一種從福壽螺肌肉組織中提取總rna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法。包括以下步驟：（1）取新鮮福壽螺肌肉組織用DEPC水沖洗，放入液氮，在液氮條件下研磨成細(xì)粉狀，然后轉(zhuǎn)移到含有細(xì)胞裂解液的離心管中；（2）冰浴條件下，向步驟（1）中的離心管中加酸性水飽和酚，搖勻，加醋酸鈉，以及氯仿和異戊醇混合液，冰??；（3）離心，分離沉淀相和液相；（4）轉(zhuǎn)移液相到新的離心管中，加氯仿、異戊醇混合液；（5）離心，取上清，加等體積異丙醇沉淀；（6）離心，棄上清液，加1-1.5mL乙醇洗滌沉淀；（7）重復(fù)步驟（6）1-2次，空氣干燥，加50-100μL無(wú)RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌肉組織總RNA溶液。本發(fā)明收率高，并且純度高、質(zhì)量完整性好，可以滿(mǎn)足分子生物學(xué)研究應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及淡水軟體生物總RNA的提取，尤其涉及種從福 壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 總RNA (核糖核酸）分離純化技術(shù)是分子生物學(xué)研究技術(shù)的基礎(chǔ)，從組織中提取純 度穩(wěn)定、完整性好、重復(fù)性高、無(wú)污染的總RNA的分離純化方法，是決定后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量 的關(guān)鍵。
[0003] 福壽螺又名大瓶螺、蘋(píng)果螺，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域。1980年前后，因其蛋白 質(zhì)含量豐富，營(yíng)養(yǎng)成分高且繁殖能力強(qiáng)，而被作為一種水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物被引入臺(tái)灣、菲律賓和 日本，并迅速擴(kuò)散到東亞和東南亞其余國(guó)家（Halwart，1994)。后來(lái)由于市場(chǎng)化失敗，福壽 螺遭棄養(yǎng)并迅速擴(kuò)散結(jié)果暴發(fā)成災(zāi)，嚴(yán)重危害作物生產(chǎn)（Naylor，1996)。2000年，世界自 然保護(hù)耳關(guān)盟（World Conservation Union; International Union for Conservation of Nature and Natural Resources; IUCN)外來(lái)入侵物種專(zhuān)家委員會(huì)將福壽螺列為世界100種 惡性外來(lái)入侵物種之一（Lowe et al.，2000)，也是其中唯一的一種淡水螺。在我國(guó)大陸， 福壽螺于1981年引入到廣東養(yǎng)殖，1984年后在廣東、廣西、福建等地開(kāi)始廣泛養(yǎng)殖，隨后 推廣到浙江、江西、云南、四川等地，目前已成為長(zhǎng)江以南大部分省區(qū)的嚴(yán)重農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)（俞 曉平等，2001)。2003年，國(guó)家環(huán)?？偩趾椭袊?guó)科學(xué)院（2003)將福壽螺列入了首批入侵中 國(guó)的16種外來(lái)物種的"黑名單"。傳統(tǒng)的防治如農(nóng)業(yè)防治和物理防治外，如何從分子水平 上揭示福壽螺的入侵機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的防治途徑已經(jīng)成為福壽螺研究的重點(diǎn)。
[0004] 目前，有針對(duì)性的分離純化福壽螺組織總RNA的方法較少，用傳統(tǒng)方法提取的福 壽螺組織總RNA含量少，穩(wěn)定性差，容易污染，無(wú)法滿(mǎn)足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。
【發(fā)明內(nèi)容】
為了解決現(xiàn)有淡水軟體生物總RNA提取技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一 種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法，為福壽螺的分子生物學(xué)研究提供技術(shù)支持和保 障。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案完成： (1) 取新鮮福壽螺肌肉組織用DEPC水沖洗3-5次，放入液氮，在液氮條件下研磨成細(xì)粉 狀，然后轉(zhuǎn)移到含有〇. 3 - 0. 5mL細(xì)胞裂解液的離心管中； (2) 冰浴條件下，向步驟（1)中的離心管中加入酸性水飽和酚，搖勻，加0. 1-0. 2mL醋酸 鈉，0. 1-0. 2mL氯仿和異戊醇混合液，冰浴15min ; (3) 4°C離心，分離沉淀相和液相； (4) 轉(zhuǎn)移液相到新的離心管中，加等體積氯仿、異戊醇混合液； (5) 離心，取上清，加等體積異丙醇-20°C沉淀； (6) 離心，棄上清液，加1-1. 5mL75%乙醇洗滌沉淀； (7) 重復(fù)步驟（6) 1-2次，空氣干燥，加50-100 μ L無(wú) RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌 肉組織總RNA溶液。
[0006] 所述的細(xì)胞裂解液組成為：異硫氰酸胍：24重量份；十二烷基硫酸鈉0. 4重量份； 尿素0. 4重量份；氯化鈉0. 2重量份，加入25重量份DEPC水，定容至50體積；所述的水飽 和酚使用量為細(xì)胞裂解液的1/2 ;所述的氯仿、異戊醇混合液中的氯仿：異戊醇為24:1 ;所 述的醋酸鈉溶液的濃度為3mol/l，pH值為5. 2 ;所述的氯仿、異戊醇混合液的加入量與細(xì) 胞裂解液的體積相等；所述的離心速度為12000rpm。
[0007] 本發(fā)明適用于小量淡水軟體生物組織的RNA提取，方法簡(jiǎn)單有效，適合分子生物 學(xué)研究應(yīng)用。具體有益效果如下：1、操作步驟簡(jiǎn)單、方便。2、RNA得率高；3、RNA純度高。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1為本發(fā)明方法所提總RNA電泳圖。
[0009] 圖2為傳統(tǒng)Trizol法提取總RNA電泳圖。
[0010] 圖3為用本發(fā)明提取總RNA為模板，PCR電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明： 實(shí)施例所采用的試劑和設(shè)備 DEPC (焦碳酸二乙酯）水：雙蒸水中加0. 1%的DEPC搖勻后室溫過(guò)夜，再進(jìn)行高溫高壓 滅菌即可。
[0012] 細(xì)胞裂解液：準(zhǔn)確稱(chēng)取異硫氰酸胍24g,十二烷基硫酸鈉0. 4g,尿素0. 4g,氯 化鈉0. 2g，加入25mL高溫高壓滅菌處理過(guò)的DEPC水，再定容到50mL。
[0013] pH值為5. 2的3mol/L醋酸鈉溶液：無(wú)水醋酸鈉12. 42g，DEPC水30mL溶解，冰醋 酸調(diào)pH值到5. 2,加水定容至50mL。
[0014] 氯仿：異戊醇混合液：吸取24mL氯仿，加入lmL異戊醇混勻。
[0015] 75%乙醇：取75mL無(wú)水乙醇，加 DEPC水至100mL即得75%乙醇。
[0016] 實(shí)施例1 (1) 取新鮮福壽螺肌肉組織l〇〇mg用DEPC水沖洗3或5次，放入液氮，在液氮條件下研 磨成細(xì)粉狀，然后轉(zhuǎn)移到含有〇. 5mL細(xì)胞裂解液的離心管中； (2) 冰浴條件下，向步驟（1)中的離心管中加0. 25mL酸性水飽和酚，搖勻，加0. 05mL醋 酸鈉，再加〇. 5mL氯仿、異戊醇混合液，混勻，冰浴15min; (3) 4°C，12000rpm離心10min，分離沉淀相和液相； (4) 轉(zhuǎn)移液相到新的1. 5mL離心管中，加等體積氯仿、異戊醇混合液； (5) 4°C，12000rpm離心10min，取上清，將上清轉(zhuǎn)移到新的1. 5mL離心管中，加等體積異 丙醇-20°C沉淀30min ; (6) 4°C，12000rpm離心10min，棄上清液，沉淀加 lmL75%乙醇洗滌沉淀； (7) 重復(fù)步驟（6) 1或2次，空氣干燥，加無(wú) RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌肉組織總 RNA溶液。
[0017] 為了檢測(cè)所提總RNA的質(zhì)量，用1 %的瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)總 RNA的純度高（圖1 )、完整性較好，并且產(chǎn)量高.總RNA中的mRNA足以進(jìn)行Northern印 跡及雜交分析、cDNA合成等反應(yīng)，從電泳圖上可以看到提取出來(lái)的RNA沒(méi)有RNA的污染， 還可以很清楚的看到28S與18S的比值約為2 : 1，表明沒(méi)有RNA降解，且純度高。
[0018] 實(shí)施例2 各種實(shí)驗(yàn)方法的比較： 見(jiàn)下表
從上表可以看出，本發(fā)明所述RNA提取方法提取的RNA的0D260/0D280及0D260/0D230 的比值都在理想的范圍內(nèi)，而用傳統(tǒng)的Trizol提取法提取的淡水軟體生物福壽螺的RNA的 0D260/0D280及0D260/0D230的比值與標(biāo)準(zhǔn)值有一定差距。這說(shuō)明，本發(fā)明方法獲得的RNA 質(zhì)量更高，純度、完整度更好，能完全滿(mǎn)足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0019] 實(shí)施例3總RNA的逆轉(zhuǎn)錄及TSP基因的擴(kuò)增 采用上海生工生物提供的cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用本發(fā)明提取的福壽螺 肌肉組織總RNA為模板，利用隨機(jī)引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA.然后進(jìn)行PCR反應(yīng)， 反應(yīng)條件如下：94° C預(yù)變性3min;然后94° C變性30s，55° C退火30s，72° C延伸 lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后72° C延伸lOmin。所得的PCR產(chǎn)物均用1.0%的瓊脂糖凝膠 電泳分析。
[0020] 反應(yīng)體系如下： 10XPCR Buffer 5μ 1 dNTP Mixture (each 2. 5mM) 4 μ 1 模板DNA 2 μ 1 Primer F (10 μ Μ) 1 μ 1 Primer R (10 μ Μ) 1 μ 1 TaKaRa Taq (5U/μ 1) 0.25 μ 1 加 ddH20 Up to 50 μ 1 電泳結(jié)果如圖3,獲得了全長(zhǎng)2300bp左右的目標(biāo)片段。因此，用本發(fā)明方法提取的總 RNA獲得成功。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取新鮮福壽螺肌肉組織用DEPC水沖洗3-5次，放入液氮，在液氮條件下研磨成細(xì)粉 狀，然后轉(zhuǎn)移到含有〇. 3 - 0. 5mL細(xì)胞裂解液的離心管中； (2) 冰浴條件下，向步驟（1)中的離心管中加入酸性水飽和酚，搖勻，加0. 1-0. 2mL醋酸 鈉，0. 1-0. 2mL氯仿和異戊醇混合液，冰浴15min ; (3) 4°C離心，分離沉淀相和液相； (4) 轉(zhuǎn)移液相到新的離心管中，加等體積氯仿、異戊醇混合液； (5) 離心，取上清，加等體積異丙醇-20°C沉淀； (6) 離心，棄上清液，加1-1. 5mL75%乙醇洗滌沉淀； (7) 重復(fù)步驟（6) 1-2次，空氣干燥，加50-100 μ L無(wú) RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌 肉組織總RNA溶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞裂解液組成為： 異硫氰酸胍 24重量份， 十二烷基硫酸鈉 〇. 4重量份， 尿素 0. 4重量份， 氯化鈉 0. 2重量份， 加入25重量份DEPC水，定容至50體積。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水飽和酚使用量為細(xì)胞裂解液的 1/2。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氯仿和異戊醇混合液中的氯仿：異 戊醇為24:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醋酸鈉溶液的濃度為3mol/l，pH 值為5.2。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的氯仿和異戊醇混合液的加入量 與細(xì)胞裂解液的體積相等。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心速度為12000rpm。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DEPC為焦碳酸二乙酯。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105838707SQ201510021161
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年1月16日
【發(fā)明人】劉光富, 許益鵬, 楊倩倩
【申請(qǐng)人】中國(guó)計(jì)量學(xué)院