冰箱中，保存時間為3個月，其中保存于-10°c溫度 下的濃縮液先置于4°C的條件下馴化24h;
[0028] 對比例2
[0029] 本發(fā)明的一種小球藻濃縮液的保存方法，包括以下步驟：
[0030] ⑴分別用120mg/L的明礬、30mg/L的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮小球藻，制 備成小球藻濃縮液于_30°C中保存?zhèn)溆茫?br>[0031] (2)抗凍保護(hù)劑的配置及添加
[0032] 以基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制不同濃度保護(hù)劑，在-30°C下保存的小球藻藻液中添加不同濃 度的保護(hù)劑，所述保護(hù)劑采用逐步加入法;所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為f/2基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0033] (3)小球藻的低溫保存
[0034] 將制備好的小球藻濃縮液分裝于5ml的凍存管中，再將裝有小球藻濃縮液的凍存 管用黑色塑料袋密封后分別置于_30°C的冰箱中，保存時間為3個月，其中保存于-30°C溫度 下的濃縮液先置于4°C的條件下馴化24h;
[0035] (4)小球藻的化凍和冷凍保護(hù)劑的去除
[0036] 將低溫保存后的小球藻取出后，置于40°C恒濕水浴中迅速化凍，直至最后一個冰 晶消失后立即取出，對于添加了冷凍保護(hù)劑的處理組，在室溫下用基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋后離心 去除保護(hù)劑。
[0037] 所述抗凍保護(hù)劑為二甲亞砜DMS0、甲醇中的一種或兩種的組合。
[0038] 試驗(yàn) 1
[0039] 將實(shí)施例1的藻種年齡對小球藻濃縮液低溫保存的影響進(jìn)行檢測，藻種年齡對小 球藻濃縮液低溫保存的影響如表1所示，
[0040] 表 1
[0041]
[0042] 如表1所示，處于對數(shù)期、穩(wěn)定期的小球藻濃縮液分別在低溫4°C、_10°C、_30°C條 件下保存蘭個月后，藻細(xì)胞的存活率、恢復(fù)生長的比生長率K值均呈現(xiàn)出較顯著的差異(P< 0.05)，處于穩(wěn)定期的藻細(xì)胞的存活率較對數(shù)期的高，但恢復(fù)生長的比生長率K值則較對數(shù) 期的小。在4 °C下，處于穩(wěn)定期藻細(xì)胞的存活率31.34 %較對數(shù)期的29.23 %高，比生長率K值 0.09則較對數(shù)期0.13的小;在-10 °C下，穩(wěn)定期的存活率25.82 %較對數(shù)期的22.62 %高，而 比生長率K值化0.05亦明顯較對數(shù)期的0.13??；在-30 °C下，同樣呈現(xiàn)出穩(wěn)定期的存活率 10.72 %較對數(shù)期8.34 %高，而比生長率K值0.03較對數(shù)期的0.08小。表明處于穩(wěn)定期的球 等鞭金藻在低溫保存中有更好的存活率，但其恢復(fù)生長的能力不如對數(shù)期的藻細(xì)胞。
[0043] 試驗(yàn) 2
[0044] 將實(shí)施例1的微藻濃縮方法對小球藻低溫保存存活率、比生長率進(jìn)行檢測，小球藻 低溫保存存活率、比生長率的影響數(shù)據(jù)如表2所示，
[0045]表 2 Γηη4Α?
[0048] 由表2所示，對數(shù)期、穩(wěn)定期小球藻濃縮液分別在低溫4°C、_10°C、_30°C條件下保 存3個月后，小球藻濃縮液分別在4°C、-10°C、-30°C低溫條件下保存3個月后，存活率及恢復(fù) 生長的比生長率K值，在未添加任何抗凍保護(hù)劑的情況下，呈現(xiàn)出保存溫度越高藻細(xì)胞的存 活率及恢復(fù)生長的比生長率越髙的庭勢，4°C下保存的藻細(xì)胞的存活率及比生長率1(值較_ 10 °C的存活率及比生長率K值又較-30 °C的髙(P<0.05)。在4 °C下保存的藻細(xì)胞存活率可達(dá) 42.00~45.34%，，恢復(fù)生長的比生長率K值可達(dá)0.12~0.26;在-10°C下保存時，藻細(xì)胞的 存活率則為30.02 %~31.82 %，藻細(xì)胞恢復(fù)生長的相對生長常數(shù)K值為化0.12~0.24;而 在-30°C下保存時，小球藻濃縮液的存活率僅22.49%~26.02%，藻細(xì)胞恢復(fù)生長的相對生 長常數(shù)K值則為0.08~0.17;由此可見，4°C的低溫更適合于小球藻濃縮液的直接保存。
[0049] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明 要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小球藻濃縮液的保存方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 分別用120~200mg/L的明研；、30~60mg/L的氯化鐵絮凝小球藻藻液，離心濃縮小球 藻，制備成小球藻濃縮液于4°C中保存?zhèn)溆茫? (2) 將制備好的小球藻濃縮液分裝于5ml的凍存管中，再將裝有小球藻濃縮液的凍存管 用黑色塑料袋密封后分別置于4°C的冰箱中，保存時間為3個月。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小球藻濃縮液的保存方法，其特征在于:在步驟(1)中，所述明 鞏為200mg/L，所述氯化鐵為60mg/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小球藻濃縮液的保存方法，其特征在于:在步驟(1)中，所述明 鞏為180mg/L，所述氯化鐵為50mg/L。
【文檔編號】C12N1/12GK105838611SQ201610377040
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】高志剛, 汪世軍, 王峰
【申請人】東臺市賜百年生物工程有限公司