一種新的TGF-β信號通路在如皋黃雞雄性生殖細胞分化過程中功能驗證方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的TGF?β信號通路在如皋黃雞雄性生殖細胞分化過程中功能驗證方法：首先基于RNA?seq數(shù)據(jù)源進行關鍵信號通路富集并篩選；利用TGFβ受體抑制劑:LY2109762，BMP4受體抑制劑:LDN193189在體內和體外兩個水平對TGF?β信號通路進行抑制以驗證該通路在雞雄性生殖細胞分化過程中的具體功能；設計LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4實驗組進行實驗，實驗過程中每個1d，取樣一次。檢測Smad2，Smad5的表達變化以及生殖標記基因的表達變化，利用間接免疫熒光和FACS檢測各分組中細胞誘導后interginα6+interginβ1+細胞數(shù)量；采用雞胚注射方式將抑制劑注射雞胚，設計實驗組：Y2109762，LDN193189以及Double組，孵化過程中于4d和18d取樣，檢測Smad2，Smad5的表達變化以及生殖標記基因的表達變化，利用組織免疫化學和FACS檢測各分組中18d后睪丸中interginα6+interginβ1+細胞數(shù)量。
【專利說明】
一種新的TGF-β信號通路在如皋黃雞雄性生殖細胞分化過程中功能驗證方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及干細胞工程、珍稀物種的保存和組織與細胞工程等領域。
【背景技術】
[0002]胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)向雄性生殖細胞分化研究不僅為研究生殖細胞發(fā)生、增殖及分化等分子機制和遺傳修飾提供了最佳的細胞模型，也為家畜遺傳資源保護、轉基因動物生產、生殖疾病的治療及再生醫(yī)學提供新的思路與途徑。目前，研究者們已通過細胞因子、化學試劑、轉基因等方法將ESCs誘導分化成的原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)和精原干細胞(Spermatogonial Stem cells’SSCs)，但關于這一過程的調控信號網(wǎng)絡知之甚少，有關生殖細胞發(fā)生和分化機制的研究已成為近年來備受關注的焦點。ESCs向生殖細胞的分化受到許多內源因子和外源因素的調控，這些因子通過不同的信號通路，構成調控網(wǎng)絡，直接或間接地調控生殖細胞的形成。目前，對參與生殖細胞的形成的信號調控已有一定認識，研究表明TGF-0/BMP、Notch、Wnt、MAPK、PI3K/AKT、⑶NF、hedgeh0g等信號參與了生殖細胞的分化和發(fā)育過程。
[0003]TGF-0(transforming growth factorf，轉化生長因子)蛋白超家族包括TGF_0s、骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins ,BMPs)和細胞活素(Activin)等，是一類有保守結構域的二聚體蛋白，其受體均為絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，其中Smads(mothersagainstdecapentaplegic)信號蛋白是其下游重要的信號分子，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、分化和細胞基質形成等方面發(fā)揮重要的生物學功能。目前對TGF-β信號通路在生殖細胞形成、維持與分化等過程中的作用已有報道。E.Kawase等研究表明，TGF-β經(jīng)典通路對雄性生殖干細胞維持起到關鍵作用;Y.0hinata等報道BMP/smad對生殖細胞發(fā)育發(fā)揮重要的作用，BMP4基因敲除可導致PGCs缺失;X.J.Zhang等研究表明Smad4蛋白在睪丸生殖細胞的細胞質中廣泛表達，并通過BMP信號調控睪丸發(fā)育和精子發(fā)生;C.M.Denise等通過抑制TGF-β下游信號ALK4，ALK5和ALK7，表明TGF-β信號對睪丸索的形成起關鍵作用，ALK4和ALK7通過Activin/NODAL受體的信號，可以促進雄性生殖細胞的分化。雖然大量研究表明TGF-β信號通路在哺乳動物生殖細胞分化過程中起重要作用，但是鳥類的相關研究較少。
[0004]盡管TGF-β信號通路在生殖細胞的發(fā)生等方面的研究已取得一定進展，但它們如何參與生殖細胞的體內發(fā)生機制還未闡明且在鳥類尚未有研究。本方法首先利用RNA-seq技術分析了 TGF-β信號在雞ESCs、PGCs和SSCs三種細胞中的表達情況，并從體內和體外水平分別對TGFP通路進行抑制，通過Western blot、QRT_PCR檢測下游分子的表達情況，并采用免疫熒光化學、流式細胞術等方法檢測生殖細胞體內及體外分化情況，探討了 TGFP信號通路在雞ESCs向雄性生殖細胞分化過程中的作用，為構建雞雄性生殖細胞分化的調控網(wǎng)絡，揭示生殖細胞形成機制提供實驗基礎。
[0005]鳥類有別于哺乳動物的生殖方式是本方法成功應用的前提:鑒于雞獨特的胚胎發(fā)育過程，可從囊胚中獲得大量的ESCs，極大滿足了人類研究和生產實踐的需要，而且雞為卵生動物，可以在發(fā)育的任何時期，進行雞胚注射等多種體外操作。
[0006]然而有優(yōu)點就會有缺陷，本方法中雞胚注射實驗的效果取決于抑制劑注射后的隨機擴散程度，這可能會影響部分實驗進程。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明目的在于為人們提供一種新的TGF-β信號通路在如皋黃雞雄性生殖細胞分化過程中功能驗證方法。
[0008]本發(fā)明包括以下步驟:
[0009](I)基于RNA-seq數(shù)據(jù)對TGF-β信號通路富集；
[0010]取新鮮受精蛋，依次用新潔爾滅、75%酒精洗蛋表面，用鑷子將蛋鈍頭敲碎，藥勺法無菌取出胚盤，將胚盤放入PBS中漂洗3遍獲取ESC細胞；
[0011 ]取孵化至4.5d的受精蛋，用新潔爾滅、75 %酒精洗蛋表面;無菌獲雞胚，PBS中漂洗3次，體視顯微鏡下剝取生殖脊，利用胰酶進行消化，消化液用400目濾布過濾入離心管中，I000 X g離心6min，因子培養(yǎng)基懸浮，獲取PGC細胞；
[0012]取孵化至18d的受精蛋，用新潔爾滅、75%酒精洗蛋表面;無菌獲取睪丸，PBS中漂洗3次，通過膠原酶、胰酶兩步消化法對睪丸進行消化，消化液用400目濾布過濾入離心管中，I 000X g離心8min，因子培養(yǎng)基懸浮，獲取SSC細胞；
[0013]并分別提取ESC、PGC和SSC的RNA，構建測序文庫并用Illumina HiSeqTM2000進行測序;對測序后的差異基因進行pathway富集并對TGF-β信號通路進行篩選；
[0014](2)TGF_i3信號通路初步分析；
[0015]對TGF-β信號信號通路上差異基因在ESC，PGC和SSC中的表達變化進行分析，初步確定該信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程調控作用以及該信號通路信號傳遞機制；
[0016](3)體外驗證TGF-β信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程中的功能；
[0017]取正常發(fā)育的雞胚，分組情況如下:對照組:正常ESCs，添加普通培養(yǎng)基；實驗組:①BMP4(40ng/ml)；②BMP4(40ng/ml) +TGF0受體抑制劑(LY2109762);③BMP4(40ng/ml) +BMP4受體抑制劑(LDN193189);④BMP4(4Ong/ml)+TGF0受體抑制劑+BMP4受體抑制劑。細胞在誘導培養(yǎng)過程中每個I天取樣一次同時進行如下實驗:
[0018]a.形態(tài)觀察及鑒定:采用倒置顯微鏡，比較實驗組與對照組細胞的分化情況的差異。間接免疫熒光對誘導后的細胞進行表面蛋白檢測；b.基因檢測:各組細胞處理0d、2d、4(1、6(1、8(1、10(1、12(1、14(1后，收集細胞，01?1'-?0?檢測生殖細胞的表達情況和了6?-|3信號通路受體基因的表達情況;c.蛋白檢測:各組細胞處理Od、2d、4d、6d、8d、I Od、12d、14d后，收集細胞，western檢測生殖標記蛋白的表達情況和TGF-β信號通路受體蛋白的表達情況;d.流式細胞分析:收集將各組誘導后的細胞，流式細胞法統(tǒng)計細胞的分化效率(生殖細胞標記基因陽性細胞)。
[0019](4 )GFi3信號通路調控ESCs向雄性生殖細胞分化功能的體內驗證；
[0020]取正常發(fā)育的雞胚，分組情況如下，空白組:正常雞胚，不經(jīng)任何處理，直接孵化；對照組:通過開窗將胚盤暴露，注射等量ddH20，再將窗口封閉，進行孵化;實驗組:將候選信號通路抑制劑注射到胚盤中，再將窗口封閉，進行孵化;①TGFP受體抑制劑(LY2109762);②BMP4受體抑制劑(LDN193189);③TGF0受體抑制劑+BMP4受體抑制劑。雞胚孵化過程中于0h，132h以及18d取樣并進行如下實驗。a.免疫組織化學:同時分別收集雞胚發(fā)育過程中Oh(對照)、72h(PGCs開始迀移至生殖嵴)、132h(PGCs已全部迀移至生殖嵴)、以及18d的睪丸樣本，通過組織切片法結合免疫組織化學法統(tǒng)計雞胚發(fā)育至0h、132h PGCs的數(shù)量及形態(tài)變化，以及18d SSCs的數(shù)量及形態(tài)變化，并與正常發(fā)育條件下進行比較。b.基因檢測:對上述收集的樣本通過QRT-PCR檢測生殖標記基因表達情況和TGF-β信號通路受體基因的表達情況。c.蛋白表達:對上述收集的樣本通過western檢測生殖標記蛋白表達情況和和TGF-β信號通路受體蛋白的表達情況。
[0021]本方法的發(fā)明，主要為了提供一種新的TGF-β信號通路在如皋黃雞雄性生殖細胞分化過程中功能驗證方法。
[0022]采用本方法，能夠實現(xiàn)在雞胚胎干細胞水平完成信號通路功能的驗證，這是目前在其他物種中無法完成的一種新方法。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)越性在于:
[0024]1、能夠較快的在的雞生殖細胞水平完成信號通路功能的驗證。
[0025]2、方法簡單易行，可重復性強，在普通實驗室即可進行。
[0026]3、開辟了一條新的在未建系的雞胚胎干細胞水平進行信號通路功能驗證的方法。
[0027]4、該方法體外實驗適用于其他物種，但是體內實驗不適用于其他。
[0028]通過本發(fā)明，首先基于RNA-seq數(shù)據(jù)源進行關鍵信號通路富集并篩選，對篩選的TGF-β信號通路中差異表達基因進行分析，初步確定該信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程中的調控作用以及信號轉導方式；利用TGFP受體抑制劑(LY2109762)，BMP4受體抑制劑(LDN193189)在體內和體外兩個水平對TGF-β信號通路進行抑制以驗證該通路在雞雄性生殖細胞分化過程中的具體功能;在體外實驗過程中以本實驗室前期建立的BMP4誘導體系為陽性對照，自分化體系為空白對照，設計LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4實驗組進行實驗，實驗過程中每個ld，取樣一次。采用qRT-PCR和Western Blot實驗檢測Smad2，Smad5的表達變化以及生殖標記基因的表達變化，同時利用間接免疫熒光和FACS檢測各分組中細胞誘導后intergina6+intergin01+細胞數(shù)量;在體內實驗過程中以正常孵化過程為陽性對照，采用雞胚注射的方式將抑制劑注射雞胚，設計實驗組:Y2109762，LDN193189以及Double組，孵化過程中于4d和18d取樣，采用qRT-PCR和Western Blot實驗檢測Smad2，Smad5的表達變化以及生殖標記基因的表達變化，同時利用組織免疫化學和FACS檢測各分組中18d后睪丸中intergina6+intergin01+細胞數(shù)量。
[0029]本方法簡單易行，可重復性強，在普通實驗室即可進行。運用該方法可以快速、高效在短時間內完成一條信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程中調控功能的驗證。
【附圖說明】
[0030]圖1為基于RNA-Seq數(shù)據(jù)中差異表達基因對雞雄性生殖細胞分化過程中關鍵信號通路進行富集并篩選圖。
[0031 ] 圖2為LY2109762和LDN193189抑制劑對TGF-β信號通路抑制示意圖。
[0032]圖3為TGFI3信號抑制后smads在不同處理組誘導細胞中的表達圖。
[0033]圖4為TGFP信號通路體外驗證，不同處理組誘導不同天數(shù)細胞形態(tài)變化圖。
[0034]圖5為TGFP信號通路體外驗證免疫細胞化學檢測蛋白表達情況圖。
[0035]圖6為TGF0信號通路體外驗證，QRT-PCR檢測不同處理組誘導不同天數(shù)相關基因變化情況圖。
[0036]圖7為TGFP信號通路體外驗證，流式細胞檢測體外誘導過程中相關蛋白表達圖。
[0037]圖8為TGFI3信號抑制后smads在體內發(fā)育5.5d、18d性腺中的表達圖；
[0038]圖9為TGFI3信號通路體內驗證，QRT-PCR檢測法雞胚發(fā)育5.5d和18d生殖細胞標記基因的表達情況圖。
[0039]圖10為TGFI3信號通路體內驗證，式細胞檢測圖。
【具體實施方式】
[0040](I)基于RNA-seq數(shù)據(jù)對TGF-β信號通路富集；
[0041]取新鮮受精蛋，依次用新潔爾滅、75%酒精洗蛋表面，用鑷子將蛋鈍頭敲碎，藥勺法無菌取出胚盤，將胚盤放入PBS中漂洗3遍獲取ESC細胞；
[0042]取孵化至4.5d的受精蛋，用新潔爾滅、75 %酒精洗蛋表面;無菌獲雞胚，PBS中漂洗3次，體視顯微鏡下剝取生殖脊，利用胰酶進行消化，消化液用400目濾布過濾入離心管中，I
000X g離心6min，因子培養(yǎng)基懸浮，獲取PGC細胞；
[0043]取孵化至18d的受精蛋，用新潔爾滅、75%酒精洗蛋表面;無菌獲取睪丸，PBS中漂洗3次，通過膠原酶、胰酶兩步消化法對睪丸進行消化，消化液用400目濾布過濾入離心管中，I 000X g離心8min，因子培養(yǎng)基懸浮，獲取SSC細胞；
[0044]并分別提取ESC、PGC和SSC的RNA，構建測序文庫并用Illumina HiSeqTM2000進行測序;對測序后的差異基因進行pathway富集并對TGF-β信號通路進行篩選；
[0045](2)TGF_i3信號通路初步分析；
[0046]對TGF-β信號信號通路上差異基因在ESC，PGC和SSC中的表達變化進行分析，初步確定該信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程調控作用以及該信號通路信號傳遞機制；
[0047](3)體外驗證TGF-β信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程中的功能；
[0048]取正常發(fā)育的雞胚，分組情況如下:對照組:正常ESCs，添加普通培養(yǎng)基；實驗組:①BMP4(40ng/ml)；②BMP4(40ng/ml) +TGF0受體抑制劑(LY2109762);③BMP4(40ng/ml) +BMP4受體抑制劑(LDN193189);④BMP4(4Ong/ml)+TGF0受體抑制劑+BMP4受體抑制劑。細胞在誘導培養(yǎng)過程中每個I天取樣一次同時進行如下實驗:a.形態(tài)觀察及鑒定:采用倒置顯微鏡，比較實驗組與對照組細胞的分化情況的差異。間接免疫熒光對誘導后的細胞進行表面蛋白檢測;b.基因檢測:各組細胞處理Od、2d、4d、6d、8d、I Od、12d、14d后，收集細胞，QRT-PCR檢測生殖細胞的表達情況和TGF-β信號通路受體基因的表達情況;c.蛋白檢測:各組細胞處理0(1、2(1、4(1、6(1、8(1、10(1、12(1、14(1后，收集細胞，'\￥6 8七61'11檢測生殖標記蛋白的表達情況和TGF-β信號通路受體蛋白的表達情況;d.流式細胞分析:收集將各組誘導后的細胞，流式細胞法統(tǒng)計細胞的分化效率(生殖細胞標記基因陽性細胞)。
[0049 ] (4) TGFI3信號通路調控ESCs向雄性生殖細胞分化功能的體內驗證；
[0050]取正常發(fā)育的雞胚，分組情況如下，空白組:正常雞胚，不經(jīng)任何處理，直接孵化；對照組:通過開窗將胚盤暴露，注射等量ddH20，再將窗口封閉，進行孵化;實驗組:將候選信號通路抑制劑注射到胚盤中，再將窗口封閉，進行孵化;①TGFP受體抑制劑(LY2109762);②BMP4受體抑制劑(LDN193189);③TGF0受體抑制劑+BMP4受體抑制劑。雞胚孵化過程中于0h，132h以及18d取樣并進行如下實驗。a.免疫組織化學:同時分別收集雞胚發(fā)育過程中Oh(對照)、72h(PGCs開始迀移至生殖嵴)、132h(PGCs已全部迀移至生殖嵴)、以及18d的睪丸樣本，通過組織切片法結合免疫組織化學法統(tǒng)計雞胚發(fā)育至0h、132h PGCs的數(shù)量及形態(tài)變化，以及18d SSCs的數(shù)量及形態(tài)變化，并與正常發(fā)育條件下進行比較。b.基因檢測:對上述收集的樣本通過QRT-PCR檢測生殖標記基因表達情況和TGF-β信號通路受體基因的表達情況。c.蛋白表達:對上述收集的樣本通過western檢測生殖標記蛋白表達情況和和TGF-β信號通路受體蛋白的表達情況。
[0051]本發(fā)明中，圖1，基于RNA-Seq數(shù)據(jù)中差異表達基因對雞雄性生殖細胞分化過程中關鍵信號通路進行富集并篩選。篩選結果表明TGF-β等信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程中有重要調控作用。
[0052]圖2 LY2109762和LDN193189抑制劑對TGF-β信號通路抑制示意圖。
[0053]圖3 TGF0信號抑制后smads在不同處理組誘導細胞中的表達。LY-100組與LDN-100組smad2和smad5的蛋白和基因水平的表達顯著降低，雙抑制組則顯著低于單抑制組。A:western blot檢測;B:qRT_PCR檢測。
[0054]圖4 TGFP信號通路體外驗證:不同處理組誘導不同天數(shù)細胞形態(tài)變化。
[0055]圖5TGFP信號通路體外驗證免疫細胞化學檢測蛋白表達情況。免疫細胞化學檢測蛋白表達情況，信號通路抑制后生殖樣細胞陽性克隆顯著的減少。BMP4誘導組誘導后的細胞表達integrina6、integrin01、Dazl、C_kit蛋白，單抑制組僅有少量細胞表達c_kit蛋白，雙抑制組未檢測到以上蛋白。
[0056]圖6 TGFP信號通路體外驗證:QRT-PCR檢測不同處理組誘導不同天數(shù)相關基因變化情況。
[0057]圖7TGFP信號通路體外驗證，流式細胞檢測體外誘導過程中相關蛋白表達。
[0058]圖8 TGF0信號抑制后smads在體內發(fā)育5.5d、18d性腺中的表達；
[0059]圖9 TGFI3信號通路體內驗證，QRT-PCR檢測法雞胚發(fā)育5.5d和18d生殖細胞標記基因的表達情況，結果表明，生殖特異基因(3_1^1:、(^11、0321、51:瓜8、;[1^681'；[11€[6在各抑制組的表達量顯著低于空白組和對照組，雙抑制組與單抑制組差異不顯著；integrinW的表達在各組間差異不顯著。
[0060]圖10 TGFI3信號通路體內驗證:式細胞檢測結果表明:5.5d，各抑制組c-kit陽性細胞比例較對照組顯著減少；18d，各抑制組integrina6陽性細胞比例也顯著少于對照組;且雙抑制組的c-kit和integrina6陽性細胞的比例均低于單抑制組。
【主權項】
1.一種新的TGF-β信號通路在如皋黃雞雄性生殖細胞分化過程中功能驗證方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)基于RNA-seq數(shù)據(jù)對TGF-β信號通路富集； 取新鮮受精蛋，依次用新潔爾滅、75 %酒精洗蛋表面，用鑷子將蛋鈍頭敲碎，藥勺法無菌取出胚盤，將胚盤放入PBS中漂洗3遍獲取ESC細胞； 取孵化至4.5d的受精蛋，用新潔爾滅、75%酒精洗蛋表面;無菌獲雞胚，PBS中漂洗3次，體視顯微鏡下剝取生殖脊，利用胰酶進行消化，消化液用400目濾布過濾入離心管中，1000× g離心6min，因子培養(yǎng)基懸浮，獲取PGC細胞； 取孵化至18d的受精蛋，用新潔爾滅、75%酒精洗蛋表面;無菌獲取睪丸，PBS中漂洗3次，通過膠原酶、胰酶兩步消化法對睪丸進行消化，消化液用400目濾布過濾入離心管中，1000×g離心8min，因子培養(yǎng)基懸浮，獲取SSC細胞； 并分別提取ESC、PGC和SSC的RNA，構建測序文庫并用Illumina HiSeqTM2000進行測序；對測序后的差異基因進行pathway富集并對TGF-β彳目號通路進行篩選； (2)TGF_i3信號通路初步分析； 對TGF-β信號信號通路上差異基因在ESC，PGC和SSC中的表達變化進行分析，初步確定該信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程調控作用以及該信號通路信號傳遞機制； (3)體外驗證TGF-β信號通路在雞雄性生殖細胞分化過程中的功能 取正常發(fā)育的雞胚，分組情況如下:對照組:正常ESCs，添加普通培養(yǎng)基；實驗組:①BMP4 ；② BMP4+LY2109762 ；③ BMP4+LDN193189 ；④ BMP4+LY2109762+LDN193189 ；細胞在誘導培養(yǎng)過程中每個I天取樣一次同時進行如下實驗: a.形態(tài)觀察及鑒定:采用倒置顯微鏡，比較實驗組與對照組細胞的分化情況的差異，間接免疫熒光對誘導后的細胞進行表面蛋白檢測； b.基因檢測:各組細胞處理Od、2d、4d、6d、8d、1d、12d、14d后，收集細胞，QRT-PCR檢測生殖細胞的表達情況和TGF-β信號通路受體基因的表達情況； (3.蛋白檢測:各組細胞處理0(1、2(1、4(1、6(1、8(1、10(1、12(1、14(1后，收集細胞，￥68丨6?1檢測生殖標記蛋白的表達情況和TGF-βΙ目號通路受體蛋白的表達情況； d.流式細胞分析:收集將各組誘導后的細胞，流式細胞法統(tǒng)計細胞的分化效率； (4 )TGFi3信號通路調控ESCs向雄性生殖細胞分化功能的體內驗證； 取正常發(fā)育的雞胚，分組情況如下，空白組:正常雞胚，不經(jīng)任何處理，直接孵化;對照組:通過開窗將胚盤暴露，注射等量ddH20，再將窗口封閉，進行孵化;實驗組:將候選信號通路抑制劑注射到胚盤中，再將窗口封閉，進行孵化；①LY2 109762 ;②LDN193 189 ；③LY2109762+LDN193189； 雞胚孵化過程中于0h，132h以及18d取樣并進行如下實驗； .3.免疫組織化學:同時分別收集雞胚發(fā)育過程中011、7211、13211、以及18(1的睪丸樣本，通過組織切片法結合免疫組織化學法統(tǒng)計雞胚發(fā)育至0h、132h PGCs的數(shù)量及形態(tài)變化，以及.18d SSCs的數(shù)量及形態(tài)變化，并與正常發(fā)育條件下進行比較； b.基因檢測:對上述收集的樣本通過QRT-PCR檢測生殖標記基因表達情況和TGF-β信號通路受體基因的表達情況； c.蛋白表達:對上述收集的樣本通過western檢測生殖標記蛋白表達情況和和TGF-β信號通路受體蛋白的表達情況。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838667SQ201610252413
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】張亞妮, 左其生, 李碧春, 王穎潔, 湯貝貝, 李 東, 紀艷芹, 連超, 王飛, 路鎮(zhèn)宇
【申請人】揚州大學