一種煙嘧磺隆降解菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙嘧磺隆降解菌及其應(yīng)用，所述煙嘧磺隆降解菌為假單胞菌Pseudomonas sp，保藏號(hào)為CGMCC NO.11523。所述煙嘧磺隆降解菌在受煙嘧磺隆污染土壤的微生物修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明的煙嘧磺隆降解菌的降解效率較高，不依賴外加碳源的煙嘧磺隆降解菌。CGMCC No.1152320151021
【專利說明】
一種煙嘧磺隆降解菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種煙嘧磺隆降解菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磺酰脲類除草劑是20世紀(jì)70年代由美國杜邦公司研發(fā)的一類新型除草劑，具有高活性、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)，其問世并成功應(yīng)用標(biāo)志著除草劑進(jìn)入超高效時(shí)代。煙嘧磺隆是一種適用于玉米田的磺酰脲類除草劑，能夠有效防除玉米田大多數(shù)一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草、莎草科雜草。我國于90年代初期開始引進(jìn)并推廣煙嘧磺隆，商品名玉農(nóng)樂。經(jīng)過二十年的發(fā)展，其應(yīng)用范圍已遍及全國各地區(qū)，成為玉米田雜草防除的首選除草劑。然而，由于長期大規(guī)模施用這種長效除草劑，其有效成分在土壤中殘留并不斷積累，導(dǎo)致田間輪作中各種后茬敏感作物如大豆、小麥、煙草等減產(chǎn)甚至絕收。土壤對(duì)煙嘧磺隆的吸附作用較弱，容易導(dǎo)致該除草劑移動(dòng)至地表水和地下水造成污染。因此，如何有效去除土壤煙嘧磺隆殘留已成為當(dāng)下亟待解決的問題。煙嘧磺隆在自然界中的降解方式主要有三種，分別為光降解、化學(xué)水解及微生物降解。光降解發(fā)生較為普遍，但反應(yīng)啟動(dòng)慢，降解效率低;化學(xué)水解依賴土壤pH值，在堿性和中性環(huán)境下較難發(fā)生;而微生物降解能夠在各種自然條件下發(fā)揮作用，是煙嘧磺隆最為重要的降解方式。目前國內(nèi)外已報(bào)道的煙嘧磺隆降解微生物有曲霉菌、芽孢桿菌、紅假單胞菌、沙雷氏菌、黃籃狀菌菌屬的幾株菌株。但是，迄今為止國內(nèi)外報(bào)道的甲醛降解菌仍然存在耐受濃度低，降解速度慢等缺點(diǎn)，限制了其實(shí)際應(yīng)用?，F(xiàn)有專利公開的一種高效降解煙嘧磺隆的枯草芽胞桿菌及其應(yīng)用(申請(qǐng)?zhí)?201310557361.1)，需要加入額外的營養(yǎng)物質(zhì)提供碳源供微生物生長，實(shí)際應(yīng)用中遇到環(huán)境營養(yǎng)條件較差的情況難以發(fā)揮降解作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種煙嘧磺隆降解菌及其應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有的高效降解煙嘧磺隆的枯草芽胞桿菌需要加入額外的營養(yǎng)物質(zhì)提供碳源供微生物生長，實(shí)際應(yīng)用中遇到環(huán)境營養(yǎng)條件較差的情況難以發(fā)揮降解作用的問題。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種煙嘧磺隆降解菌，所述煙嘧磺隆降解菌為假單胞菌Pseudomonas sp0
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述煙嘧磺隆降解菌在受煙嘧磺隆污染土壤的微生物修復(fù)中的應(yīng)用。
[0006]煙啼磺隆降解菌，其特征在于，所述煙啼磺隆降解菌為假單胞菌Pseudomonas sp,保藏號(hào)為CGMCC N0.11523。
[0007]進(jìn)一步，所述煙嘧磺隆降解菌的篩選方法包括:
[0008]步驟一，菌源采自使用煙嘧磺隆的玉米田土壤，采集距表層2-6cm的土壤樣品6份；
[0009]步驟二，稱取1g土樣加入到20ml無菌蒸餾水中，充分打散，靜置后取5ml上清液接種于45ml含50mg/L煙嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基(成分(g/L)NH3N030.5;K2HP04.3H20 1.0；KH2PO41-O5MgSO4.7H20 0.1；NaCl 0.2； CaCl2.6H2O 0.02,pH 7.0)中，于32°C、150rpm 培養(yǎng)7天;
[0010]步驟三，取培養(yǎng)液5ml轉(zhuǎn)接至新鮮MSM培養(yǎng)基中，煙嘧磺隆濃度提高至100mg/L，同樣條件下培養(yǎng)7天，然后取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮MSM培養(yǎng)基中，如此反復(fù)6次，其中煙嘧磺隆濃度分別為50、100、150、200、250、3001^/1;將含煙嘧磺隆30011^/1的培養(yǎng)液按不同比例梯度稀釋，分別涂布于含煙嘧磺隆50mg/L的MSM平板上，32°C培養(yǎng)5天，挑取邊緣清晰的菌落，經(jīng)反復(fù)平板劃線純化直到獲得單菌落，并分別進(jìn)行煙嘧磺隆降解能力測(cè)試；
[0011]步驟四，確定各菌株降解能力后，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面保藏降解性能優(yōu)良的菌株；
[0012]步驟五，菌株的鑒定。
[0013]進(jìn)一步，所述菌株的鑒定具體包括:
[0014]第一步，煙嘧磺隆降解菌NSA02的菌落形態(tài)特征及生理生化特征:將已充分活化的菌株NSA02接種到LB培養(yǎng)基平板上，生長48h后觀察菌落呈圓形，乳白色，較粘稠，表面光滑，中心突起，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等方法進(jìn)行鑒定，該菌為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，單極生鞭毛，具運(yùn)動(dòng)性，專性好氧；
[0015]第二步，菌株NSA02的16s rDNA鑒定:
[0016]序列擴(kuò)增采用正向引物5-厶6厶61'11^了0^6(:1^6-3’，
[0017]反向引物5 ’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’，以細(xì)菌總DNA為模板，PCR反應(yīng)程序如下:95°C 變性 51^11，951€308，531€308，721€908，共35個(gè)循環(huán)；72°(:10111丨11，4°(:保存，將得到的163rRNA序列登錄GenBank，進(jìn)行Blast同源比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株NSA02的16SrRNA基因與假單胞菌屬基因序列同源性最高，與Pseudomonas nitroreducens R5-758同源性達(dá)98%，結(jié)合形態(tài)、生理生化指標(biāo)和16S rRNA基因序列分析，初步鑒定菌株NSA02為假單胞菌Pseudomonas spD
[0018]本發(fā)明提供的煙嘧磺隆降解菌及其應(yīng)用，煙嘧磺隆降解菌的降解效率較高，不依賴外加碳源的煙嘧磺隆降解菌，菌株NSA02在含50mg/kg煙嘧磺隆的土壤中培養(yǎng)96h，煙嘧磺隆降解率達(dá)到90.44 %。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的煙嘧磺隆降解菌篩選流程圖。
[0020]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的菌株NSA02降解不同濃度煙嘧磺隆的示意圖。
[0021]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的菌株NSA02降解土壤中煙嘧磺隆的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0024]本發(fā)明的煙嘧磺隆降解菌的菌株分離、篩選、鑒定、降解效率評(píng)估。
[0025]本發(fā)明的煙嘧磺隆降解菌7天左右能完全降解400mg//L煙嘧磺隆，采用假單胞菌Pseudomonas sp.，不需要添加額外營養(yǎng)物質(zhì)就能達(dá)到這個(gè)效率，試驗(yàn)使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，只含無機(jī)鹽離子。
[0026]本發(fā)明煙嘧磺隆降解菌，其為采自中江縣蒼山鎮(zhèn)長期使用煙嘧磺隆的玉米田土壤中分離得到的新菌株。該菌株已于2015年10月21日在中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址:北京市朝陽區(qū)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編:100101)保藏，分類命名為假單胞菌(Pseudomonas sp.)NSA02，保藏號(hào)為CGMCC N0.11523。
[0027]本發(fā)明煙嘧磺隆降解菌為革蘭氏陰性菌，其菌落在LB培養(yǎng)基上呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，中心突起。本發(fā)明煙嘧磺隆降解菌經(jīng)16S rDNA序列測(cè)序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，菌株與Pseudomonas nitroreducens R5-758親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)98%以上。菌株的16S rDNA序列如Seq ID NOl所示。
[0028]如圖1所示，本發(fā)明甲醛降解菌可以通過下述方法篩選得到:
[0029]SlOl:菌源采自中江縣蒼山鎮(zhèn)長期使用煙嘧磺隆的玉米田土壤，采集距表層2-6cm的土壤樣品6份；
[0030]S102:稱取1g土樣加入到20ml無菌蒸餾水中，充分打散，靜置后取5ml上清液接種于45ml含50mg/L煙嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基(成分(g/L)NH3N030.5;K2HP04.3H20 1.0；KH2PO41-O5MgSO4.7H20 0.1；NaCl 0.2； CaCl2.6H2O 0.02,pH 7.0)中，于32°C、150rpm 培養(yǎng)7天；
[0031]S103:取培養(yǎng)液5ml轉(zhuǎn)接至新鮮MSM培養(yǎng)基中，煙嘧磺隆濃度提高至100mg/L，同樣條件下培養(yǎng)7天，然后取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮MSM培養(yǎng)基中，如此反復(fù)6次，其中煙嘧磺隆濃度分別為50、100、150、200、250、30011^/1;將含煙嘧磺隆3001^/1的培養(yǎng)液按不同比例梯度稀釋，分別涂布于含煙嘧磺隆50mg/L的MSM平板上，32°C培養(yǎng)5天。挑取邊緣清晰的菌落，經(jīng)反復(fù)平板劃線純化直到獲得單菌落，并分別進(jìn)行煙嘧磺隆降解能力測(cè)試；
[0032]S104:確定各菌株降解能力后，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面保藏降解性能優(yōu)良的菌株。
[0033]S105:菌株的鑒定
[0034]I)煙嘧磺隆降解菌NSA02的菌落形態(tài)特征及生理生化特征:將已充分活化的菌株NSA02接種到LB培養(yǎng)基平板上，生長48h后觀察菌落呈圓形，乳白色，較粘稠，表面光滑，中心突起。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等方法進(jìn)行鑒定，該菌為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，單極生鞭毛，具運(yùn)動(dòng)性，專性好氧。
[0035]2)菌株NSA02的16s rDNA鑒定:序列擴(kuò)增采用正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’，反向引物5 ’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’，以細(xì)菌總DNA為模板，PCR反應(yīng)程序如下:95°C變性5!!^11，951€308，531€308，721€908，共35個(gè)循環(huán);72°(:101^11，4°(:保存。？0?產(chǎn)物測(cè)序由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。將得到的16S rRNA序列登錄GenBank，進(jìn)行Blast同源比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株NSA02的16S rRNA基因與假單胞菌屬基因序列同源性最高，與Pseudomonas nitroreducens R5-758同源性達(dá)98%。結(jié)合形態(tài)、生理生化指標(biāo)和16SrRNA基因序列分析，初步鑒定菌株NSA02為假單胞菌Pseudomonas sp.
[0036]本發(fā)明還提供了上述的煙嘧磺隆降解菌用于降解煙嘧磺隆的用途。
[0037]附圖2為菌株NSA02降解不同濃度煙嘧磺隆的過程。
[0038]下面結(jié)合試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作進(jìn)一步的說明。
[0039]試驗(yàn)I煙嘧磺隆降解菌NSA02的降解特性
[°04°]將菌種接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)18h，取培養(yǎng)液于4000rpm離心lOmin，以0.2M磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌2次，配置為菌懸液，以1.0 X 108CFU/mL接種量接種到含煙嘧磺隆50-400mg/L的MSM培養(yǎng)基中，在最適條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)液中煙嘧磺隆殘留量，其結(jié)果如附圖所示。菌株NSA02可在48h內(nèi)完全降解50mg/L煙嘧磺隆，隨著煙嘧磺隆濃度提高，完全降解所需時(shí)間也不斷延長，完全降解100、200、300、400mg/L煙嘧磺隆分別需時(shí)60、84、120、144h。
[0041]本發(fā)明還提供了上述的煙嘧磺隆降解菌用于煙嘧磺隆污染土壤的微生物修復(fù)用途。
[0042]附圖3為菌株NSA02降解土壤中煙嘧磺隆的過程。
[0043]下面結(jié)合試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用效果作進(jìn)一步的說明。
[0044]試驗(yàn)2煙嘧磺隆降解菌NSA02對(duì)土壤中煙嘧磺隆的降解
[0045]本實(shí)驗(yàn)使用的土壤采集自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所內(nèi)一處空地，土質(zhì)為壤土，pH值7.4，此前5年內(nèi)未使用任何農(nóng)藥。土壤樣品經(jīng)滅菌后，加入煙嘧磺隆使土壤中煙嘧磺隆含量為50mg/kg。將菌種接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化18h后，以1.0 X 108CFU/g接種量加入到含煙嘧磺隆的土壤中，于黑暗條件下靜置培養(yǎng)，試驗(yàn)期間土壤濕度控制在35-40%wt/wt，連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)液中煙嘧磺隆殘留量，其結(jié)果如附圖所示。菌株NSA02在含50mg/kg煙嘧磺隆的土壤中培養(yǎng)96h，煙嘧磺隆降解率達(dá)到90.44%。
[0046]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種煙啼磺隆降解菌，其特征在于，所述煙啼磺隆降解菌為假單胞菌Pseudomonassp，保藏號(hào)為CGMCC N0.11523。2.—種如權(quán)利要求1所述煙嘧磺隆降解菌在受煙嘧磺隆污染土壤的微生物修復(fù)中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求1所述的煙嘧磺隆降解菌，其特征在于，所述煙嘧磺隆降解菌的篩選方法包括:步驟一，菌源采自使用煙嘧磺隆的玉米田土壤，采集距表層2-6cm的土壤樣品6份；步驟二，稱取1g土樣加入到20ml無菌蒸餾水中，充分打散，靜置后取5ml上清液接種于45ml含50mg/L煙嘧磺隆的MSM培養(yǎng)基中，于32°C、150rpm培養(yǎng)7天；MSM培養(yǎng)基成分(g/L)NH3NO30.5；K2HPO4.3H20 1.05KH2PO41.05MgSO4.7H20 0.1；NaCl 0.2；CaCl2.6H2O 0.02,pH7.0； 步驟三，取培養(yǎng)液5ml轉(zhuǎn)接至新鮮MSM培養(yǎng)基中，煙嘧磺隆濃度提高至100mg/L，同樣條件下培養(yǎng)7天，然后取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新鮮MSM培養(yǎng)基中，如此反復(fù)6次，其中煙嘧磺隆濃度分別為50、100、150、200、250、3001^/1;將含煙嘧磺隆30011^/1的培養(yǎng)液按不同比例梯度稀釋，分別涂布于含煙嘧磺隆50mg/L的MSM平板上，32°C培養(yǎng)5天，挑取邊緣清晰的菌落，經(jīng)反復(fù)平板劃線純化直到獲得單菌落，并分別進(jìn)行煙嘧磺隆降解能力測(cè)試； 步驟四，確定各菌株降解能力后，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面保藏降解性能優(yōu)良的菌株； 步驟五，菌株的鑒定。4.如權(quán)利要求3所述的煙嘧磺隆降解菌，其特征在于，所述菌株的鑒定具體包括: 第一步，煙嘧磺隆降解菌NSA02的菌落形態(tài)特征及生理生化特征:將已充分活化的菌株NSA02接種到LB培養(yǎng)基平板上，生長48h后觀察菌落呈圓形，乳白色，較粘稠，表面光滑，中心關(guān)起； 第二步，菌株NSA02的16s rDNA鑒定:序列擴(kuò)增采用正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，反向引物5 ’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ’，以細(xì)菌總DNA為模板，PCR反應(yīng)程序如下:95°(:變性5111丨11，951€308，531€308，721€908，共35個(gè)循環(huán)；72°(:10111丨11，41€保存，將得到的16S rRNA序列登錄GenBank，進(jìn)行Blast同源比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，初步鑒定菌株NSA02為假單胞菌Pseudomonas spD
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK105838638SQ201610022181
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年1月13日
【發(fā)明人】趙浩宇, 周小剛, 高菡, 朱建義, 劉勝男
【申請(qǐng)人】四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所