一種gs表達系統(tǒng)細胞株的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種GS表達系統(tǒng)細胞株的高通量篩選方法。在氨基亞砜蛋氨酸加壓后，選擇細胞活力在25％～35％的細胞池進行單克隆化篩選，將細胞池加入到含有10％條件培養(yǎng)基的半固體培養(yǎng)基上形成單克隆(細胞終濃度為150cells/mL)，再利用高通量細胞篩選系統(tǒng)篩選并擴大培養(yǎng)獲得高表達的細胞株，最后對篩選的高表達細胞株進行穩(wěn)定性評估。通過本發(fā)明方法，更容易獲得90％穩(wěn)定率以上的細胞株。
【專利說明】
_種GS表達系統(tǒng)細胞株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及細胞工程領(lǐng)域，具體來說，涉及一種GS表達系統(tǒng)細胞株的高通量篩選 方法。 技術(shù)背景
[0002] Lonza公司的谷氨酸合成酶(glutamine sythetase，GS)表達系統(tǒng)于1992年問世并 一直被改善，該系統(tǒng)是將外源基因插入到含有GS基因表達載體的下游，宿主細胞可以選擇 內(nèi)源性不表達GS基因的重組鼠骨髓瘤細胞NS0和GS基因敲除型的中國倉鼠卵巢細胞 CH0K1SV GS-K0,在細胞培養(yǎng)時添加 GS的抑制劑氨基亞砜蛋氨酸（methionine sulf〇Ximine，MSX)，使GS基因及與之相連的目的基因一起擴增，達到提高目的基因表達水 平的目的。至今，Lonza公司的GS表達系統(tǒng)在生物制藥行業(yè)已被廣泛應用，包括已經(jīng)上市的 Zenapax? (Roche)和Synagis? (Med immune) 〇
[0003] 細胞株篩選的目的在于獲得穩(wěn)定高產(chǎn)的細胞株，其衡量標準包括抗體表達量、產(chǎn) 品質(zhì)量、代謝穩(wěn)定性、細胞基質(zhì)穩(wěn)定性等。常規(guī)的篩選方法是:表達構(gòu)建體的構(gòu)建-轉(zhuǎn)染至 宿主細胞-加壓篩選獲得細胞池-細胞池 (cell pool)的單克隆化-高表達細胞株擴大培 養(yǎng)及篩選-細胞株的穩(wěn)定性評估。
[0004] 細胞池常規(guī)獲得的方法是：當表達構(gòu)建體被轉(zhuǎn)染到宿主細胞內(nèi)，直接用25~100μΜ 的MSX加壓，待細胞活力>95%后即為細胞池，或者是用前面提到的細胞池做流式細胞分選 表達量Τ0Ρ2~5 %的細胞，待細胞活力再次>95 %后即為細胞池 。一般來說，在同樣的培養(yǎng)環(huán) 境下，低表達細胞株將營養(yǎng)成分更多用在細胞生長上，故生長較快，而高表達細胞株生長較 慢，因此，以上提到的兩種活力>95%的細胞池在細胞活力逐漸恢復的過程中，大多數(shù)高表 達細胞株越長越慢，以至于喪失;而低表達細胞株越長越快;最終導致細胞池的高表達細胞 株含量低，低表達的細胞株含量高。同時，在細胞活力恢復的過程中，增加細胞傳代次數(shù)，據(jù) 實驗經(jīng)驗，每經(jīng)歷一次細胞活力恢復，細胞增加15~20Generat ions (Generation，世代，細 胞每倍增一次，稱為lGeneration)，影響細胞株的穩(wěn)定性。
[0005] 單克隆化篩選最常規(guī)的方法是有限稀釋（limiting dilution cloning，LDC)，低 成本且易于操作，即將細胞密度按照〈lcell/孔鋪至96孔板中，培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，大多 時候會按照需求添加一定比例的條件培養(yǎng)基(含有細胞生長因子），對細胞生長狀態(tài)要求極 高，活力〈90%的細胞池幾乎很難存活，克隆效率極低，即使單克隆化活力>95 %的細胞池， 克隆效率最高也僅有7 %左右，平均水平在3 %~4%，且操作繁瑣，工作量大，實驗周期長， 實驗效率低，無法實現(xiàn)高通量篩選。
[0006] 用半固體培養(yǎng)基法進行單克隆化篩選，它是將細胞池按照一定的密度鋪于半固體 培養(yǎng)基上形成單克隆，繼而挑選出來逐步擴大培養(yǎng)及篩選高表達細胞株。目前逐漸使用 Cl〇nePix2這類高通量篩選儀器在各種半固定培養(yǎng)基上進行高通量篩選，然而參照現(xiàn)有文 獻，如何提高克隆形成率及更快更易篩選出穩(wěn)定高表達細胞株一直是本領(lǐng)域的技術(shù)難點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種克隆形成率高且易于獲得穩(wěn)定高表達細胞株的高通量 篩選方法，該方法通過單克隆化低活力細胞池和在半固體培養(yǎng)基中加入條件培養(yǎng)基，從而 容易獲得穩(wěn)定高表達的細胞株。
[0008] 具體的，該方法是一種GS表達系統(tǒng)細胞株的高通量篩選方法，包含以下步驟：
[0009] (1)在氨基亞砜蛋氨酸MSX加壓后，選擇細胞活力在25 %~35 %的細胞池進行單克 隆化篩選；
[0010] (2)將步驟（1)所述的細胞池加入到含有10% (體積比）條件培養(yǎng)基和甲基纖維素 (0.9~1.5g/mL)的半固體培養(yǎng)基上形成單克隆，細胞終濃度為15〇cells/mL;
[0011] (3)利用高通量細胞篩選系統(tǒng)篩選細胞株；
[0012] (4)對步驟(3)中篩選出來的細胞株進行穩(wěn)定性評估；
[0013] 其中，步驟(2)所述條件培養(yǎng)基的制備方法為:取含GS空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的GS穩(wěn)定細胞株 進行批培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至密度在0.9X 107~1.1 X 107cells/mL之間且細胞活力>95%時，經(jīng) 過離心分離上清和細胞，取上清用膜過濾處理后待用。
[0014] 在一些實施方案中，所述GS表達系統(tǒng)為攜帶GS基因的并且GS基因下游插入了外源 基因的表達載體轉(zhuǎn)染至NS0細胞或者敲除了GS基因的CH0細胞(CH0K1SV GS-K0)。
[0015] 在一些實施方案中，高通量細胞篩選系統(tǒng)為Molecular Devices的ClonePix2。
[0016] 術(shù)語解釋
[0017] 谷氨酰胺合成酶(GS)是指在ATP供能的情況下，催化谷氨酸和氨離子(NH4+)合成谷 氨酰胺。
[0018] 氨基亞砜蛋氨酸(MSX)加壓是用于GS表達系統(tǒng)擴增GS基因下游的目的基因，從而 實現(xiàn)外源基因的高表達，本發(fā)明一般使用25~100μΜ。
[0019] 本發(fā)明使用的半固體培養(yǎng)基為含有甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基。甲基纖維素的添 加既能使同一單克隆在分裂時成一細胞團，又能使細胞分泌的抗體聚集在細胞團周圍與熒 光抗體（CloneDetect-anti_humanIgG(H+L)detection(Molecular Devices，Κ8200))結(jié)合 達到定量檢測的目的。目前除了可以使用商品化的CloneMatrix(Molecular Devices， K8510)外，還能使用甲基纖維素粉末(CAS#: 9004-67-5)自行配制甲基纖維素溶液。鋪板時 將甲基纖維素溶液與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按照一定的比例混和即為用于該發(fā)明的半固體培養(yǎng)基，最 終在半固體培養(yǎng)基中，甲基纖維素的質(zhì)量分數(shù)為0.9~1.5g/mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1倍的正常使 用濃度。
[0020] 高通量細胞篩選系統(tǒng)本發(fā)明所用為ClonePix2,篩選的流程是ClonePix2對細胞進 行成像-Cl〇nePiX2計算克隆熒光強度-Cl〇nePiX2挑取熒光強度高的單克隆-96孔板繼 續(xù)培養(yǎng)。
[0021] 細胞株的穩(wěn)定性評估是將篩選得到的高表達細胞株繼續(xù)傳代至60世代，取各細胞 株20世代、40世代和60世代的細胞，做500mL批培養(yǎng)評估。比較細胞株在不同代次的表達量 水平，細胞株表達量下降在30 %之內(nèi)認為細胞株是穩(wěn)定的。
[0022] 本發(fā)明方法的技術(shù)有益效果如下：
[0023] (1)實現(xiàn)了 GS表達系統(tǒng)細胞株的高通量篩選:該篩選方法運用了 Cl〇nePix2高通量 篩選系統(tǒng)，相較于用傳統(tǒng)有限稀釋單克隆化篩選的通量提高了 50倍以上，篩選周期縮短了 至少1 /3，機械化操作，直接排除95%以上的低產(chǎn)克隆。
[0024] (2)克隆形成率高，提高篩選成功率：用傳統(tǒng)有限稀釋單克隆化細胞活力>95%的 細胞池，克隆效率通常為3~4%，使用該篩選方法單克隆化細胞活力在25%~35%的細胞 池，不添加與添加條件培養(yǎng)基的克隆效率分別約為60%和100%，在克隆效率方面提升幅度 很大。
[0025] (3)表達量高：比常規(guī)使用細胞活力>95%的細胞池進行篩選更容易篩選出更多的 高表達細胞株。
[0026] (4)穩(wěn)定性好：由細胞活力在25%~35%的細胞池單克隆化篩選得到的細胞株，相 較于由活力>95%的細胞池單克隆化篩選得到的細胞株，穩(wěn)定性顯著提高。
【附圖說明】
[0027]圖1是細胞池 A(活力為25 · 28% )、細胞池 B(活力為34.36% )與細胞池 C(活力為 98.33%)單克隆化篩選過程中各組克隆在96孔板培養(yǎng)階段抗體表達量分布的比較圖； [0028]圖2是細胞池 A(活力為25.28%)、細胞池 B(活力為34.36%)與細胞池 C(活力為 98.33%)單克隆化篩選過程中各組克隆在6孔板批培養(yǎng)階段抗體表達量分布的比較圖； [0029]圖3是細胞池 A(活力為25.28%)、細胞池 B(活力為34.36%)與細胞池 C(活力為 98.33%)單克隆化篩選過程中各組克隆在500mL搖瓶批培養(yǎng)階段表達量分布的比較圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例子僅為了 闡明本發(fā)明，而非為了限制本發(fā)明的應用范圍。
[0031] 實施例1制備細胞池 A及細胞池 A單克隆化篩選高表達穩(wěn)定細胞株
[0032] 1.表達構(gòu)建體的構(gòu)建
[0033]參照W0 2007/014162 A2專利和GS Xceed?Gene Expression System(購自Lonza 公司）使用說明書自主制備得到Ant i -VEGF人源化抗體GS雙基因表達載體。
[0034] 2.轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞
[0035] 用PurcLin'dHiPure Plasmid DNA Purification Kit(Invitrogen，K2100_04)抽 提An t i -VEGF人源化抗體的雙基因表達載體，經(jīng)Pvu I (TaKaRa，1242A)線性化并提純后，以總 量40yg DNA/電轉(zhuǎn)體系，用電穿孔儀(Bio-Rad Gene Pulser Xcell Eukaryotic System，參 數(shù)300V，900yF)電擊轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的CH0K1SV GS-K0細胞（Lonza，GS Xceed?Gene Expression System)，將三次電擊后的細胞重懸于含有30mL CD CH0 Medium(Invitrogen， 12490-25)的 125mL錐形培養(yǎng)燒瓶（corning，431143-50EA)中，140rmp，37°C，8 · 0%CO2條件 下振蕩培養(yǎng)。
[0036] 3 ·制備細胞池 A
[0037] 上述的細胞培養(yǎng)24小時后離心換液，將細胞重懸于30mL含有50μΜ MSX(Sigma， M5379-250MG，SLBF5342V)的CD CH0 Medium( Invitrogen，12490-25)中于140rmp，37°C， 8.0%C02條件下振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第8天開始每天取樣臺盼藍染色法測試細胞活力，觀察 細胞活力的變化，在培養(yǎng)的第12天，細胞活力為25.28 %，取此時的細胞培養(yǎng)液1 OmL鋪板待 用，即為細胞池 A(活力為25.28%)。
[0038] 4.半固體培養(yǎng)基的配制
[0039]條件培養(yǎng)基的制備方法:取含GS空載體pXCl 7.4-18.4 (本實驗室保存)穩(wěn)轉(zhuǎn)的GS穩(wěn) 定細胞株進行批培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至密度在〇 . 9 X 107~1.1 X 107cel 1 s/mL之間且活力>95% 時，經(jīng)過離心分離細胞培養(yǎng)液的上清和細胞，取上清用膜過濾處理后待用。
[0040]其中，GS空載體pXC17 · 4-18 · 4參照GS Xceed?Gene Expression System(購自 Lonza公司）使用說明書，由pXC17.4和pXC18.4經(jīng)過分子克隆構(gòu)建而成，pXC17.4和pXC18.4 是GS Xceed?Gene ExpressionSystem中的表達載體。
[0041 ]同時，按照表1的配方配制半固體培養(yǎng)基。
[0042] 表1:單克隆化細胞池 A的半固體培養(yǎng)基配方
[0043]
[0044]室溫下大力混勻，等待氣泡慢慢消失。
[0045] 5.將細胞池鋪至半固體培養(yǎng)基
[0046] 將細胞池 A(活力25.28 % )的適量細胞離心，重懸于4. OmL 2 X CD CHO Medium (Invitrogen，12490-25)，保證細胞的密度為3000cells/mL。
[0047] 將該細胞懸液取1.5mL與配制體系1的半固體培養(yǎng)基混合，輕柔混勻后，以2mL/孔 加入至2塊6孔培養(yǎng)板中（Greiner，657185)，命名為PK(1)~（2)，靜置培養(yǎng)10~12天，37°C， 5.0 % C02條件下，待細胞團慢慢形成。
[0048] 將剩下的細胞懸液充分混勻后，取1.5mL與配制體系2的半固體培養(yǎng)基混合，輕柔 混勻后，以2mL/孔加入至2塊6孔培養(yǎng)板中(6代丨1^，657185)，命名為?以3)~(4)，靜置培養(yǎng) 10~12天，37 °C，5.0 % C02條件下，待細胞團慢慢形成。
[0049] 6.ClonePix2 挑取單克隆
[0050] 細胞在6孔板H((l)~（4)中培養(yǎng)12天后，肉眼能見分布均勻、大小適中（0.3~ 0.61111112)的細胞團，此時方可用(]1〇116?11235^七6111(]\1〇16(311131〇6￥；^68)挑選焚光強度高的 克隆。
[0051 ] (1)按照ClonePix2的操作說明書，逐步對儀器進行Prepare For Pick Run，這個 過程以確保針頭正確擊發(fā)，相機、針頭和微孔板匹配，液體系統(tǒng)無菌且可以立即使用。
[0052] (2)繼而運行Pick Run，這個過程依次為:包括設(shè)置(包括成像設(shè)置、挑選設(shè)置、滅 菌設(shè)置、克隆識別設(shè)置）。
[0053] (3)分別對PK(1)~（2)(鋪板時添加了 10 %條件培養(yǎng)基）與PK(3)~(4)(鋪板時沒 有添加了 10%條件培養(yǎng)基)進行了成像，其克隆形成效率見表211((3)~(4)僅作為不添加 條件培養(yǎng)基鋪板的對照組實驗，不再進行后續(xù)的實驗。
[0054] (4)分析PK(1)~(2)的成像結(jié)果，分析的依據(jù)是以細胞團的大小、規(guī)則程度和熒光 強度設(shè)置閾值，對克隆進行分組。其中，細胞團的規(guī)則程度以周長/面積比值，細胞邊沿的光 滑兩個參數(shù)度來衡量，目的是使細胞團的形狀接近于圓形;細胞團的熒光程度包括多種算 法，例如：外部平均焚光強度Exterior Meanlntensity、外部中位數(shù)焚光強度Exterior Median Intensity、外部總焚光強度Exterior Total Intensity、內(nèi)部焚光強度標準差 Interior Intensity SD、內(nèi)部平均中央焚光強度Interior Mean Centre Intensity、內(nèi)部 平均焚光強度Interior Mean Intensity、內(nèi)部中位數(shù)焚光強度Interior Median Intensity、內(nèi)部總焚光強度Interior Total Intensity、標準化焚光強度Normalized Intensity、總焚光強度Sum Total Intensity，根據(jù)CH0細胞分泌性表達的特點，一般選擇 外部平均熒光強度作為標準來設(shè)置High FITC組。
[0055] (5)將H((l)~（2)來源的High FITC組的克隆挑取至目標板96孔板(Greiner， 657185斤隊96(1)~（5)中，其熒光強度值范圍為：285.246〈外部熒光強度〈4888.502。將 PKC96 (1)~(5)于37°C，5.0% C02條件下，靜置培養(yǎng)5~7天。
[0056] (6)結(jié)束程序，把目標板細胞PKC96(1)~（5)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般5~7天后成 活的克隆匯合度可長至15%以上。
[0057] 表2:是否添加條件培養(yǎng)基克隆情況比較
[0058]
[0059] 由表2可以看出：同為將細胞池 A鋪于半固體培養(yǎng)基上，添加 10% 了條件培養(yǎng)基的 實驗組克隆形成率接近100%。
[0060] 7.克隆的擴大培養(yǎng)及篩選
[0061] (1)匯合度的標定：待96孔板細胞H(C96(1)~（5)培養(yǎng)5天后，用CloneSelect Imager(Molecular devices)對克隆進行成像，將匯合度數(shù)據(jù)導出。
[0062] (2)取樣，測定抗體濃度:依次對匯合度2 15%的克隆取樣，F(xiàn)〇rtebi〇(PALL，QKe) 測定Anti-VEGF人源化抗體表達量，這98株克隆的表達量分布見圖1，其中，柱形圖表示在一 定抗體表達量范圍的克隆數(shù)，曲線表示克隆表達量分布的范圍及頻率。
[0063] (3)96孔板擴培至24孔板:參照克隆在96孔板中的表達量，將表達量>29mg//L的30 個與相對表達量> 116mg/L(且表達量< 29mg/L)的18個克隆轉(zhuǎn)至24孔板PKC24(1)~(2)中。 [0064] (4) 24孔板擴培至6孔板:全部轉(zhuǎn)入，命名為PKC6(1)~(8)。
[0065] (5)6孔板批培養(yǎng)：48株全部參與6孔板批培養(yǎng)，命名為PKC6(1)~（8)，培養(yǎng)7天， Fortebio測定累計表達量，這48株克隆的表達量分布見圖2,其中，柱形圖表示在一定抗體 表達量范圍的克隆數(shù)，曲線表示克隆表達量分布的范圍及頻率。
[0066] (6) 6孔板擴培至125mL搖瓶：參照克隆在6孔板中批培養(yǎng)的表達量，將表達量〉 230mg/L的7株與SPR>19pcd(且表達量< 230mg/L)的3株傳代至125mL搖瓶P125(l)~（10) 中，于140rmp，37 °C，8.0 % C02條件下振蕩培養(yǎng)。
[0067] (7)細胞凍存及擴培至500mL批培養(yǎng):選自步驟(6)篩選出來的10株細胞。
[0068] (8)500mL批培養(yǎng):P500 (1)~（10)，從批培養(yǎng)的第三天開始取樣測定細胞密度、活 力及HPLC測定抗體表達量，直至細胞活力低于60 %方可停止。細胞株的表達量在280~ 420mg/L之間，具體見表3的0世代數(shù)據(jù)和圖3,柱形圖表示在一定抗體表達量范圍的克隆數(shù)。 [0069] 8.細胞株的穩(wěn)定性評估
[0070] 將克?。?)~（10)的細胞繼續(xù)傳代至60世代，取各細胞株20世代、40世代和60世代 的細胞，做500mL批培養(yǎng)評估。比較細胞株在不同代次的表達量水平，細胞株表達量下降在 30 %之內(nèi)認為細胞株是穩(wěn)定的。在(1)~（10)中，穩(wěn)定的有9株。結(jié)果見表3。
[0071 ]表3:由細胞池 A篩選的克?。?)~（10)的穩(wěn)定性評估表
[0072]
12345 實施例2制備細胞池 B及細胞池 B單克隆化篩選高表達穩(wěn)定細胞株 2
[0074] 1.表達構(gòu)建體的構(gòu)建 3 參照TO 2007/014162A2專利和GS Xceed?Gene Expression System(購自Lonza公 司）使用說明書自主制備得到Ant i -VEGF人源化抗體GS雙基因表達載體。 4 2.轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞 5 用PureLink?.HiPure Plasmid DNA Purification Kit(Invitrogen，K2100_04)抽 提An t i -VEGF人源化抗體的雙基因表達載體，經(jīng)Pvu I (TaKaRa，1242A)線性化并提純后，以總 量40yg DNA/電轉(zhuǎn)體系，用電穿孔儀(Bio-Rad Gene Pulser Xcell Eukaryotic System，參 數(shù)300￥，90(^?)電擊轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的(：!101(15￥65-1(0細胞（1^〇1^3,65乂〇66(^6116 Expression System)，將三次電擊后的細胞重懸于含有30mL CD CH0 Medium(Invitrogen， 12490-25)的 125mL錐形培養(yǎng)燒瓶（corning，431143-50EA)中，140rmp，37 °C，8 · Ο % C〇2條件 下振蕩培養(yǎng)。
[0078] 3.制備細胞池 B
[0079] 上述的細胞培養(yǎng)24小時后離心換液，將細胞重懸于30mL含有50μΜ MSX(Sigma， M5379-250MG，SLBF5342V)的CD CHO Medium( Invitrogen，12490-25)中于140rmp，37°C， 8.0%C02條件下振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第8天開始每天取樣臺盼藍染色法測試細胞活力，觀察 細胞活力的變化，在培養(yǎng)的第13天，細胞活力為34 · 36 %，取此時的細胞培養(yǎng)液5mL鋪板待 用，即為細胞池 B(活力為34 · 36 % )。
[0080] 4.半固體培養(yǎng)基的配制
[0081 ]條件培養(yǎng)基的制備方法:取含GS空載體pXC17.4-18.4(本實驗室保存)穩(wěn)轉(zhuǎn)的GS穩(wěn) 定細胞株進行批培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至密度在〇 . 9 X 107~1.1 X 107cel 1 s/mL之間且活力>95% 時，經(jīng)過離心分離細胞培養(yǎng)液的上清和細胞，取上清用膜過濾處理后待用。
[0082] 其中，GS空載體pXC17 · 4-18 · 4參照GS Xceed?Gene Expression System(購自 Lonza公司）使用說明書，由pXC17.4和pXC18.4經(jīng)過分子克隆構(gòu)建而成，pXC17.4和pXC18.4 是GS Xceed?Gene Expression System中的表達載體。
[0083] 同時，按照表4的配方配制半固體培養(yǎng)基。
[0084] 表4:單克隆化細胞池 B的半固體培養(yǎng)基配方
[0085]
[0086]室溫下大力混勻，等待氣泡慢慢消失。
[0087] 5.將細胞池鋪至半固體培養(yǎng)基
[0088] 將細胞池8(活力為34.36%)的適量細胞離心，重懸于1.511^2\〇)〇10 16(^11111 (Invitrogen，12490-25)，保證細胞的密度為3000cells/mL。
[0089] 將該細胞懸液取1.5mL與配制體系4的半固體培養(yǎng)基混合，輕柔混勻后，以2mL/孔 加入至2塊6孔培養(yǎng)板中（Greiner，657185)，命名為PK(5)~(6)，靜置培養(yǎng)10~12天，37°C， 5.0 % C02條件下，待細胞團慢慢形成。
[0090] 6.ClonePix2 挑取單克隆
[0091] 細胞在6孔板H(( 5)~（6)中培養(yǎng)12天后，肉眼能見分布均勻、大小適中（0.3~ 0.6mm2)的細胞團，此時方可用ClonePix2 System(Molecular Devices)挑選焚光強度高的 克隆。
[0092] (1)按照ClonePix2的操作說明書，逐步對儀器進行Prepare For Pick Run，這個 過程以確保針頭正確擊發(fā)，相機、針頭和微孔板匹配，液體系統(tǒng)無菌且可以立即使用。
[0093] (2)繼而運行Pick Run，這個過程依次為:包括設(shè)置(包括成像設(shè)置、挑選設(shè)置、滅 菌設(shè)置、克隆識別設(shè)置）。
[0094] (3)對PK(5)~(6)進行了成像，其克隆形成效率為99.8%。
[0095] (4)分析ΡΚ(5)~(6)的成像結(jié)果，分析的依據(jù)是以細胞團的大小、規(guī)則程度和熒光 強度設(shè)置閾值，對克隆進行分組。其中，細胞團的規(guī)則程度以周長/面積比值，細胞邊沿的光 滑兩個參數(shù)度來衡量，目的是使細胞團的形狀接近于圓形;細胞團的熒光程度包括多種算 法，例如：外部平均焚光強度Exterior Mean Intensity、外部中位數(shù)焚光強度Exterior Median Intensity、外部總焚光強度Exterior Total Intensity、內(nèi)部焚光強度標準差 Interior Intensity SD、內(nèi)部平均中央焚光強度Interior Mean Centre Intensity、內(nèi)部 平均焚光強度Interior Mean Intensity、內(nèi)部中位數(shù)焚光強度Interior Median Intensity、內(nèi)部總焚光強度Interior Total Intensity、標準化焚光強度Normalized Intensity、總焚光強度Sum Total Intensity，根據(jù)CH0細胞分泌性表達的特點，一般選擇 外部平均熒光強度作為標準來設(shè)置High FITC組。
[0096] (5)將H((5)~（6)來源的High FITC組的克隆挑取至目標板96孔板(Greiner， 657185斤1^96(6)~（10)中，其熒光強度值范圍為：283.556〈外部熒光強度〈4750.326。將 PKC96(6)~（10)于37°C，5.0%C02條件下，靜置培養(yǎng)5~7天。
[0097] (6)結(jié)束程序，把目標板細胞PKC96(6)~（10)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般5~7天后成 活的克隆匯合度可長至15%以上。
[0098] 7.克隆的擴大培養(yǎng)及篩選
[0099] (1)匯合度的標定：待96孔板細胞PKC96(6)~（10)培養(yǎng)5天后，用CloneSelect Imager(Molecular devices)對克隆進行成像，將匯合度數(shù)據(jù)導出。
[0100] (2)取樣，測定抗體濃度:依次對匯合度2 15%的克隆取樣，F(xiàn)ortebio(PALL，QKe) 測定Anti-VEGF人源化抗體表達量，這101株克隆的表達量分布見圖1，其中，柱形圖表示在 一定抗體表達量范圍的克隆數(shù)，曲線表示克隆表達量分布的范圍及頻率。
[0101] (3)96孔板擴培至24孔板:參照克隆在96孔板中的表達量，將表達量>28.7mg//L的 30個與相對表達量>110mg/L(且表達量<28.7mg/L)的18個克隆轉(zhuǎn)至24孔板PKC24(3)~(4) 中，這48株克隆的表達量見圖1。
[0102] (4)24孔板擴培至6孔板:全部轉(zhuǎn)入，命名為PKC6(9)~（16)。
[0103] (5)6孔板批培養(yǎng):48株全部參與6孔板批培養(yǎng)，命名為PKC6(9)~（16)，培養(yǎng)7天， Fortebio測定累計表達量，這48株克隆的表達量分布見圖2,其中，柱形圖表示在一定抗體 表達量范圍的克隆數(shù)，曲線表示克隆表達量分布的范圍及頻率。
[0104] (6) 6孔板擴培至125mL搖瓶：參照克隆在6孔板中批培養(yǎng)的表達量，將表達量〉 226mg/L的7株與SPR>20pcd(且表達量< 226mg/L)的3株傳代至125mL搖瓶P125(ll)~（20) 中，于140rmp，37 °C，8.0 % C02條件下振蕩培養(yǎng)。
[0105] (7)細胞凍存及擴培至500mL批培養(yǎng):選自步驟(6)篩選出來的10株細胞。
[0106] (8)500mL批培養(yǎng):P500(11)~(20)，從批培養(yǎng)的第三天開始取樣測定細胞密度、活 力及HPLC測定抗體表達量，直至細胞活力低于60%方可停止。細胞株的表達量在270~ 415mg/L之間，具體見表5的0世代數(shù)據(jù)和圖3,柱形圖表示在一定抗體表達量范圍的克隆數(shù)。
[0107] 8.細胞株的穩(wěn)定性評估
[0108] 將克?。?1)~（20)的細胞繼續(xù)傳代至60世代，取各細胞株20世代、40世代和60世 代的細胞，做500mL批培養(yǎng)評估。比較細胞株在不同代次的表達量水平，細胞株表達量下降 在30%之內(nèi)認為細胞株是穩(wěn)定的。在(11)~(20)中，穩(wěn)定的有9株。結(jié)果見表5。
[0109]表5:由細胞池 B篩選的克?。?1)~(20)的穩(wěn)定性評估表
[0110]
[0111] 9 ·細胞池 A(活力為25.28%)、細胞池 B(活力為34.36%)、與細胞池 C(活力為 98.33% )單克隆化篩選高表達穩(wěn)定細胞株的比較
[0112] 1)細胞池 C單克隆化篩選高表達穩(wěn)定細胞株參照實施例2的步驟，不同點在于細胞 池 C是MSX加壓至第20天的細胞，此時細胞活力為98.33%，由細胞池篩選的克?。?1)~(30) 的穩(wěn)定性評估數(shù)據(jù)見表6。
[0113]表6:由細胞池 C篩選的克隆(21)~(30)的穩(wěn)定性評估表
[0114]
12 2)將細胞池 A(數(shù)據(jù)來源于實施例1)、細胞池 B(數(shù)據(jù)來源于本實施）、與細胞池 C單 克隆化篩選高表達穩(wěn)定細胞株不同階段的數(shù)據(jù)匯總在表7和圖1~3。 2 表7:不同細胞池單克隆化篩選高表達穩(wěn)定細胞株在不同階段的比較
[0118]
[0119]由表7和表1~3可以看出：細胞池 A和細胞池 B同為細胞活力在25%~35%的細胞 池，由它們篩選出來的細胞株表達量及穩(wěn)定性相差不大，但是都比由細胞池 C(活力>95%) 篩選出來的細胞株表達量高，穩(wěn)定性更好。
【主權(quán)項】
1. 一種GS表達系統(tǒng)細胞株的高通量篩選方法，其特征在于，由以下步驟組成： (1) 在氨基亞砜蛋氨酸加壓后，選擇細胞活力在25 %~35%的細胞池進行單克隆化篩 選； (2) 將步驟（1)所述的細胞池加入到含有10% (體積比）條件培養(yǎng)基和甲基纖維素(0.9 ~1.5g/mL)的半固體培養(yǎng)基上形成單克隆，細胞終濃度為150cel ls/mL; (3) 利用高通量細胞篩選系統(tǒng)篩選細胞株； (4) 對步驟(3)中篩選出來的細胞株進行穩(wěn)定性評估； 其中，步驟(2)所述條件培養(yǎng)基的制備方法為:取含GS空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)的GS穩(wěn)定細胞株進行 批培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至密度在0.9 X 107~1.1 X 107cells/mL之間且細胞活力>95%時，經(jīng)過離 心分離上清和細胞，取上清用膜過濾處理后待用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述GS表達系統(tǒng)為攜帶GS基因的并且GS基 因下游插入了外源基因的表達載體轉(zhuǎn)染至NS0細胞或者敲除了 GS基因的CHO細胞(CHOK1SV GS-KO)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量細胞篩選系統(tǒng)為Molecular
【文檔編號】C12N15/85GK105838736SQ201610173410
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月24日
【發(fā)明人】劉靜, 張彩霞, 李揚, 楊彬, 孫文正, 倪健
【申請人】廣東東陽光藥業(yè)有限公司