腸桿菌ly6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用及發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明為腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用及發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用，給工業(yè)上提供一種新方法。所述的腸桿菌LY6其拉丁文名Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO 9539。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件簡單，操作簡便，生產(chǎn)成本低，吲哚乙酸產(chǎn)率高。含吲哚乙酸的發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用，所述農(nóng)作物為水稻、小麥、玉米、油菜、蔬菜、水果，在農(nóng)作物催芽、生根及種植過程中施用含吲哚乙酸的發(fā)酵液，可有效促進(jìn)作物發(fā)芽、生根及生長，減少化肥使用量，增加作物產(chǎn)量。CGMCC No.953920140825
【專利說明】腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用及發(fā)酵液在農(nóng)作物 生根促長上的應(yīng)用
[0001 ]
技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及植物生理活性物質(zhì)的微生物發(fā)酵制備領(lǐng)域，具體涉及微生物新菌株發(fā)酵生 產(chǎn)吲哚乙酸的方法以及吲哚乙酸發(fā)酵液的應(yīng)用方法。
[0002]
【背景技術(shù)】： 吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)是天然植物生長素的主要活性成分，參與植物發(fā)育 的諸多過程。微生物可通過分泌吲哚乙酸促進(jìn)植物生長。IAA可增加植物根的大小及分布， 有利于根從土壤中吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)。產(chǎn)生植物激素是微生物與宿主植物相互作用的主 要機(jī)制之一。在外添加 L-色氨酸的條件下，Klebsiella planticola能產(chǎn)生85.5 yg/mL的 IAA，能顯著增加菜豆根長和根量，并能在低溫條件下刺激黃瓜種子萌發(fā)和根的發(fā)育。 Arthrobacter pascens ZZ21耐鹽堿，解磷，并能降解焚蒽，既能分泌IAA促進(jìn)作物生長，又 能修復(fù)土壤污染。對(duì)具有分泌IAA能力的微生物進(jìn)行研究，提高IAA產(chǎn)率，放大生產(chǎn)，有利于 將植物促生細(xì)菌應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。
[0003] 在微生物中，色氨酸是其IAA生物合成途徑的前體物質(zhì)。IAA的生物合成途徑，以 IAA合成的中間體命名，可分為吲哚丙酮酸途徑、吲哚乙酰胺途徑、色氨酸側(cè)鏈途徑、色胺途 徑和吲哚乙睛途徑等5種IAA的生物合成途徑，而且在一種細(xì)菌中可能存在者不止一條的 IAA合成途徑。
[0004] 許多因素，如溫度、pH值及營養(yǎng)成分都會(huì)影響細(xì)菌IAA的合成。實(shí)驗(yàn)證明，一種特定 的微生物會(huì)根據(jù)其所處的環(huán)境條件，從其能夠合成IAA的幾種途徑中選擇一種來合成IAA， 如Rhizobium在與宿主植物作用時(shí)通過吲噪乙酰胺途徑合成IAA，而自生狀態(tài)的Rhizobium 通過Π 引噪丙酮酸途徑合成IAAl.fluorescens CHAO在pH值偏酸性時(shí)優(yōu)先利用色氨酸側(cè)鏈 途徑合成IAA。酸性環(huán)境對(duì)Pseudomona的一些種不僅會(huì)通過抑制細(xì)菌生長而導(dǎo)制生長素合 成總量的降低，還會(huì)降低單個(gè)細(xì)胞的IAA產(chǎn)量。另外葡萄糖的濃度也會(huì)影響IAA合成，高于或 低于最適量時(shí)都會(huì)使IAA產(chǎn)量降低。Escherichia sp. wz-1977以葡萄糖為底物時(shí)以合成菌 體蛋白為主，以果糖為底物時(shí)以生成吲哚為主。盡管色氨酸可以提高IAA的產(chǎn)量，而色氨酸 的合成前體，鄰氨基苯甲酸對(duì)IAA的合成有抑制作用。因此IAA的合成是由色氨酸和鄰氨基 苯甲酸這兩個(gè)化合物參與的精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，即鄰氨基苯甲酸抑制IAA合成，色氨酸反饋抑 制鄰氨基苯甲酸合成酶(催化分支酸轉(zhuǎn)化為鄰氨基苯甲酸）。通過抑制鄰氨基苯甲酸的合 成，色氨酸間接的誘導(dǎo)了 IAA合成。
[0005] 目前，國內(nèi)外對(duì)于產(chǎn)吲哚乙酸的微生物菌株種類較多，且合成吲哚乙酸的代謝途 徑亦基本探明，但未進(jìn)行微生物發(fā)酵合成吲哚乙酸的生產(chǎn)放大，未進(jìn)行發(fā)酵過程工藝參數(shù) 及培養(yǎng)基成分的探索設(shè)計(jì)。
[0006] 微生物合成吲哚乙酸，一方面，可減少調(diào)節(jié)劑化學(xué)合成過程的環(huán)境污染；另一方 面，發(fā)酵液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，易被植物吸收，在吲哚乙酸促進(jìn)細(xì)胞分裂的同時(shí)保證養(yǎng) 分吸收，實(shí)現(xiàn)"調(diào)節(jié)劑-養(yǎng)分"的協(xié)同作用，對(duì)作物抗逆增產(chǎn)起積極作用。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的在于提供一種微生物新菌株在在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用及發(fā)酵液 在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的： 腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)π引噪乙酸上的應(yīng)用。所述的腸桿菌LY6其拉丁文名Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC N0 9539。
[0009] 所述的腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用，選用最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，培 養(yǎng)基成分由以下重量百分比計(jì):胰蛋白胨〇.5-1%、酵母膏0.3-0.5%、NaCl 0.5-1%、葡萄糖 0.25-5%、水lL、pH 7.2;121°C滅菌20min以后冷卻至37°C，接種腸桿菌菌株LY6,通氣發(fā)酵 12h以后補(bǔ)加下列物質(zhì)：果糖0.5-l%、L-色氨酸0.08-0.2%、丙酮酸鈉 0.01-0.03%、硫酸銅 0 ·01%;維持溫度35-37°C、pH7 · 0-7 · 5、攪拌速度 140-180r/min、發(fā)酵罐壓力0 · 05-0· 08Mpa、 溶氧30-80mg/kg，發(fā)酵36-48h。發(fā)酵結(jié)束后加入穩(wěn)定劑，即成為含吲哚乙酸450.8-812.6mg/ kg的發(fā)酵液。
[0010]所述的含吲哚乙酸的發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用。
[0011] 所述的含吲哚乙酸的發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用，所述農(nóng)作物為水稻、小 麥、玉米、油菜、蔬菜、水果，在農(nóng)作物催芽、生根及種植過程中施用含吲哚乙酸的發(fā)酵液，可 有效促進(jìn)作物發(fā)芽、生根及生長，減少化肥使用量，增加作物產(chǎn)量。
[0012] 本發(fā)明提供的腸桿菌LY6發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸的方法，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件簡單，操作 簡便，生產(chǎn)成本低，吲哚乙酸產(chǎn)率高，易于大規(guī)模生產(chǎn)，節(jié)能環(huán)保，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益巨大。
[0013]
【具體實(shí)施方式】： 實(shí)施例1: 腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用，具體操作如下： 1、材料及設(shè)備 菌株:腸桿菌LY6其拉丁文名Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0 9539。該腸桿菌的發(fā)明專利申請(qǐng)已 經(jīng)于2015年6月10日被中國專利局公布。
[0014] 發(fā)酵設(shè)備:發(fā)酵罐及發(fā)酵控制系統(tǒng)。
[0015] 2、操作方法及步驟 (1)種子液制備:將腸桿菌(Enterobacter sp. )LY6斜面菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中， 35 °C、150r/min振蕩培養(yǎng)，待菌液在600nm波長下吸光度達(dá)0.7時(shí)，按3%接種量(V/V)接種到 裝有LB液體培養(yǎng)基的種子發(fā)酵罐中，35°C，攪拌速度180r/min，通無菌空氣進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵 7h，菌液為二級(jí)種子液。LB培養(yǎng)基成分為：胰蛋白胨10 g·!/1，酵母膏5 g.I/SNaCl 10 g · L-SpH 7.2〇
[0016] (2)接種及發(fā)酵:將發(fā)酵所用培養(yǎng)基121°C滅菌20min以后冷卻至37°C，將二級(jí)種子 液接種到已經(jīng)滅菌冷卻的發(fā)酵所用培養(yǎng)基中（發(fā)酵所用培養(yǎng)基成分如下，按重量百分比計(jì)： 胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.4%、NaCl 0.7%、葡萄糖2%、水lL、pH 7.2)，通氣發(fā)酵1211以后補(bǔ) 加下列物質(zhì)：果糖〇 . 7%、L-色氨酸0.12%、丙酮酸鈉0.02%、硫酸銅0.01%;維持溫度36°C、 pH7 · 2、攪拌速度160r/min、發(fā)酵罐壓力0 · 07Mpa、溶氧50mg/kg，發(fā)酵40h。發(fā)酵結(jié)束后加入穩(wěn) 定劑，即成為含吲哚乙酸575. 2mg/kg的發(fā)酵液。
[0017] 實(shí)施例2: 含吲哚乙酸的發(fā)酵液在促進(jìn)作物生長上的應(yīng)用，具體操作如下： 1、 材料 菌株:腸桿菌(Enterobacter sp.)LY6 生根材料:葡萄扦插條 種植介質(zhì):珍珠巖:砂為重量比4:1的混合物 種植容器:容積為2升的栽培盆 2、 操作方法及步驟 (1)含吲哚乙酸的發(fā)酵液菌液制備：同實(shí)施例1。
[0018] (2)葡萄扦插條的裝備：用枝剪將葡萄枝條芽點(diǎn)剪為鍥形，向上第二個(gè)芽點(diǎn)以上 2cm出剪斷，為一個(gè)扦插條。
[0019] (3)處理：用高效液相色譜測定含吲哚乙酸的微生物菌液中吲哚乙酸含量，將菌液 依次稀釋成吲哚乙酸濃度為1、5、10、15、20mg/kg的使用液劑(簡稱FIAA)，并配制相同濃度 的化學(xué)合成的吲哚乙酸(簡稱CIAA)，同時(shí)設(shè)置不做清水為陰性對(duì)照，滅菌的發(fā)酵所用培養(yǎng) 基為陽性對(duì)照。每個(gè)濃度及處理設(shè)置三根扦插條。將扦插條放入上述所設(shè)置的液體中，浸泡 基部5h后插入介質(zhì)中，保持介質(zhì)濕潤。30d后取出插條觀察插條基部愈傷組織誘導(dǎo)及生根情 況，并測定每組處理三根扦插條根鮮總重。
[0020] 結(jié)果如下表：
根據(jù)上述試驗(yàn)效果表明，本發(fā)明提供的腸桿菌(Enterobacter sp. )LY6具有很強(qiáng)的產(chǎn) 生吲哚乙酸的能力，發(fā)酵后含吲哚乙酸的發(fā)酵液能促進(jìn)作物生長，特別誘導(dǎo)根的生長，與化 學(xué)合成的吲哚乙酸效果相當(dāng)，甚至優(yōu)于化學(xué)合成的吲哚乙酸效果。因此，在促進(jìn)作物生長方 面具有良好的應(yīng)用前景。
[0021] 上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上 述主題的范圍僅限于上述實(shí)施例。凡基于上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用，所述的腸桿菌LY6其拉丁文名 Enterobacter sp.，2014年8月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保藏號(hào)為CGMCC NO 9539。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸桿菌LY6在發(fā)酵生產(chǎn)吲哚乙酸上的應(yīng)用，其特征在于選用最 適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基成分由以下重量百分比計(jì):胰蛋白胨〇.5-1%、酵母膏0.3_ 0.5%、NaCl 0.5-1%、葡萄糖 0.25-5%、水lL、pH 7.2;121°C滅菌20min以后冷卻至37°C，接種 腸桿菌菌株LY6,通氣發(fā)酵12h以后補(bǔ)加重量百分比計(jì)下列物質(zhì)：果糖0.5-l%、L-色氨酸 0.08-0.2%、丙酮酸鈉0.01-0.03%、硫酸銅0.01%;維持溫度35-37°(：4!17.0-7.5、攪拌速度 140-180r/min、發(fā)酵罐壓力0 · 05-0 · 08Mpa、溶氧30-80mg/kg，發(fā)酵36-48h，發(fā)酵結(jié)束后加入 穩(wěn)定劑，即成為含吲噪乙酸450.8-812.6mg/kg的發(fā)酵液。3. 含吲哚乙酸的發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的含吲哚乙酸的發(fā)酵液在農(nóng)作物生根促長上的應(yīng)用，其特征在 于所述農(nóng)作物為水稻、小麥、玉米、油菜、蔬菜、水果，在農(nóng)作物催芽、生根及種植過程中施用 含吲哚乙酸的發(fā)酵液，可有效促進(jìn)作物發(fā)芽、生根及生長，減少化肥使用量，增加作物產(chǎn)量。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105838750SQ201610184685
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月29日
【發(fā)明人】王強(qiáng)鋒, 侯勇, 朱彭玲, 夏中梅, 曾蕓, 王赟, 黃秀輝, 曾顯斌
【申請(qǐng)人】四川省蘭月科技有限公司