制備2-表-5-表有效醇酮的方法
【專利摘要】一種制備2?表?5?表有效醇酮的方法，設(shè)計并實(shí)現(xiàn)了一種新的2?表?5?表有效醇酮合成途徑、即在體外利用重組表達(dá)純化得到的轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、5?磷酸核酮糖?3?差向異構(gòu)酶、5?磷酸核糖異構(gòu)酶及2?表?5?表有效醇酮合成酶，將底物6?磷酸果糖與β?羥基丙酮酸催化合成2?表?5?表有效醇酮。本發(fā)明為構(gòu)建以生物質(zhì)為原料的體外合成途徑產(chǎn)氨基環(huán)醇類物質(zhì)的前體提供了新的思路。
【專利說明】
制備2-表-5-表有效酵酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種工業(yè)酶生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)，具體涉及一種2-表-5-表有效醇酮 (2-epi-5-epi-valiolone,(2S,3S,4S,5R)-2,3,4,5-tetrahydroxy-5-(hydroxymethyl) eyelohexan-1-one)合成途徑，即在體外利用轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu) 酶、5-磷酸核糖異構(gòu)酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，將底物6-磷酸果糖與β-羥基丙酮酸催 化合成2-表-5-表有效醇酮、編碼上述五種酶的基因的克隆表達(dá)純化，以及在體外組裝并完 成利用這些酶的催化功能合成2-表-5-表有效醇酮的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，其主要成分包括纖維素，半纖維素和木質(zhì) 素等。利用化學(xué)或生物技術(shù)可將生物質(zhì)原料分解成單糖組分，這種基于糖平臺的生物轉(zhuǎn)化 技術(shù)由于具有環(huán)境友好，條件溫和等優(yōu)點(diǎn)在燃油，化學(xué)品和其它材料的開發(fā)中備受關(guān)注并 具有良好應(yīng)用前景(趙月等，新能源進(jìn)展，2015,3(2):99-104)。目前生物質(zhì)的化學(xué)和酶法處 理可以將半纖維素水解成戊糖，纖維素酶解成己糖，戊糖和己糖可用于化學(xué)或生物途徑制 備目標(biāo)產(chǎn)品。利用體外合成生物學(xué)技術(shù)，可將上述從生物質(zhì)原料中獲得的糖用于生物制氫 (You C等，Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(18):7182- 7187.)及制備淀粉（Rollin J A等，Proceedings of the National Academy of Sciences,2015,112(16):4964-4969.)〇
[0003] 2-表-5-表有效醇酮(2-epi-5-epi-valiolone，EEV)是7-磷酸景天庚酮糖(S7P)的 環(huán)化產(chǎn)物，是糖尿病藥物阿卡波糖、抗水稻紋枯病活性物質(zhì)井閃霉素及抗生素 pyralomycin 等7碳氨基環(huán)醇類物質(zhì)的前體(Mahmud T，Current Opinion in Chemical Biology，2009， 13(2) :161-170. )。2_表-5-表有效醇酮的化學(xué)合成方法是以2,3,4,6-tetra-0-benzyl-D- mannopyranose為起始，經(jīng)過7步反應(yīng)完成，其中的反應(yīng)在-78°C的低溫和室溫下交替進(jìn)行 (Mahmud T等，Journal of the American Chemical Society，1999,121(30):6973- 6983.)，因而開發(fā)溫和的生物合成方法具有重要的意義。
[0004] 2008年，F(xiàn)ranck等報道了 7-磷酸景天庚酮糖的酶法制備方法，該合成途徑以5-磷 酸核糖和羥基丙酮酸為底物，通過轉(zhuǎn)酮酶的催化生成7-磷酸景天庚酮糖和C02(Charmantray F等.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2009,57(1):6-9.)〇 早在2002年Zhang等報道的2-表-5-表有效醇酮的酶法合成方法也正是基于上述的途徑生 成7-磷酸景天庚酮糖，同時加入了 2-epi-5-epi-valiolone合成酶催化7-磷酸景天庚酮糖 的環(huán)化反應(yīng)（Zhang等，Journal of Biological Chemistry.2002,277(25):22853_ 22862.)。其反應(yīng)路線見圖1A。另外，在上世紀(jì)60年代Pontremoli等報道了6-磷酸果糖可在 轉(zhuǎn)醛酶和轉(zhuǎn)酮酶的共同催化下生成7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸木酮糖(Bon signore等， Journal of Biological Chemistry，1960，235(7) :1881-1887·)，該反應(yīng)中的7-磷酸景天 庚酮糖可通過加入2-表-5-表有效醇酮合成酶環(huán)化為2-表-5-表有效醇酮，然而5-磷酸木酮 糖就作為了副產(chǎn)物(見圖1B)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明在調(diào)研前人工作的基礎(chǔ)上，形成了一種創(chuàng)造性的構(gòu)思，提出了一種制備2- 表-5-表有效醇酮的方法，通過體外組裝轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、5- 磷酸核糖異構(gòu)酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，可以實(shí)現(xiàn)從6-磷酸果糖和β-羥基丙酮酸到 2-表-5-表有效醇酮的轉(zhuǎn)化(見圖1C)。其中轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶可催化6-磷酸果糖生成7-磷酸景 天庚酮糖和5-磷酸木酮糖，副產(chǎn)物5-磷酸木酮糖可在5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、5-磷酸 核糖異構(gòu)酶催化下生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖可與另一個底物β-羥基丙酮酸進(jìn)一步生成 7_磷酸景天庚酮糖，最后在2-表-5-表有效醇酮合成酶作用下7-磷酸景天庚酮糖被環(huán)化為 目標(biāo)產(chǎn)物2-表-5-表有效醇酮。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明通過體外組裝轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、5-磷酸核糖 異構(gòu)酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，所得轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶可催化6-磷酸果糖生成7-磷酸景 天庚酮糖和5-磷酸木酮糖，副產(chǎn)物5-磷酸木酮糖可在5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、5-磷酸 核糖異構(gòu)酶催化下生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖與β-羥基丙酮酸進(jìn)一步生成7-磷酸景天庚 酮糖，最后在2-表-5-表有效醇酮合成酶作用下7-磷酸景天庚酮糖被環(huán)化為目標(biāo)產(chǎn)物2-表- 5-表有效醇酮。
[0008] 所述的體外組裝是指:將編碼轉(zhuǎn)醛酶(tal)、編碼轉(zhuǎn)酮酶(tk)、編碼5-磷酸核酮糖- 3_差向異構(gòu)酶(r5p3e)、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶（ri)或編碼2-表-5-表有效醇酮合成酶 (vala)從對應(yīng)的菌株全基因組DNA進(jìn)行克隆并在重組大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和純化，然后將 純化后的酶與底物、輔因子在體外緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)組裝。
[0009] 所述的菌株，具體是指：
[0010] 對應(yīng)轉(zhuǎn)醛酶的tal、轉(zhuǎn)酮酶的tk、5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶的r5p3e、5-磷酸核 糖異構(gòu)酶的ri克隆自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)基因組DNA。該菌株通過公開渠道 購自美國菌種保藏中心:http: //www · atcc · org/(保藏編號為ATCC number 43589D-2)。
[0011] 對應(yīng)2-表-5-表有效醇酮合成酶的vala克隆自吸水鏈霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)基因組DNA。該吸水鏈霉菌5008通過公開渠道購自中國普通微生物菌 種保藏管理中心:http: //www· cgmcc · net/(保藏編號為CGMCC 4 · 1026)。
[0012] 所述的表達(dá)，具體是指：將編碼轉(zhuǎn)醛酶的tal、編碼轉(zhuǎn)酮酶的tk、編碼5-磷酸核酮 糖-3-差向異構(gòu)酶的r5p3e、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶的ri或編碼2-表-5-表有效醇酮合成酶 的vala采用基于表達(dá)質(zhì)粒的異源表達(dá)方式引入微生物宿主內(nèi)實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制，即設(shè)計引物序 列，以相應(yīng)菌株全基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用內(nèi)切酶酶切并連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的 表達(dá)質(zhì)粒載體上。
[0013] 所述的微生物宿主包括作為表達(dá)宿主的大腸桿菌E.coli BL21和作為克隆宿主的 大腸桿菌E.coli DH5a。
[0014] 所述的底物為6-磷酸果糖(F6P)或6-磷酸果糖與β-羥基丙酮酸(ΗΡΑ)。
[0015]所述的輔因子包括:MgCl2、硫胺素焦磷酸0??)、0)(：12、1%(：1 2、煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸(NAD+)、NaF中的任意一種或其組合。 技術(shù)效果
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過在體外將5種酶與底物，輔因子等組裝完成了以6-磷 酸果糖為起始底物的2-表-5-表有效醇酮的合成，其中β-羥基丙酮酸，5-磷酸核酮糖-3-差 向異構(gòu)酶和5-磷酸核糖異構(gòu)酶的加入可使該途徑的理論得率提高一倍；另外，最后一步2- 表-5-表有效醇酮合成酶的反應(yīng)為自發(fā)反應(yīng)，可使7-磷酸景天庚酮糖盡量環(huán)化為目標(biāo)產(chǎn)物。 該途徑的設(shè)計與實(shí)施有望用于以生物質(zhì)為原料產(chǎn)2-表-5-表有效醇酮或其它氨基環(huán)醇類物 質(zhì)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為化學(xué)反應(yīng)示意圖；
[0018] 圖中：Α為合成酶催化7-磷酸景天庚酮糖的環(huán)化反應(yīng)、Β為7-磷酸景天庚酮糖和5- 磷酸木酮糖環(huán)化反應(yīng)、C為2-表-5-表有效醇酮合成反應(yīng)；
[0019] 圖2為兩種反應(yīng)條件下2-表-5-表有效醇酮的前體一7-磷酸景天庚酮糖(S7P)的產(chǎn) 量示意圖；
[0020] 圖3為三種不同反應(yīng)條件下2-表-5-表有效醇酮的產(chǎn)量示意圖。
【具體實(shí)施方式】 實(shí)施例1
[0021] 本實(shí)施例中生物合成途徑的構(gòu)建是基于表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、異源表達(dá)、純化，所采用 的菌株、質(zhì)粒、酶與培養(yǎng)基等包括:表達(dá)質(zhì)粒為pET28a;表達(dá)宿主為大腸桿菌E. col i BL21; 克隆宿主為大腸桿菌E.coli DH5a;基因操作工具包括:限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4 DNA 連接酶;LB培養(yǎng)基:每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，卡那霉素濃度根據(jù)需要 或優(yōu)選為50mg/L，其具體步驟包括：
[0022] 1)PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計引物序列，以相應(yīng)菌株全基因組DNA為模板進(jìn) 行擴(kuò)增，用內(nèi)切酶酶切并連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的表達(dá)質(zhì)粒載體上。
[0023]所述的引物序列包括：
[0024]七&1-上游引物，如369 10如.6所示，具體為： 5 '-GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC-3，
[0025] t a 1 -下游引物，如S e q ID Ν ο · 7所示，具體為：5 ' - ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3'
[0026] tk-上游引物，如Seq ID No.8所示，具體為： 5 '-GGAATTCCATATGATGGAAAGGTTTCCCTAT-3，
[0027] tk-下游引物，如Seq ID No.9所示，具體為： 5 '-ACGCGTCGACTTAGAGCATCTCTCTGAG-3，
[0028] r5p3e_上游引物，如Seq ID No. 10所示，具體為： 5 '-GGAATTCCATATGATGGTGAAAATAGCAGCTTC-3，
[0029] r5p3e_下游引物，如Seq ID No. 11所示，具體為： 5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCAGCAAATTCC-3，
[0030] ri-上游引物，如Seq ID No. 12所示，具體為： 5 '-GGAATTCCATATGGTGAAGATCGCTATTGC-3，
[0031] ri下游引物，如Seq ID No· 13所示，具體為:5'-ACGCGTCGACTTAAACCTCATCGATC-3'
[0032] vala-上游引物，如Seq ID No. 14所示，具體為： 5 '-GGAATTCCATATGATGACCATGACCAAGCAGAG-3，
[0033] vala-下游引物，如Seq ID No. 15所示，具體為： 5 '-ACGCGTCGACTCACACCCCCATGTCCACGGCACCG-3'
[0034] 其中劃線部分是相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。
[0035]質(zhì)粒pET28a帶有T7啟動子，可通過加入IPTG誘導(dǎo)啟動轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
[0036] 2)將表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5a，篩選重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序驗(yàn)證， 其中4&141^5。36，1'；[分別是來源于1'1161'1]1〇1:〇83 1]^1'；[1:;[1]^的轉(zhuǎn)醛酶，轉(zhuǎn)酮酶，5-磷酸核酮 糖-3-差向異構(gòu)酶，5-磷酸核糖異構(gòu)酶的編碼基因，vala是來源于Streptomyces hygroscopicus 5008的2-表-5-表有效醇酮合成酶編碼基因，其氨基酸序列依次如Seq ID No. 1~5所示。
[0037] 3)將上述構(gòu)建的質(zhì)粒 pETSSa-taUpETSSa-tl^pETSSa-rSpSejETSSa-rlpETSSa- vala 分別轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過篩選和活化得到用于可誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的菌 株，并保存于_80°C冰箱。
[0038] 4)從-80°C冰箱中取出構(gòu)建成功的重組酶的表達(dá)菌株，接種到10mL含有卡那霉素 (50yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm過夜培養(yǎng)約12-16h。于次日將菌液按照1:100 (體積比）的比例接種至含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm培養(yǎng)至OD600為0.5- 0.8時，加入IPTG至終濃度為0.4mM，在相應(yīng)條件下誘導(dǎo)表達(dá)一定時間后取出并收集菌體。菌 體收集后，加入50mM的磷酸鹽緩沖液(原菌液與緩沖液體積比為10:1)并混合均勻。
[0039] 所述相應(yīng)條件為質(zhì)粒 pET28a-tal、pET28a-tk、pET28a-r5p3e、pET28a-ri 的誘導(dǎo)表 達(dá)在37°C，220rpm培養(yǎng)3h;pET28a-vala的誘導(dǎo)表達(dá)在 16°C，220rpm培養(yǎng)20h。
[0040] 5)將上述處理好的菌液取出放置于合適的燒杯中，并在冰浴條件下進(jìn)行超聲破 碎，破碎后的細(xì)胞在4°C離心收集上清，過0.45μπι濾膜后放置在冰上待用。
[0041 ] 蛋白純化選用GE公司的HisTrap FF鎳柱，具體操作為，先用約10倍柱體積（10mL， 本實(shí)施例中選用的是lmL的鎳柱）的ddH20清洗鎳柱，再用約5mL的磷酸鹽緩沖液平衡鎳柱后 上樣，上樣結(jié)束后用磷酸鹽緩沖液繼續(xù)過柱以去除未結(jié)合的蛋白，同時測定流出液的〇D280值，當(dāng)其接近〇時換成洗脫液進(jìn)行洗脫，并用干凈的EP管進(jìn)行收集，洗脫液為加入了 200mM咪 唑的磷酸鹽緩沖液。收集的蛋白樣品，進(jìn)行〇D28Q的測定，并記錄。當(dāng)0D28Q值接近于洗脫液的 0D28q值時則認(rèn)為蛋白已基本洗脫完成。將洗脫的蛋白樣品收集，如不立即使用需加入終濃 度為10%的甘油并在_20°C保存。 實(shí)施例2
[0042] 在體外將酶，底物，輔因子等組裝完成2-表-5-表有效醇酮的前體一7-磷酸景天庚 酮糖的合成。
[0043] 如圖2所示，為考察了兩個反應(yīng)條件下2-表-5-表有效醇酮的合成情況。
[0044]圖中的反應(yīng)條件F指以F6P為底物，加入的tk，tal為lU/mL;反應(yīng)條件冊以F6P和ΗΡΑ 為底物，加入的tk，tal，r5p3e，ri為lU/mL。
[0045] 基本反應(yīng)條件中底物F6P的用量(終濃度)為0.5mM，HPA的用量為ImM(根據(jù)需要）， 輔因子MgCl2、TPP的用量分別為2mM、0.1 mM。所用緩沖液為pH 7.0的50mM Tris-HCl緩沖液。 反應(yīng)溫度為80°C，反應(yīng)時間為0-2h。
[0046]反應(yīng)樣品的處理及定量測定：
[0047] 樣品反應(yīng)到相應(yīng)時間0-2h時取出置于冰上終止反應(yīng)，定量測定采用半胱氨酸-硫 酸顯色法（Dische Z，Journal of Biological Chemistry. 1953,204(2) :983-998. )〇
[0048] 通過定量分析后發(fā)現(xiàn)，兩個反應(yīng)條件下都有目標(biāo)物質(zhì)7-磷酸景天庚酮糖的生成。
[0049] 如圖2可見，ΗΡΑ支路的途徑生成的7-磷酸景天庚酮糖的產(chǎn)量約為無 ΗΡΑ支路途徑 的1.92倍，7-磷酸景天庚酮糖的得率約為理論值的62.8%。 實(shí)施例3
[0050]在體外將酶，底物，輔因子等組裝完成2-表-5-表有效醇酮的合成。
[0051]如圖3所示，為考察了三個反應(yīng)條件下2-表-5-表有效醇酮的合成情況。
[0052]圖中的反應(yīng)條件Α指以F6P為底物，所用酶與比例為tal :tk:vala=l: 1:1;反應(yīng)條 件B指以F6P和ΗΡΑ為底物，所用酶與比例為tal: tk:r5p3e:ri : vala = l: 1:1:1:1;反應(yīng)條件C 指以F6P和ΗΡΑ為底物，所用酶與比例為tal: tk:r5p3e :ri : vala = 1:1:1:1: 5。其中比例1時 的酶活為〇.4U/mL。
[0053]基本反應(yīng)條件中底物F6P的用量(終濃度)為5mM，HPA的用量為10mM(根據(jù)需要），輔 因子(：〇(：12、]\%(：12、了?？、嫩0+、似？的用量分別為0.05111]\1、2111]\1、0.1111]\1、1111]\1、21111。所用緩沖液為 pH 7.0的50mM Tris-HCl緩沖液。反應(yīng)溫度為40°C，反應(yīng)時間為0_24h。
[0054]反應(yīng)樣品的處理及定量測定：
[0055] 樣品反應(yīng)到相應(yīng)時間0_24h時取出置于冰上并立即使用凍干機(jī)凍干，凍干后的樣 品使用甲醇提取三次(每次500yL甲醇，超聲15min)后用氮?dú)獯蹈伞?br>[0056] 2-表-5-表有效醇酮的定量采用氫譜核磁定量法，所用儀器為Bruker Avance III 600MHz核磁共振波譜儀，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)為吡嗪，溶劑為氘代甲醇。
[0057]氫譜核磁定量法是將樣品與內(nèi)標(biāo)物各指定基團(tuán)上質(zhì)子產(chǎn)生的共振峰積分值進(jìn)行 比較，具體為= 其中:Ws和Wr分別為樣品和內(nèi)標(biāo)物的絕對重量，AdPAs為內(nèi) 標(biāo)物和樣品選定信號峰的積分值，EqR和Eqs為內(nèi)標(biāo)物和樣品的質(zhì)子當(dāng)量，即Eq=M(分子量)/η (被積信號包含的質(zhì)子數(shù)）。
[0058] 本實(shí)施例以內(nèi)標(biāo)物質(zhì)吡嗪8.65ppm處的特征峰與2-表-5-表有效醇酮在2.35ppm處 的特征峰(dd雙頭峰)進(jìn)行定量分析。
[0059]通過氫譜核磁定量后分析，三個不同反應(yīng)條件下均成功合成目標(biāo)物質(zhì)2-表-5-表 有效醇酮。
[0060]以tal為例，通過增加了ΗΡΑ支路途徑的2-表-5-表有效醇酮產(chǎn)量明顯高于無 ΗΡΑ途 徑（即反應(yīng)條件Α與Β比較），且當(dāng)vala增加為其它酶的5倍時（即反應(yīng)條件C)，產(chǎn)量更高，在8h 達(dá)理論產(chǎn)率的88 %。在A條件下，EEV的產(chǎn)量很快達(dá)到平衡，為1.6mM，為理論得率(2.5mM)的 64% 〇
[0061 ]以上結(jié)果表明ΗΡΑ支路途徑的設(shè)計可以提高目標(biāo)產(chǎn)物的得率，vala酶在整個途徑 中也起到了非常重要的作用。
[0062]上述具體實(shí)施可由本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明原理和宗旨的前提下以不同 的方式對其進(jìn)行局部調(diào)整，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)且不由上述具體實(shí)施所 限，在其范圍內(nèi)的各個實(shí)現(xiàn)方案均受本發(fā)明之約束。
【主權(quán)項】
1. 一種制備2-表-5-表有效醇酮的方法，其特征在于，通過體外組裝轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮酶、5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、5-磷酸核糖異構(gòu)酶及2-表-5-表有效醇酮合成酶，所得轉(zhuǎn)醛酶、 轉(zhuǎn)酮酶可催化6-磷酸果糖生成7-磷酸景天庚酮糖和5-磷酸木酮糖，副產(chǎn)物5-磷酸木酮糖可 在5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、5-磷酸核糖異構(gòu)酶催化下生成5-磷酸核糖，5-磷酸核糖與 β-羥基丙酮酸進(jìn)一步生成7-磷酸景天庚酮糖，最后在2-表-5-表有效醇酮合成酶作用下7-磷酸景天庚酮糖被環(huán)化為目標(biāo)產(chǎn)物2-表-5-表有效醇酮。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的體外組裝是指:將編碼轉(zhuǎn)醛酶、編碼轉(zhuǎn) 酮酶、編碼5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶或編碼2-表-5-表有效醇 酮合成酶從對應(yīng)的菌株全基因組DNA進(jìn)行克隆并在重組大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和純化，然后 將純化后的酶與底物、輔因子在體外緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)組裝。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的菌株，具體是指： 對應(yīng)轉(zhuǎn)醛酶的t a 1、轉(zhuǎn)酮酶的t k、5 -磷酸核酮糖-3 -差向異構(gòu)酶的r 5 p 3 e、5 -磷酸核糖異 構(gòu)酶的ri克隆自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima)基因組DNA; 對應(yīng)2-表-5-表有效醇酮合成酶的va la克隆自吸水鏈霉菌5008 (Strep tomyces hygroscopicus5008)基因組DNA。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的表達(dá)，具體是指:將編碼轉(zhuǎn)醛酶的tal、 編碼轉(zhuǎn)酮酶的tk、編碼5-磷酸核酮糖-3-差向異構(gòu)酶的r5p3e、編碼5-磷酸核糖異構(gòu)酶的ri 或編碼2-表-5-表有效醇酮合成酶的vala采用基于表達(dá)質(zhì)粒的異源表達(dá)方式引入微生物宿 主內(nèi)實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制，即設(shè)計引物序列，以相應(yīng)菌株全基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用內(nèi)切酶 酶切并連接到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的表達(dá)質(zhì)粒載體上。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的純化，采用鎳柱進(jìn)行蛋白純化。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，所述的微生物宿主包括作為表達(dá)宿主的大腸 桿菌E.coli BL21和作為克隆宿主的大腸桿菌E.coli DH5a;所述的表達(dá)質(zhì)粒為pET28a。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的底物為6-磷酸果糖或6-磷酸果糖與β-羥基丙酮酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的輔因子包括:MgCl2、硫胺素焦磷酸、 C〇Cl2、MgCl2、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、NaF中的任意一種或其組合。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的擴(kuò)增，即PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建， 具體是指:設(shè)計引物序列，以相應(yīng)菌株全基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用內(nèi)切酶酶切并連接 到經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切的表達(dá)質(zhì)粒載體上； 所述的引物序列包括： tal-上游引物，如Seq ID No. 6所示，具體為：5 ' -GGAATTCCATATGATGAAGATCTTTCTGGAC- 3、tal-下游引物，如Seq ID No·7所示，具體為：5'-ACGCGTCGACTTATTTCTTCAGGTTCTC-3' ； tk-上游引物，如Seq ID No·8所示，具體為：5'-GGAATTCCATATGATGGAAAGGTTTCCCTAT-3'、tk-下游引物，如Seq ID No·9所示，具體為：5'-ACGCGTCGACTTAGAGCATCTCTCTGAG-3' ； r5p3e_上游引物，如Seq ID No. 10所示，具體為：5 GGAATTCCATATGATGGTGAAAATAGCAGCTTC-3'、r5p3e-下游引物，如Seq ID No. 11所示，具體 為：5 '-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTCAGCAAATTCC-3'； ri-上游引物，如Seq ID No· 12所示，具體為：5'-GGAATTCCATATGGTGAAGATCGCTATTGC- 3'、ri下游引物，如Seq ID No· 13所示，具體為:5'-ACGCGTCGACTTAAACCTCATCGATC-3' ； vala-上游引物，如Seq ID Νο·14所示，具體為：5'_ GGAATTCCATATGATGACCATGACCAAGCAGAG-3'、vala-下游引物，如Seq ID No. 15所示，具體為： 5 '-ACGCGTCGACTCACACCCCCATGTCCACGGCACCG-3'； 其中劃線部分是相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。
【文檔編號】C12N15/70GK105838744SQ201610264164
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】鐘建江, 黃松燕
【申請人】上海交通大學(xué)