一種產(chǎn)脲酶菌株的固定化及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)脲酶菌株的固定化及其應(yīng)用，固定生產(chǎn)脲酶的根瘤菌屬細(xì)菌，并將其應(yīng)用于清除食品尿素中。本發(fā)明研究了細(xì)胞固定化的最適條件以及游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞的最適pH、最適溫度、溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，用響應(yīng)面方法優(yōu)化固定化細(xì)胞的最優(yōu)條件為：1.96％瓊脂，1.42％細(xì)胞和pH 9.0，固定化后，細(xì)胞的脲酶活性提高了約1.5倍，最適反應(yīng)溫度由40℃上升到50℃。最后還研究了固定化細(xì)胞在清除尿素中的應(yīng)用，尿素清除實驗顯示固定化細(xì)胞對部分酒類和牛奶具有良好的效果。將固定化的菌株細(xì)胞加入到5種市售的產(chǎn)品中，在35℃保溫24小時，結(jié)果顯示，10％?92.8％的尿素可以被清除，具有良好的應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種產(chǎn)脲酶菌株的固定化及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及到一種產(chǎn)脲酶菌株的固定化及其應(yīng)用于食品中尿素清除技術(shù)領(lǐng)域，具 體涉及一種根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞固定化，游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞的脲酶特性及其在尿素清除中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙酯(EC)是一種致癌物質(zhì)，廣泛存在于發(fā)酵食品中，如醬油，面包，奶酪 以及酒精飲料。在酒精制品的發(fā)酵和存儲過程中，尿素被認(rèn)為是EC的主要前體物質(zhì)，它可以 同乙醇反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成EC。因此，控制酒精制品中的尿素含量是減少EC含量的關(guān)鍵步驟。根據(jù) 相關(guān)報道以及實際的應(yīng)用情況，通過添加脲酶來分解尿素是降解食品中尿素含量的有效方 法。本專利中，從麥田土壤篩選獲得一種產(chǎn)脲酶的菌株，16S rDNA鑒定為Agrobacterium tumefaciens，是一種安全微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明彌補了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出以固定脲酶菌株的方式代替直接固定脲 酶，并將固定化脲酶菌株細(xì)胞應(yīng)用于食物中的尿素清除。
[0004] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
[0005] -種產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，按照下述步驟進(jìn)行：
[0006] 步驟一，篩選培養(yǎng)產(chǎn)脲酶的根瘤菌屬細(xì)菌，挑取單克隆菌株接種到液體培養(yǎng)基中， 形成具有產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞的種子液；
[0007] 步驟二，調(diào)整種子液pH值為4-11，20_50°C發(fā)酵形成發(fā)酵液，檢測發(fā)酵液中脲酶酶 活力；
[0008] 步驟三，收集發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0)，將 懸浮細(xì)胞液加入到細(xì)胞固定化載體中，混勻后放入4°C冷卻硬化形成固定化脲酶菌株細(xì)胞；
[0009] 步驟四，將固定化脲酶菌株細(xì)胞分割成小體積并檢測脲酶酶活力。
[0010] 所述步驟二中，產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞脲酶活性的最適pH值為7.0-10.0，優(yōu)選9.0。
[0011] 所述步驟二中，產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞脲酶活性的最適溫度為30-50°C，優(yōu)選40°C。
[0012] 所述步驟三中，細(xì)胞固定化載體為瓊脂，以瓊脂為載體的細(xì)胞固定化過程按照下 述步驟進(jìn)行：
[0013] 步驟(1)，收集發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0)，將 懸浮細(xì)胞液加入到融化并在40°C保溫的瓊脂膠中，混勻后倒入90mm直徑的平板中，放入4°C 冷卻硬化形成瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞；
[0014] 步驟(2)，將瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞切成小的塊狀膠體，塊狀膠體大小為2mm X 2_ X 1mm，檢測脲酶酶活力。
[0015] 所述步驟(1)中，細(xì)胞瓊脂固定化最適條件為瓊脂濃度為1.96 %，脲酶菌株細(xì)胞含 量為1.42%，pH值為9.0。
[0016]所述步驟(2)中，瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞脲酶活性的最適pH值為7.0-10.0,優(yōu) 選 9.0〇
[0017]所述步驟(2)中，瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞脲酶活性的最適溫度為40-60°C，優(yōu) 選 50°C。
[0018] 瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞在食品尿素清除中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：固定化后，細(xì)胞的脲酶活性提高了約1.5倍，最適反應(yīng)溫度 由40°C上升到50°C。固定化細(xì)胞在清除尿素中的應(yīng)用顯示，固定化細(xì)胞對部分酒類和牛奶 中的尿素清除具有良好的效果。向5種市售的產(chǎn)品中加入固定化細(xì)胞，在35°C保溫24小時， 結(jié)果顯示，清酒(韓國）的尿素清除率達(dá)到53.11%，黃酒的尿素清除率在39.81%到63.74% 不等（分別為：干型黃酒39.81%，半干型黃酒52.64%，半甜型黃酒63.74%)。值得一提的 是，該固定化細(xì)胞對牛奶中尿素的清除率達(dá)到了 92.81%。結(jié)果表明，本發(fā)明具有良好的應(yīng) 用價值。
【附圖說明】
[0020] 圖1是根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞生長曲線和產(chǎn)酶曲線。1是細(xì)胞生長曲線，2是細(xì)胞產(chǎn)酶曲 線。
[0021 ]圖2是細(xì)胞固定化優(yōu)化響應(yīng)面三維圖。（a):瓊脂濃度和細(xì)胞含量，（b):瓊脂濃度和 pH，（c):細(xì)胞含量和pH。
[0022] 圖3是瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞及產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞的酶學(xué)性質(zhì)。3a:pH對產(chǎn) 脲酶菌株游離細(xì)胞尿素活性的影響;3b: pH對瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞尿素活性的影響； 3c:溫度對產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞尿素活性的影響;3d:溫度對瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞尿 素活性的影響；1是產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞最適pH曲線；2是產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞pH穩(wěn)定性曲 線；3是產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞最適溫度曲線;4是產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞熱穩(wěn)定性曲線；5是瓊 脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞最適pH曲線;6是瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞pH穩(wěn)定性曲線；7是 瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞最適溫度曲線;8是瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞熱穩(wěn)定性曲線。
【具體實施方式】
[0023] 下面通過具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0024] 本發(fā)明所涉及的菌株包括根瘤菌屬，例如豌豆根瘤菌、苜蓿根瘤菌和百脈根瘤菌， 還包括根癌農(nóng)桿菌，另外還涉及一種從青島即墨麥田土壤篩選得到的脲酶菌株，菌株經(jīng)過 16S rDNA分析鑒定該菌為脲酶菌株Agrobacterium tumefaciens，是一種安全微生物。 [0025]對于本發(fā)明其具體步驟如下：
[0026] (1)脲酶菌株的篩選及培養(yǎng)
[0027]篩選培養(yǎng)產(chǎn)脲酶的脲酶菌株，涂布到S1平板放在37°C環(huán)境下培養(yǎng)24h，挑選具有紅 色顯色圈的菌株，再將挑選到的菌株接種到S2培養(yǎng)基中，挑選培養(yǎng)基變紅的菌株，將其在S1 平板上劃線，37°C培養(yǎng)后挑選具有紅色顯色圈的單克隆，接種到S3培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24h形成 種子液，取lmL種子液接種至lj40/250mL S4培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵產(chǎn)酶16h，并測酶活力。
[0028]其中，各類培養(yǎng)基成分如下：
[0029] S1 培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸和15g/L瓊脂；
[0030] S2培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸。
[0031] S3培養(yǎng)基：即LB培養(yǎng)基，10 · Og/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10 · Og/L NaCl。S4發(fā)酵培養(yǎng) 基：5g/L 葡萄糖，5g/L 蛋白胨，0.5g/L KH2P〇4,0.5g/L Na2HP〇4,0.05g/L MnS〇4.4H20， 0.05g/L Ni2S〇4 · 6H20,0.05g/L MgS〇4 · 7H20。
[0032] (2)脲酶菌株生長曲線和產(chǎn)酶特性
[0033] 在21個三角瓶中平行培養(yǎng)菌株0AH-01 (篩選后獲得菌株），每隔4h取出三瓶測菌體 濃度和酶活性。以確定最佳發(fā)酵時間。菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線見圖1。由圖可知，發(fā)酵時 間為16h時脲酶產(chǎn)量達(dá)到最大。
[0034] (3)產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞pH及溫度特性
[0035]本發(fā)明探究了在20-60°C和pH 4.0-11.0下產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞特性。產(chǎn)脲酶菌株 游離細(xì)胞最適pH為pH 9.0，在pH 5.0時保留60%以上的酶活力，在pH4.0時，脲酶活性降低 76%，但在pH 4.5時酶活保留與pH 5.0相似。產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞在pH 4.0到pH 11.0都很 穩(wěn)定，在pH6.0時穩(wěn)定性最好。
[0036]產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞的最適反應(yīng)溫度為40°C，在20-50°C之間，酶活力保持在60% 以上。在40°C以內(nèi)，酶活十分穩(wěn)定，但50°C保溫lh幾乎喪失所有酶活力。
[0037] (4)脲酶菌株細(xì)胞固定化過程
[0038]本發(fā)明采用全細(xì)胞固定的方法，將發(fā)酵液離心并收集菌體，復(fù)溶至Tris-HCl緩沖 液中（20mM，pH 7.0)形成懸浮細(xì)胞液，將懸浮細(xì)胞液加入到細(xì)胞固定化載體中，混勻后放入 4°C冷卻硬化形成固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞。
[0039] (5)細(xì)胞固定化載體的選擇
[0040] 本發(fā)明對細(xì)胞固定化載體進(jìn)行篩選，分別測試了瓊脂（3%，w/v)，明膠（10%，w/ v)，海藻酸鈣(3 %，w/v)，卡拉膠(3 %，w/v)和殼聚糖(2.5 %，w/v)固定化細(xì)胞的效果。
[0041] 在這5種固定化材料中，瓊脂、明膠和卡拉膠均制成膠狀并切成小的方塊，海藻酸 鈣和殼聚糖則用注射器制成小的球狀顆粒。挑選酶活力保留最高的材料作為固定化細(xì)胞的 載體。
[0042] 所有5種材料均熔化后在適當(dāng)溫度下與菌體混合，之后，檢測各種材料包埋下菌體 的脲酶活性。結(jié)果顯示，瓊脂包埋細(xì)胞具有最高的酶活性，其他的材料均不盡理想，海藻酸 鈣，卡拉膠和殼聚糖包埋的細(xì)胞均不表現(xiàn)酶活，而明膠機械強度不夠且在反應(yīng)過程中易溶 解(數(shù)據(jù)未列出）。因此，選擇瓊脂作為最佳的固定化載體。
[0043]瓊脂載體:為了使瓊脂保持液體狀態(tài)并保持酶的活性，將懸浮細(xì)胞加入到融化并 在40°C保溫的瓊脂膠中，混勻后倒入90mm直徑的平板中，放入4°C冷卻硬化形成瓊脂固定化 產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞。硬化后將瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞切成小的塊狀膠體，大小為2mmX 2mm X 1mm，檢測固定化脲酶活力。
[0044] (6)固定化條件優(yōu)化
[0045]固定化條件的優(yōu)化分為兩步:單因素實驗和響應(yīng)面實驗。實驗挑選了三個重要的 影響因素進(jìn)行試驗研究。單因素實驗中，分別選擇瓊脂濃度l%(w/v)-3%(W/v)，細(xì)胞含量 0.5 % (g/v) -1.25 % (g/v)和pH5.0-pH9.0探究單因素條件下的最優(yōu)值。
[0046]單因素實驗結(jié)束后，確定了響應(yīng)面實驗的中心點。基于此，設(shè)計3因素5水平的CCD 響應(yīng)面實驗，共20組，見表1。這20組實驗包含23個因子實驗，6組中心點和6組軸向點。根據(jù) 旋轉(zhuǎn)設(shè)計理論，a = F1 /4，F(xiàn) = 2k，k表示實驗的因素數(shù)，取a = 1.68。
[0047]響應(yīng)面實驗設(shè)計共20組實驗，最后得到二次多項回歸方程如下：Y =-532.53+ 137.27Χι+34.27X2+91.94X3-25.55Χι2-46.36X 22-5.04X32+16.14ΧιΧ2-6.72ΧιΧ 3+8.44X2X3[0048]其中Y表示預(yù)測的酶活力，Xi、X2、X3分別表示瓊脂濃度、細(xì)胞添加量和pH值。
[0049]如圖2所示，根據(jù)三維響應(yīng)面綜合考慮HX3三因素之間的交互影響并得出最優(yōu) 的固定化條件，模型獲得的最優(yōu)固定化條件為瓊脂濃度為1.96%(w/v)，細(xì)胞含量為1.42% (g/v)和pH 9.0,在預(yù)測的最優(yōu)條件下酶活為47.26U/g，實驗驗證也同預(yù)測值相吻合。
[0050] 表1響應(yīng)面實驗設(shè)計及響應(yīng)值
[0051]
(7)瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞pH及溫度特性
[0053]如圖3所示，本發(fā)明探究了在不同溫度和pH條件下瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞特 性，瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞反應(yīng)的最適pH為7.0-10.0，優(yōu)選9.0，最適溫度為40-60°C， 優(yōu)選50°C，在高溫時，相比于產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞具有更高的熱穩(wěn)定性，瓊脂固定化產(chǎn)脲酶 菌株細(xì)胞的脲酶活性要比產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞高出約1.5倍。對瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì) 胞進(jìn)行重復(fù)利用，在40°C，pH4.5條件下反應(yīng)八次后，瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞可以保留 51.3%的酶活力。
[0054] (8)本發(fā)明瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞用于食品中尿素的清除
[0055]本發(fā)明探究了瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞在模擬酒和市售商品中對尿素的清除 效果。實驗結(jié)果見表2。脲酶活性添加量為0.46U/mL。在pH4.5和pH5.0的模擬酒中，35°C反應(yīng) 24h，尿素清除率分別達(dá)到了98 %和100 %。對于市售的酒精商品，尿素清除率在10.0 %到 63.7%，不同產(chǎn)品去除率各有不同。鮮奶中含有最高的尿素含量，經(jīng)過瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌 株細(xì)胞處理，92.8 %的尿素得到清除。
[0056] 表2瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞應(yīng)用于食品中尿素的清除
[0057]
[0058] 實施例1:
[0059] -脲酶菌株篩選及固定化：
[0060] 1提取并篩選麥田土壤中的所述脲酶菌株Agrobacterium tumefaciens(CICC NO. 10914的保藏單位為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)酒仙 橋中路24號院6號樓，郵編100101，保藏時間：2014年8月17日，保藏編號:CICC N0.10914)。 [0061 ] 取lg青島即墨麥田土壤至無菌管中，加入10mL無菌生理鹽水，37°C震蕩2h，再用無 菌生理鹽水稀釋成不同的梯度（10-2-10-7)。分別取每個梯度生理鹽水200yL涂布到S1平板 上。將涂好的S1平板放在37°C環(huán)境下培養(yǎng)24h，挑選具有紅色顯色圈的菌株，再將挑選到的 菌株接種到S2培養(yǎng)基中，挑選培養(yǎng)基變紅的菌株，將其在S1平板上劃線，37°C培養(yǎng)后挑選具 有紅色顯色圈的單克隆，接種到S3培養(yǎng)基37 °C培養(yǎng)24h形成種子液。
[0062]其中，各類培養(yǎng)基成分如下：
[0063] S1 培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸和15g/L瓊脂；
[0064] S2培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸。
[0065] S3培養(yǎng)基：即LB培養(yǎng)基，10.0g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10.0g/L NaCl。
[0066] 2調(diào)整所述種子液pH值為7.0,取lmL種子液接種到40/250mL S4培養(yǎng)基中，30°C發(fā) 酵16h形成發(fā)酵液，測其酶活力；
[0067]其中，培養(yǎng)基成分如下：
[0068] S4發(fā)酵培養(yǎng)基：5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.5g/L KH2P〇4,0.5g/L Na2HP〇4,0.05g/ L MnS〇4 · 4H20,0.05g/L Ni2S〇4 · 6H20,0.05g/L MgS〇4 · 7H20。
[0069] 3收集所述發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0)，將所 述懸浮細(xì)胞液加入到融化并在40°C保溫的瓊脂膠中，瓊脂濃度為1.96%，所述脲酶菌株細(xì) 胞含量為1.42%，pH值為9.0，混勻后倒入90mm直徑的平板中，放入4°C冷卻硬化形成瓊脂固 定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞；
[0070] 4將所述瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞切成小的塊狀膠體，所述塊狀膠體大小為2mm X 2_ X 1mm，檢測脲酶酶活力。
[0071] 二瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞用于食品中尿素的清除：
[0072]用于模擬酒的尿素清除，模擬酒的脲酶活性添加量為0.461]/1^，？!14.5，將瓊脂固 定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞塊狀膠體混合入模擬酒中，調(diào)pH 7.0，40°C反應(yīng)24h，最終計算尿素清 除率達(dá)到98 %。
[0073] 實施例2:
[0074] 一脲酶菌株篩選及固定化：
[0075] 1篩選培養(yǎng)產(chǎn)脲酶的根癌農(nóng)桿菌，涂布到S1平板放在37°C環(huán)境下培養(yǎng)24h，挑選具 有紅色顯色圈的菌株，再將挑選到的菌株接種到S2培養(yǎng)基中，挑選培養(yǎng)基變紅的菌株，將其 在S1平板上劃線，37°C培養(yǎng)后挑選具有紅色顯色圈的單克隆，接種到S3培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24h 形成種子液。
[0076]其中，各類培養(yǎng)基成分如下：
[0077] S1 培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸和15g/L瓊脂；
[0078] S2培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸。
[0079] S3培養(yǎng)基：即LB培養(yǎng)基，10.0g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10.0g/L NaCl。
[0080] 2調(diào)整所述種子液pH值為10.0,取lmL種子液接種到40/250mL S4培養(yǎng)基中，50°C發(fā) 酵16h形成發(fā)酵液，測其酶活力；
[0081] 其中，培養(yǎng)基成分如下：
[0082] S4發(fā)酵培養(yǎng)基：5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.5g/L KH2P〇4,0.5g/L Na2HP〇4,0.05g/ L MnS〇4 · 4H20,0.05g/L Ni2S〇4 · 6H20,0.05g/L MgS〇4 · 7H20。
[0083] 3收集所述發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0)，將所 述懸浮細(xì)胞液加入到融化并在40°C保溫的瓊脂膠中，瓊脂濃度為1.96%，所述脲酶菌株細(xì) 胞含量為1.42%，pH值為9.0，混勻后倒入90mm直徑的平板中，放入4°C冷卻硬化形成瓊脂固 定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞；
[0084] 4將所述瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞切成小的塊狀膠體，所述塊狀膠體大小為2mm X 2_ X 1mm，檢測脲酶酶活力。
[0085] 二瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞用于食品中尿素的清除：
[0086] 用于鮮牛奶的尿素清除，將瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞塊狀膠體混合入鮮牛奶 中，調(diào)pH 10.0，60°C反應(yīng)24h，最終計算尿素清除率達(dá)到92.81 %。
[0087] 實施例3:
[0088] 一脲酶菌株篩選及固定化：
[0089] 1篩選培養(yǎng)產(chǎn)脲酶的豌豆根瘤菌，涂布在S1平板放在37°C環(huán)境下培養(yǎng)24h，挑選具 有紅色顯色圈的菌株，再將挑選到的菌株接種到S2培養(yǎng)基中，挑選培養(yǎng)基變紅的菌株，將其 在S1平板上劃線，37°C培養(yǎng)后挑選具有紅色顯色圈的單克隆，接種到S3培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)24h 形成種子液。
[0090]其中，各類培養(yǎng)基成分如下：
[0091] S1 培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸和15g/L瓊脂；
[0092] S2培養(yǎng)基d.Og/l蛋白胨，5.0g/L NaCl，0.1g//L葡萄糖，2.0g/L KH2P〇4,2.0g/L尿 素，12mg/L苯酸。
[0093] S3培養(yǎng)基：即LB培養(yǎng)基，10.0g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10.0g/L NaCl。
[0094] 2調(diào)整所述種子液pH值為9.0,取lmL種子液接種到40/250mL S4培養(yǎng)基中，40°C發(fā) 酵16h形成發(fā)酵液，測其酶活力；
[0095]其中，培養(yǎng)基成分如下：
[0096] S4發(fā)酵培養(yǎng)基：5g/L葡萄糖，5g/L蛋白胨，0.5g/L KH2P〇4,0.5g/L Na2HP〇4,0.05g/ L MnS〇4 · 4H20,0.05g/L Ni2S〇4 · 6H20,0.05g/L MgS〇4 · 7H20。
[0097] 3收集所述發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0)，將所 述懸浮細(xì)胞液加入到融化并在40°C保溫的瓊脂膠中，瓊脂濃度為1.96%，所述脲酶菌株細(xì) 胞含量為1.42%，pH值為9.0，混勻后倒入90mm直徑的平板中，放入4°C冷卻硬化形成瓊脂固 定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞；
[0098] 4將所述瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞切成小的塊狀膠體，所述塊狀膠體大小為2mm X 2_ X 1mm，檢測脲酶酶活力。
[0099] 二瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞用于食品中尿素的清除：
[0100] 用于黃酒(半甜型）的尿素清除，將瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞塊狀膠體混合入黃 酒(半甜型）中，調(diào)pH 9.0，50°C反應(yīng)24h，最終計算尿素清除率達(dá)到63.74%。
[0101] 以上對本發(fā)明的幾個實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施 例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn) 等，均應(yīng)仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:按照下述步驟進(jìn)行： 步驟一，篩選培養(yǎng)產(chǎn)脲酶的根瘤菌屬細(xì)菌，挑取單克隆菌株接種到液體培養(yǎng)基中，形成 具有產(chǎn)脲酶菌株游離細(xì)胞的種子液； 步驟二，調(diào)整所述種子液pH值為4-11，20-50°C發(fā)酵形成發(fā)酵液，檢測所述發(fā)酵液中脲 酶酶活力； 步驟三，收集所述發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0 )，將 所述懸浮細(xì)胞液加入到細(xì)胞固定化載體中，混勻后放入4°C冷卻硬化形成固定化脲酶菌株 細(xì)胞； 步驟四，將所述固定化脲酶菌株細(xì)胞分割成小體積并檢測脲酶酶活力。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:所述產(chǎn)脲酶菌株游離 細(xì)胞脲酶活性的最適pH值為7.0-10.0，優(yōu)選pH 9.0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:所述產(chǎn)脲酶菌株游離 細(xì)胞脲酶活性的最適溫度為30-50°C，優(yōu)選40°C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:所述細(xì)胞固 定化載體為瓊脂，以瓊脂為載體的細(xì)胞固定化過程按照下述步驟進(jìn)行： 步驟(1)，收集所述發(fā)酵液中的菌體，用緩沖液復(fù)溶形成懸浮細(xì)胞液(20mM，pH 7.0)，將 所述懸浮細(xì)胞液加入到融化并在40°C保溫的瓊脂膠中，混勻后倒入90mm直徑的平板中，放 入4°C冷卻硬化形成瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞； 步驟(2)，將所述瓊脂固定化產(chǎn)脲酶菌株細(xì)胞切成小的塊狀膠體，所述塊狀膠體大小為 2mm X 2mm X 1mm，檢測脲酶酶活力。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:所述細(xì)胞瓊脂固定化 最適條件為瓊脂濃度為1.96 %，所述脲酶菌株細(xì)胞含量為1.42 %，pH值為9.0。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:所述瓊脂固定化產(chǎn)脲 酶菌株細(xì)胞脲酶活性的最適pH值為7.0-10.0，優(yōu)選9.0。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法，其特征在于:所述瓊脂固定化產(chǎn)脲 酶菌株細(xì)胞脲酶活性的最適溫度為40°C-60°C，優(yōu)選50°C。8. 利用權(quán)利要求5-7中任一所述的產(chǎn)脲酶菌株固定化的方法制備的所述瓊脂固定化產(chǎn) 脲酶菌株細(xì)胞在食品尿素清除中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N11/10GK105838702SQ201610293206
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】毛相朝, 侯恩玲, 孫建安
【申請人】中國海洋大學(xué)