ddPCR技術(shù)監(jiān)控結(jié)直腸癌患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種ddPCR技術(shù)監(jiān)控結(jié)直腸癌患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥的方法，及其在監(jiān)控帕尼單抗/西妥昔單抗治療結(jié)直腸癌過程中的應(yīng)用。本發(fā)明首先對(duì)結(jié)直腸癌患者外周血漿進(jìn)行DNA抽提，再利用ddPCR技術(shù)檢測(cè)其中KRAS的耐藥突變位點(diǎn)G13D的突變情況，并以此判定該患者是否產(chǎn)生耐藥。
【專利說明】
ddPCR技術(shù)監(jiān)控結(jié)直腸癌患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐 藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及可用于指導(dǎo)腫瘤治療的分子檢測(cè)技 術(shù)，尤其是高靈敏度地檢測(cè)外周血漿中KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D基因突變的方法及其 在監(jiān)控結(jié)直腸癌患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥性等方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物醫(yī)藥科技的發(fā)展，分子祀向藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療中，與常規(guī) 化療相比，祀向治療具有效果好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，部分患者對(duì)祀向藥 物會(huì)產(chǎn)生耐藥性。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)研究表明，90% W上的腫瘤患者在治療過程中不同程度上 受耐藥影響。腫瘤細(xì)胞的耐藥性分為為原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥。前者在治療開始時(shí)癌細(xì) 胞對(duì)藥物即不敏感，后者是指原來對(duì)藥物敏感的癌細(xì)胞群，在反復(fù)治療經(jīng)與藥物屢次接觸 的過程中出現(xiàn)了耐藥性。
[0003] Ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有S種出-ras、K-ras和N-ras，分別定位在 11、12和1號(hào)染色體上。作為原癌基因的ras基因被激活后就變成有致癌活性的癌基因， ras基因通過突變而激活。其中，K-ras則對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開關(guān)：當(dāng)正常時(shí) 能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則不受上游EGFR的信號(hào)影響，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生 長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。運(yùn)也是具有突變型K-ras基因患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗治 療無效的理論基礎(chǔ)。
[0004] 近期研究表明，KRAS基因的突變是造成很多患者對(duì)"抗-EGFR抗體"產(chǎn)生獲 得性抗藥性的原因。Misale等人通過細(xì)胞系模型發(fā)現(xiàn)，KRAS突變會(huì)造成對(duì)"西妥昔單 抗"（cetuxim油）的抗藥性。在用"西妥昔單抗"或"帕尼單抗"治療的結(jié)腸直腸癌患者中， 抗藥性與事先存在的亞克隆選擇的KRAS突變或者治療過程中獲得的突變相關(guān)。Diaz等還 發(fā)現(xiàn)，KRAS突變?cè)趯?duì)"帕尼單抗"有抗藥性的患者中會(huì)積累。因此，檢測(cè)病人KRAS基因是否 突變成為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能否持續(xù)使用帕尼單抗/西妥昔單抗的必要前提條件。
[0005] 繼發(fā)性耐藥檢測(cè)一般在服用分子祀向藥物之后進(jìn)行，有研究發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)性耐藥突 變存在累積效應(yīng)，在服用藥物之前，也有患者體內(nèi)已經(jīng)存在微小的耐藥突變；因此，也可在 治療之前進(jìn)行繼發(fā)性突變位點(diǎn)檢測(cè)，超早期發(fā)現(xiàn)其耐藥情況。然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要 W腫瘤組織的基因組DNA為模板，運(yùn)為患者在治療過程中的多次檢測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)控帶來了困 難。
[0006] 血漿游離DNA (C巧NA)含有循環(huán)腫瘤DNA (CtDNA)，對(duì)血漿中游離DNA進(jìn)行定量和定 性的檢測(cè)可反映出腫瘤的特征性變化，近年來的研究表明，血漿游離DNA可作為一個(gè)監(jiān)控 腫瘤負(fù)荷的可靠指標(biāo)。rfDNA檢測(cè)僅需少量外周血樣本，操作簡(jiǎn)便，無創(chuàng)，可重復(fù)檢測(cè)。
[0007] 研究還表明，血液中的游離DNA是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，其主要成分是小片 段的雙鏈DNA，存在形式主要包括與DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物形式或純粹的游離形式。
[0008] 然而，由于血漿游離DNA在血液中含量極少，且有大量血源DNA干擾，即使采用高 效的DM富集手段進(jìn)行分離純化并配合高靈敏度的檢測(cè)手段（如測(cè)序、數(shù)字PCR)，仍難W準(zhǔn) 確而可靠地檢測(cè)出與腫瘤相關(guān)的游離DNA的具體種類和序列。例如，有文獻(xiàn)報(bào)道，雖然大腸 癌患者中循環(huán)游離DNA的平均含量（4771ng/ml)與健康人的平均含量化85ng/ml)存在顯 著差異，但是對(duì)于67例患者中癌胚抗原（CEA)的檢測(cè)只有47%檢測(cè)結(jié)果對(duì)診斷有意義。
[0009] 因此，雖然基于血液游離DNA的檢測(cè)技術(shù)存為研發(fā)的焦點(diǎn)，但是本領(lǐng)域尚缺乏令 人滿意的、真正能夠滿足臨床上的高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高可靠性的突變DNA檢測(cè)技術(shù)。
[0010] 綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要一種能夠基于非腫瘤組織，高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高可 靠性地檢測(cè)患者中腫瘤相關(guān)突變（如KRAS G13D突變）的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠用非腫瘤組織（如血液或血漿樣品）檢測(cè)患者KRAS G13D突變的方法。
[0012] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的方法，所述 方法包括步驟：
[0013] (1)提供一檢測(cè)樣本，所述的檢測(cè)樣本是血漿樣本或血液樣品；
[0014] (2)對(duì)所述的檢測(cè)樣本進(jìn)行DNA抽提處理，從而獲得含抽提DNA的DNA抽提物，其 中對(duì)于每2毫升的檢測(cè)樣本而言，所述DNA抽提物是體積為20-100微升且DNA濃度大于 3化g/微升的提取液；
[0015] (3) W步驟（2)所得到的DNA提取物為模板，進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)，從而獲 得含所述的耐藥突變位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；和
[0016] (4)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而得出KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)的突變形式和/ 或比例。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的耐藥突變位點(diǎn)選自下組：KRAS G13D。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的血漿樣本是用外周血進(jìn)行分離得到。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)樣本是血漿樣本。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的血漿樣本是用外周血樣本經(jīng)預(yù)處理獲得。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的預(yù)處理包括： 陽02引 （a)將采集的外周血至于非肝素的抗凝管（如邸TA抗凝、和/或ACD抗凝的抗凝 管））中；
[0023] 化）經(jīng)一級(jí)離屯、處理，去除沉淀，分離獲得液相（血漿）；
[0024] (C)對(duì)上一步驟的獲得的液相進(jìn)行二級(jí)離屯、，去除沉淀，分離獲得液相作為用于提 取DNA的檢測(cè)樣本。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，所述的一級(jí)離屯、包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)條件：
[0026] 化-i) 2000-5000rmp ;
[0027] 化-ii)離屯、約1-15分鐘；
[0028] (b-i i U 溫度 0-8 °C，較佳地 4 ± 2 °C。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的一級(jí)離屯、包括選自下組的一個(gè)或多個(gè)條件：
[0030] (c-i) 10000-15000rmp ；
[0031] (c-ii)離屯、約 5-30 分鐘；
[0032] (c-iii)溫度 0-8°C，較佳地 4±2°C。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（3)中，所述ddPCR擴(kuò)增所使用的DNA模板量為50~ lOOng。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變是KRAS G13D。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，在ddPCR中，反應(yīng)體系中含有PCR擴(kuò)增引物對(duì)，W及用于檢測(cè)突 變位點(diǎn)的探針。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，ddPCR中所用的PCR擴(kuò)增引物對(duì)為包含KRAS G13D突變位點(diǎn)的 特異引物對(duì)。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的引物對(duì)的序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的引物對(duì)的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變型探針的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示； 所述的野生型探針的序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6所示。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針包括：突變型特異探針和野生 型特異探針。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變型探針為FAM探針，所述的野生型探針為肥X探針；
[0042] 或所述的突變型探針為肥X探針，所述的野生型探針為FAM探針。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變型探針的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示； 所述的野生型探針的序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6所示。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系包括：待測(cè)基因組50~l(K)ng， 2XddPCR SuperMix for Probes 度io-Rad L油oratories) IOy 1，KRAS G13D 的特異引物對(duì) (9iiM)及探針（5iiM)各 liil。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣本來自于結(jié)直腸癌患者。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，在所述步驟（2)中，所述的抽提處理包括步驟：
[0047] (2a)將血漿樣本，用蛋白酶K進(jìn)行消化處理，從而獲得蛋白質(zhì)被裂解的消化液； W48] 在另一優(yōu)選例中，蛋白酶K的加入量為200 y g/100微升檢測(cè)樣本。 W例在另一優(yōu)選例中，（2a)中還包括：在消化結(jié)束后，對(duì)蛋白酶K進(jìn)行滅活。
[0050] 姊）向所述消化液中加入RNA carrier,處理一段時(shí)間，從而獲得經(jīng)處理的混合 液；
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述RNA carrier的加入量為0. lng/100微升檢測(cè)樣本。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2b)的放置時(shí)間為5-10分鐘。
[0053] (2c)對(duì)上一步驟經(jīng)處理的混合液，用固相載體對(duì)DNA進(jìn)行特異性吸附，從而獲得 吸附有DNA的固相載體；
[0054] (2d)對(duì)上一步驟的吸附有DNA的固相載體，進(jìn)行洗脫，從而獲得含洗脫DNA的洗脫 液，即為含抽提DNA的DNA抽提物。 陽化5] 在另一優(yōu)選例中，所述的含洗脫DNA的洗脫液中，DNA含量為20-100ng/微升；和 /或所述含洗脫DNA的洗脫液的體積為20-100微升。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述的含洗脫DNA的洗脫液中，抽提的DNA的大小為100-25化P， 更佳地為150-200bp。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述的含洗脫DNA的洗脫液中，100-200bp的DNA占 DNA總量的 80-100 %，較佳地 90-100 %。
[005引在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體為娃膜。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的洗脫包括:AVE洗脫。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（2d)中，還包括：測(cè)定所述洗脫液中，所述抽提的DNA的 片段大小。
[0061] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒 包括：
[0062] (a)第一容器，W及位于所述容器內(nèi)的用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的特異引物 對(duì)；
[0063] (b)RNA carrier ； W64] (C)使用說明書（如插頁），其中，所述說明書記載了本發(fā)明第一方面所述的方 法； W65] 其中，所述的突變位點(diǎn)包括KRAS G13D。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述的引物對(duì)的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述的引物對(duì)的序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括：
[0069] (d)位于所述第一容器內(nèi)或另一不同容器內(nèi)的用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述的用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針包括：突變型特異探針和野生 型特異探針。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變型探針的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示； 所述的野生型探針的序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6所示。
[0072] 本發(fā)明的第S方面，提供了一種KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)試劑盒，所述試 劑盒包括：
[0073] (a)第一容器，W及位于所述容器內(nèi)的用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的特異引物對(duì)， 并且引物對(duì)的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中所示，或引物對(duì)的序列如SEQ ID NO: 7 和沈Q ID NO:8中所示；
[0074] (b)RNA carrier ；
[0075] (C)使用說明書（如插頁），其中，所述說明書記載了本發(fā)明第一方面所述的方 法；
[0076] (d)位于所述第一容器內(nèi)或另一不同容器內(nèi)的用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針，所述的 用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針包括：突變型特異探針和野生型特異探針；并且所述的突變型探 針的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探針的序列如SEQ ID NO:2 或沈Q ID NO:6所示。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變型探針為FAM探針，所述的野生型探針為肥X探針；
[0078] 或所述的突變型探針為肥X探針，所述的野生型探針為FAM探針。
[0079] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種如本發(fā)明第二方面或本發(fā)明第=方面所述的試劑 盒或其中所述特異性引物對(duì)或探針的用途，用于制備：(a)用于檢測(cè)或判斷腫瘤患者對(duì)帕 尼單抗/西妥昔單抗的耐藥性的試劑盒；化）用于判斷腫瘤患者是否適合使用或繼續(xù)使用 帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療的試劑盒。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤患者包括結(jié)直腸癌患者。
[0081] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤患者為人。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述是檢測(cè)包括在給予帕尼單抗/西妥昔單抗之前、之中、或之 后進(jìn)行檢測(cè)。
[0083] 本發(fā)明的第五方面，提供一種腫瘤患者帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥性的檢測(cè)方 法，包括步驟：用如本發(fā)明第一方面所述的方法進(jìn)行KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)；和
[0084] 若檢測(cè)結(jié)果為陽性，則判定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥；若檢測(cè)結(jié)果為陰 性，則判定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗敏感。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤為結(jié)直腸癌。
[0086] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種腫瘤患者治療方法，包括步驟：
[0087] (a)用如本發(fā)明第一方面所述的方法，對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行KRAS基因耐藥突變位點(diǎn) G13D檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陰性的對(duì)象，采用帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療；
[0088] 化）在一個(gè)或多個(gè)治療周期之中或之后，用如本發(fā)明第一方面所述的方法，對(duì)所述 對(duì)象再次進(jìn)行KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陰性的對(duì)象，繼續(xù)采用帕 尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療；對(duì)于對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽性的對(duì)象，停止采用帕尼單抗/西妥昔 單抗進(jìn)行治療。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，在步驟化）中還包括：記錄首次檢測(cè)到KRAS G13D突變陽性的時(shí) 間。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述的治療周期為3-9個(gè)月。 陽091] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0092] 圖1是ddPCR儀微滴數(shù)目結(jié)果顯示。圖中深灰色代表無擴(kuò)增的游離DNA微滴數(shù)， 藍(lán)色代表突變型細(xì)胞游離DNA微滴數(shù)，綠色代表野生型細(xì)胞游離DNA微滴數(shù)；縱坐標(biāo)代表巧 光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表微滴數(shù)目；其中圖UA.B)顯示了 KRAS G13D位點(diǎn)突變陽性的檢測(cè) 結(jié)果，圖1杞D)顯示了 KRAS G13D位點(diǎn)突變陰性的檢測(cè)結(jié)果。
[0093] 圖2是ddPCR儀微滴巧光信號(hào)分布區(qū)結(jié)果顯示。圖中藍(lán)色代表微滴中只含有突變 型的游離DNA信號(hào)區(qū)，綠色代表微滴中只含有野生型的游離DNA信號(hào)區(qū)，澄色代表微滴中既 含有突變型又含有野生型的游離DNA信號(hào)區(qū)，深灰色代表無擴(kuò)增的游離DNA信號(hào)區(qū)；縱坐標(biāo) 代表FAM通道巧光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表肥X通道巧光信號(hào)強(qiáng)度；其中圖2(A)顯示了 KRAS G13D位點(diǎn)突變陽性的檢測(cè)結(jié)果，圖2做顯示了 KRAS G13D位點(diǎn)突變陰性的檢測(cè)結(jié)果。
[0094] 圖3顯示實(shí)施例中KRAS (G13D)突變陽性的檢測(cè)結(jié)果。其中圖3 (A)為該檢測(cè)位點(diǎn) 的突變型檢測(cè)結(jié)果圖，圖3度）為該檢測(cè)位點(diǎn)的野生型檢測(cè)結(jié)果圖；圖中深灰色代表無擴(kuò)增 的游離DNA微滴數(shù)，藍(lán)色代表突變型細(xì)胞游離DNA微滴數(shù)，綠色代表野生型細(xì)胞游離DNA微 滴數(shù)；縱坐標(biāo)代表巧光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表微滴數(shù)目。 陽0巧]圖4為實(shí)施例1中的血漿游離DNA跑膠圖。
【具體實(shí)施方式】
[0096] 本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期而深入的研究，通過對(duì)于大量方法和試劑的篩選，意外地發(fā)現(xiàn)， 通過改進(jìn)的血漿樣本制備和添加特定的富集劑（如RNA carrier)，并結(jié)合微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)和高特異性的引物序列和探針序列，居然可W用外周血漿樣本高效地提取到的腫瘤相 關(guān)性的DNA分子，從而高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高可靠性地檢測(cè)患者中KRAS G13D突變，從而 可輔助判斷患者是否對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本 發(fā)明。
[0097] 術(shù)語
[009引如本文所用，術(shù)語"腫瘤相關(guān)突變"指與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、治療、和/或預(yù)后相關(guān) 的基因突變，尤其是與腫瘤治療的耐藥性相關(guān)的DNA突變。
[0099] 如本文所用，術(shù)語"本發(fā)明突變"、"本發(fā)明的耐藥性突變"或"KRAS G13D突變"可 互換使用，指KRAS蛋白的G13D突變（在蛋白質(zhì)水平，KRAS蛋白第12/13號(hào)氨基酸均由甘 氨酸（G)突變?yōu)槠渌被?，如天冬氨酸?、鄉(xiāng)氨酸（V)、半脫氨酸（C)、絲氨酸（巧等（優(yōu) 選為由甘氨酸（G)突變?yōu)樘於彼嶂?），W及導(dǎo)致該氨基酸突變的相應(yīng)的核巧酸突變（基 因水平）。研究表明，通過檢測(cè)KRAS G13D運(yùn)一突變位點(diǎn)的突變情況，對(duì)于腫瘤患者是否采 用或繼續(xù)采用帕尼單抗/西妥昔單抗治療，有指導(dǎo)作用。
[0100] 如本文所用，術(shù)語"非腫瘤組織"指與腫瘤組織不同的組織。在本發(fā)明中，對(duì)于實(shí) 體瘤而言，血液和血漿可視為"非腫瘤組織"。 陽101] 如本文所用，術(shù)語"RNA Carrier"為一種市售的、用于協(xié)助分離RNA的試劑。其成 分為ployG偶聯(lián)到DNAmate-種高分子化合物。研究表明，RNA Carrier能特異吸附低濃 度RNA，并且有助于減少提取過程中RNA被RNase降解。然而，研究表明，RNA Carrier對(duì)于 常規(guī)雙鏈DNA的提取無促進(jìn)作用。 陽102] 本發(fā)明的目的是提供一種用ddPCR技術(shù)通過檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血漿或血清 中KRAS基因突變W判定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥的方法。 陽103] 本發(fā)明的另一目的是提供根據(jù)KRAS基因突變推測(cè)結(jié)直腸癌患者對(duì)帕尼單抗/西 妥昔單抗產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的時(shí)間的方法。
[0104] 本發(fā)明的最終目的是利用ddPCR技術(shù)，檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血漿或血清中KRAS G13D的突變情況，再根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定患者是否對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥，并推測(cè)患 者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的時(shí)間，為調(diào)整結(jié)直腸癌患者治療方案提供指 導(dǎo)。 陽1化]外周血樣本中提取DNA模板 陽106] 由于外周血樣本中可用于有效檢測(cè)腫瘤相關(guān)性的DNA的量非常少，因此需通過一 定的富集手段對(duì)外周血游離DNA進(jìn)行富集，W得到能夠用于檢測(cè)量的DNA。 陽107] 本發(fā)明中，優(yōu)選的DNA的抽提方法如下：
[0108] (2a)將血漿或血清樣本，用蛋白酶K進(jìn)行消化處理，從而獲得蛋白質(zhì)被裂解的消 化液；
[0109] 姊）向所述消化液中加入RNA carrier,處理一段時(shí)間，從而獲得經(jīng)處理的混合 液；
[0110] 在另一優(yōu)選例中，所述RNA carrier的加入量為0. lng/100微升檢測(cè)樣本。 陽111 ] 在另一優(yōu)選例中，步驟（2b)的放置時(shí)間為5-10分鐘。
[0112] (2c)對(duì)上一步驟經(jīng)處理的混合液，用固相載體對(duì)DNA進(jìn)行特異性吸附，從而獲得 吸附有DNA的固相載體；
[011引 （2d)對(duì)上一步驟的吸附有DNA的固相載體，進(jìn)行洗脫，從而獲得含洗脫DNA的洗脫 液，即為含抽提DNA的DNA抽提物。
[0114] 完成上述抽提后，所得到的的含洗脫DNA的洗脫液中，DNA含量通常為20-100ng/ 微升，所述含洗脫DNA的洗脫液的體積通常為20-100微升。
[0115] 在另一優(yōu)選例中，所述的含洗脫DNA的洗脫液中，抽提的DNA的平均大小通常為 《300bp(即基本由游離DNA組成），較佳地為100-250bp，更佳地為150-200bp。
[0116] 在另一優(yōu)選例中，所述的含洗脫DNA的洗脫液中，100-200bp的DNA占 DNA總量的 80-100 %，較佳地 90-100 %。
[0117] 在另一優(yōu)選例中，所述的固相載體為娃膜。
[0118] 在另一優(yōu)選例中，所述的洗脫包括:AVE洗脫。
[0119] 在另一優(yōu)選例中，在步驟（2d)中，還包括：測(cè)定所述洗脫液中，所述抽提的DNA的 片段大小。 陽120] KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D的檢測(cè) 陽12U 數(shù)字PCR (digital PCR，dPCR)技術(shù)被稱為"第S代PCR"技術(shù)，是一項(xiàng)檢測(cè)和定量 核酸分子的新技術(shù)，在不依靠任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)的情況下，可直接進(jìn)行單個(gè)目標(biāo)分子的計(jì) 數(shù)，W實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（化oplet digital PCR，ddPCR)將含有核酸分 子的反應(yīng)體系分成上萬個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴不含或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)帶有目標(biāo) 基因突變的DNA片段。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行巧光檢測(cè)，因此具有極高的靈敏 度，能用于檢測(cè)血液中含量極低的腫瘤游離DNA。與傳統(tǒng)PCR、定量PCR相比，其結(jié)果的精確 度、準(zhǔn)確性和靈敏度更佳。該技術(shù)能夠確認(rèn)拷貝數(shù)極低的待檢祀分子的絕對(duì)數(shù)目，特別適合 拷貝數(shù)變異、熱點(diǎn)突變和基因相對(duì)表達(dá)等方面的檢測(cè)。
[0122] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的DNA模板是用外周血分離的血漿或血清提取的，較佳地，在提 取DNA模板前，將待檢測(cè)的外周血樣本首先進(jìn)行離屯、處理，300化pm，3min，4°C，之后將離屯、 獲得的血漿或血清用移液槍移至2ml的離屯、管中，再次離屯、，13300rpm，10min，4°C，棄沉 淀，上清即為所需抽提DNA的血漿或血清。
[0123] 優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施例中，DNA模板的提取方法如下：
[0124] a)抽提血漿或血清中的游離DNA ; 陽125] (ii)對(duì)樣本進(jìn)行裂解、富集、過柱洗脫和AVE洗脫，得到待擴(kuò)增的DNA模板； 陽126] 任選地，所述方法還包括步驟測(cè)試所述DNA模板的片段大小。
[0127] 本申請(qǐng)的PCR方法中，所使用的引物對(duì)為包含KRAS G13D突變位點(diǎn)的特 異引物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的特異引物具有如SEQ ID N0:3， (AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC)和 SEQ ID N0:4， （CCTCTATTGTTGGATCATATTCG) 所示的序列，或具有如沈Q ID N0:7(AAATGACTGAATATAAACTTGTGGT)和沈Q ID N0:8燈CTATTGTTGGATCATATTCGTC)所示的序列。所用探針包括一條用于檢測(cè)突變型的突 變型特異探針，和一條用于檢測(cè)野生型的野生型特異探針。優(yōu)選地，突變型探針類型為 FAM 探針（例如但并不限于沈Q ID NO: 1，GGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAG 或沈Q ID NO: 5， GTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCA)，所述的野生型探針類型為肥X探針（例如但并不限于SEQ 序列）。
[0128] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的微滴式數(shù)字PCR的反應(yīng)液首先通過QXlOO微滴 發(fā)生器生成納升級(jí)別的油包水的液滴，然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后將PCR板轉(zhuǎn)移到QXlOO微 滴分析儀對(duì)所有樣品孔進(jìn)行巧光檢測(cè)。
[0129] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述的PCR反應(yīng)所使用的反應(yīng)體系每20 y 1 組成如下：待測(cè)腫瘤組織 DNA 50 ~lOOng，2 X ddPCR SuperMix for Probes (Bio-Rad L油oratories) 10 y 1，KRAS G13D的特異引物及探針各I y I，無菌蒸饋水補(bǔ)足至20 y 1。
[0130] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95°C變性IOmin ; 隨后94°C變性30sec，60°C退火60sec，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后98°C延伸10min，4°C保存。 陽131] 本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述的檢測(cè)方法包括W下步驟：
[0132] (1)提取患者血清/血漿中游離DNA :抽取患者外周血4mU分離得到血漿/血清， 利用"QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit"對(duì)血漿/血清中游離DNA進(jìn)行抽提。通過 對(duì)樣本的溶解、富集、過柱洗脫W及最后AVE洗脫獲得高濃度/高純度的DNA，最后通過瓊脂 糖凝膠電泳確定其片段大?。?lt;313bp)，W保證抽提質(zhì)量。 陽133] (2)反應(yīng)體系配制
[0134] a.探針及引物設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)所用引物為包含KRAS密碼子G13D位點(diǎn)的特異引物，所 用探針包括每個(gè)位點(diǎn)各一條突變型特異探針和野生型特異探針。突變型探針標(biāo)記為FAM巧 光，野生型探針標(biāo)記為肥X巧光。 陽13引 b. 20 y 1 PCR反應(yīng)體系如下：待測(cè)患者血漿游離DNA 50~lOOng，2 X ddPCR SuperMix for Probes(BiC)-Rad L油oratories) 10 Ji 1，KRAS 密碼子 12/13 位點(diǎn)野生型和突 變型的探針引物（已混合配制好）各Iy 1，無菌蒸饋水補(bǔ)足至20 iil。 陽136] (3)制備微滴
[0137] 在DG8?微滴發(fā)生卡上相對(duì)應(yīng)的孔中加入20ul上述PCR反應(yīng)液，70ul微滴發(fā)生專 用油，蓋上微滴發(fā)生卡密封墊，放入QXlOO微滴發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，QXlOO微滴發(fā)生器最多 能同時(shí)處理8個(gè)樣品。將處理好的微滴緩慢轉(zhuǎn)移到96孔板上，完成全部的樣本轉(zhuǎn)移后，將 96孔板放在熱封儀上，蓋上熱封膜進(jìn)行封膜。 陽 138] (4) PCR 擴(kuò)增
[0139] 將已制備好的微滴按照已優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條 件為：95°C變性IOmin ;隨后94°C變性30sec，60°C退火60sec，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后98°C延 伸 10min，4°C 保存。
[0140] 巧）微滴檢測(cè) 陽14U PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR板轉(zhuǎn)移到QXlOO微滴分析儀度io-Rad L油oratories USA) 上，編輯好樣本信息，對(duì)所有樣品孔進(jìn)行巧光檢測(cè)。
[0142] (6)結(jié)果分析 陽143] 在野生型片段有擴(kuò)增（在肥X巧光信號(hào)區(qū)域有微滴分布）的前提下存在突變型片 段的擴(kuò)增（在FAM巧光信號(hào)區(qū)域有微滴分布），則判斷該基因有突變，KRAS G13D位點(diǎn)突變 陽性。
[0144] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，檢測(cè)ddPCR儀微滴巧光信號(hào)分布區(qū)結(jié)果如圖I所示， 圖中，藍(lán)色代表微滴中只含有突變型的游離DNA信號(hào)區(qū)，綠色代表微滴中只含有野生型的 游離DNA信號(hào)區(qū)，澄色代表微滴中既含有突變型又含有野生型的游離DNA信號(hào)區(qū)，深灰色代 表無擴(kuò)增的游離DNA信號(hào)區(qū)?？v坐標(biāo)代表FAM通道巧光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表肥X通道巧 光信號(hào)強(qiáng)度。其中，圖IA顯示了 KRAS G13D突變陽性的檢測(cè)結(jié)果，圖IB顯示了 KRAS G13D 突變陰性的檢測(cè)結(jié)果。
[0145] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中的ddPCR儀微滴數(shù)目檢測(cè)結(jié)果如圖2所顯示。圖中， 深灰色代表無擴(kuò)增的游離DNA微滴數(shù)，藍(lán)色代表突變型細(xì)胞游離DNA微滴數(shù)，綠色代表野生 型細(xì)胞游離DNA微滴數(shù)?？v坐標(biāo)代表巧光信號(hào)強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表微滴數(shù)目。其中圖2A顯示 了 KRAS G13D突變陽性的檢測(cè)結(jié)果，圖2B顯示了 KRAS G13D突變陰性的檢測(cè)結(jié)果。 陽146] 帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥性判斷
[0147] 由于KRAS G13D突變陽性與患者（優(yōu)選為結(jié)直腸癌患者）帕尼單抗/西妥昔單 抗耐藥性相關(guān)化RAS蛋白第13號(hào)氨基酸由甘氨酸（G)突變?yōu)樘於彼嶂?），因此，本發(fā)明 的檢測(cè)方法可W用于輔助判斷患者是否對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥。本申請(qǐng)利用 ddPCR技術(shù)檢測(cè)接受帕尼單抗/西妥昔單抗治療的結(jié)直腸癌患者外周血漿或血清中KRAS G13D的突變情況，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定患者是否對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥，并推測(cè)患者 對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的時(shí)間，為調(diào)整結(jié)直腸癌患者治療方案提供指導(dǎo)。
[0148] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，取患者外周血樣本并提取基因組DNA，W待測(cè)外周血漿 或血清基因組DNA為模板，利用上述方法對(duì)KRAS基因的耐藥突變位點(diǎn)G13D進(jìn)行檢測(cè)，然后 根據(jù)檢測(cè)到KRAS基因的G13D位點(diǎn)突變陽性的時(shí)間確定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗產(chǎn)生 耐藥的時(shí)間。
[0149] 由于本發(fā)明方法可W采用較易采樣的外周血樣本進(jìn)行檢測(cè)，因此，所述的檢測(cè)可 W多次進(jìn)行，從而在患者的治療過程中實(shí)時(shí)監(jiān)控。
[0150] 本發(fā)明方法既可W在用藥前對(duì)患者的耐藥性進(jìn)行判斷，也可W在用藥過程中或之 后判斷患者是否已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，從而為后續(xù)治療提供指導(dǎo)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所 述的結(jié)直腸癌患者可W是尚未使用帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療的結(jié)直腸癌患者，也可 W是已經(jīng)開始使用帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療的患者。 陽151] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，在每個(gè)治療周期前后，取結(jié)直腸癌患者外周血樣本，分 離血漿或血清并提取基因組DNA，W待測(cè)外周血漿或血清基因組DNA為模板，利用ddPCR技 術(shù)對(duì)KRAS基因的耐藥突變位點(diǎn)G13D進(jìn)行檢測(cè)，然后根據(jù)檢測(cè)到KRAS基因的G13D位點(diǎn)突 變的陽性或陰性，確定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗是否產(chǎn)生耐藥。 陽152] 若檢測(cè)結(jié)果為KRAS密碼子G13D位點(diǎn)突變陰性，則患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗 敏感；若檢測(cè)結(jié)果為KRAS密碼子G13D位點(diǎn)突變陽性，則患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐 藥。 陽153] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，利用ddPCR技術(shù)通過檢測(cè)外周血漿或血清中基因 突變W監(jiān)控結(jié)直腸癌患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥的方法包括如下步驟：
[0154] (1)提取結(jié)直腸癌患者血漿/血清中的游離DNA ;
[0155] 似W待測(cè)的游離DNA為模板，分別用KRAS G13D位點(diǎn)的野生型和突變型探針引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增和ddPCR分析；
[0156] (3)根據(jù)ddPCR對(duì)目的基因位點(diǎn)突變情況的檢測(cè)結(jié)果，分析患者對(duì)帕尼單抗/西妥 昔單抗的耐藥情況； 陽157] (4)根據(jù)患者出現(xiàn)KRAS密碼子G13D位點(diǎn)突變陽性的時(shí)間判定其對(duì)帕尼單抗/西 妥昔單抗產(chǎn)生耐藥的時(shí)間。
[0158] 其中，所述ddPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件沒有特別的限制，在本發(fā)明的另一 優(yōu)選實(shí)施例中，所述的步驟（2)中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20^1，具體組成成分 如下：待測(cè)患者血漿游離 DNA 50 ~100ng，2XddPCR SuperMix for Probes(BiC)-Rad Uboratories) 10 y 1，KRAS密碼子G13D位點(diǎn)野生型和突變型的探針引物（已混合配制好） 各1 y 1，無菌蒸饋水補(bǔ)足至20 y 1。 陽159] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟似中PCR反應(yīng)條件為：95°C變性 IOmin ;隨后94°C變性30sec，60°C退火60sec，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后98°C延伸lOmin，4°C保 存。
[0160] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，有W下優(yōu)點(diǎn)： 陽161] (1)本發(fā)明的檢測(cè)方法具有較高的靈敏度化001%)(即可W從10萬個(gè)正常DNA 分子中檢測(cè)到一個(gè)突變分子的存在），僅需使用l(K)ng的DNA模板即可完成檢測(cè)。 陽16引 （2)本發(fā)明的檢測(cè)方法僅需使用檢測(cè)對(duì)象的外周血漿或血清游離DNA即可完成檢 ，無需采集腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，無創(chuàng)，可重復(fù)進(jìn)行。 陽163] (3)使用本發(fā)明方法，可W準(zhǔn)確地檢測(cè)出由于腫瘤組織異質(zhì)性導(dǎo)致的KRAS突變假 陰性，僅需使用外周血樣本即可完成檢測(cè)。
[0164] (4)在患者用藥治療的過程中，可定期從患者的血漿/血清中抽提DNA進(jìn)行檢測(cè)， 實(shí)時(shí)監(jiān)控其突變情況，確保在超早期發(fā)現(xiàn)患者是否產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥突變，更好的指導(dǎo)后續(xù) 的治療措施。
[01化]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York = Cold Spring Harbor Uboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。 陽166] 各實(shí)施例中所使用的引物序列和探針序列如下： 陽 167] KRAS (G13D)
[0168] Probe-FAM=GGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAG
[0169] Probe-HEX:GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAG
[0170] F:AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC 陽 171 ] R:CCTCTATTGTTGGATCATATTCG
[0172] 通用方法 陽173] 血漿/血清樣本的預(yù)處理 [0174] 血漿分離方法如下： 陽17引將待檢測(cè)的外周血樣本首先進(jìn)行離屯、處理，300化9111，3111111，4°(：，之后將離屯、獲得 的血漿用移液槍移至2ml的離屯、管中，再次離屯、，13300rpm，10min，4°C，棄沉淀，上清即為 所需抽提DNA的血漿。 陽176] 血清分離方法如下
[0177] 提取血清的外周血樣本需要用促凝管進(jìn)行抽血并保存，分離血清的方法有2種： (1).室溫進(jìn)行自然沉降（約2h)后，300化pm離屯、lOmin，取上清，即為血清；（2). 4°C進(jìn)行 自然沉降（1化），直接取上清，即為血清。后續(xù)與血漿一樣進(jìn)行DNA抽提 陽178] 血漿/血清中DNA樣本的分離 陽1巧]血漿樣本中提取DNA的過程如下： 陽18〇] a、裂解 陽181] 加入一定量的Proteinase K，使其終濃度為2mg/lml血漿，在60°C的條件下裂解 去除蛋白質(zhì)從而將游離DNA釋放出來。與此同時(shí)，加入A化(carrier RNA)試劑來使麗ase 和RNase失活并使得游離核酸完全從結(jié)合的蛋白上釋放出來。 陽182] b、過柱純化 陽183] 在裂解好的血漿中加入ACB溶液（QIAGEN公司），使其終濃度為1. 血漿， 冰浴5min后，用硅膠柱進(jìn)行過柱純化。 陽184] C、洗脫 陽化日]過柱之后，加入相應(yīng)的洗脫液對(duì)柱子進(jìn)行洗涂，最后加入無水乙醇沉淀DNA分子。 陽186] t溶解
[0187] 在干燥之后的吸附柱中加入30ul Buffer AVE進(jìn)行溶解，室溫放置一段時(shí)間后， 進(jìn)行離屯、處理，得到純化的基因組DNA。
[0188] e、對(duì)提取得到的血漿游離DNA進(jìn)行質(zhì)檢，首先用Nano化OP檢測(cè)其濃度，正常情況 下2ml血漿可抽提出30~50ng/ul的血漿游離DNA。之后通過Agilent bioanalysis 2100 檢測(cè)其片段大小，W確定其為血漿游離DNA(<300bp)。圖4為Agilent bioanalysis 2100 質(zhì)檢圖，橫坐標(biāo)為Marker大?。ㄆ渲?5bp和> 1000 Obp峰為外加標(biāo)記物），縱坐標(biāo)為峰值 強(qiáng)度，抽提得到的血漿游離DNA的片段大小主要集中在169bp左右，符合要求。 陽189] 血清樣本的DNA抽提過程與血漿樣本中類似。
[0190] 實(shí)施例1 一種通過ddPCR技術(shù)檢測(cè)血清/血漿中KRAS基因突變從而監(jiān)測(cè)結(jié)直腸 癌患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥的方法 陽191] (1)某結(jié)直腸癌患者開始進(jìn)行帕尼單抗/西妥昔單抗治療開始前，采集外周血 4mL，分離得到血漿/血清，對(duì)血漿/血清中游離DNA進(jìn)行抽提。通過對(duì)樣本的溶解、富集、 過柱洗脫W及最后AVE洗脫獲得高濃度/高純度的DNA，最后通過瓊脂糖凝膠電泳確定其片 段大?。?lt;313bp)，W保證抽提質(zhì)量。
[0192] (2)反應(yīng)體系配制：a.探針及引物設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)所用引物為包含KRAS密碼子 12/13位點(diǎn)的特異引物，所用探針包括每個(gè)位點(diǎn)各一條突變型特異探針和野生型特異探 針。突變型探針標(biāo)記為FAM巧光，野生型探針標(biāo)記為肥X巧光。b. 20 iil PCR反應(yīng)體系 如下：待測(cè)患者血漿游離 DNA 50 ~100ng，2XddPCR SuperMix for Probes(BiC)-Rad L油oratories) IOii 1，KRAS G13D位點(diǎn)野生型和突變型的探針引物（已混合配制好）各 1 y 1，無困黒饋水補(bǔ)足至20 Ji 1。 陽19引 做制備微滴：在DG8?微滴發(fā)生卡上相對(duì)應(yīng)的孔中加入20ul上述PCR 陽194] 反應(yīng)液，70ul微滴發(fā)生專用油，蓋上微滴發(fā)生卡密封墊，放入QXlOO微滴發(fā)生器內(nèi) 進(jìn)行反應(yīng)，QXlOO微滴發(fā)生器最多能同時(shí)處理8個(gè)樣品。將處理好的微滴緩慢轉(zhuǎn)移到96孔 板上，完成全部的樣本轉(zhuǎn)移后，將96孔板放在熱封儀上，蓋上熱封膜進(jìn)行封膜。
[0195] (4)PCR擴(kuò)增：將已制備好的微滴按照已優(yōu)化好的PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行目的片段擴(kuò) 增，PCR反應(yīng)條件為：95°C變性IOmin ;隨后94°C變性30sec，60°C退火60sec，進(jìn)行40個(gè)循 環(huán)；最后98°C延伸10min，4°C保存。
[0196] (5)微滴檢測(cè)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR板轉(zhuǎn)移到QXlOO微滴分析儀度io-Rad L油oratories USA)上，編輯好樣本信息，對(duì)所有樣品孔進(jìn)行巧光檢測(cè)。 陽197] (6)結(jié)果分析：經(jīng)檢測(cè)，該患者的KRAS G13D位點(diǎn)未發(fā)生突變，提示患者目前尚未 產(chǎn)生對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗的繼發(fā)性耐藥，但應(yīng)定期（每3-6個(gè)月）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，一旦 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗的繼發(fā)性耐藥，及時(shí)指導(dǎo)患者調(diào)整治療方案。 陽19引 （7)該患者開始進(jìn)行帕尼單抗/西妥昔單抗治療6個(gè)月后，采集其外周血，對(duì)血漿 /血清中游離DNA進(jìn)行抽提，重復(fù)W上（1)-(5)步驟。
[0199] (8)經(jīng)檢測(cè)，該患者的KRAS G13D突變陰性，提示患者目前仍未對(duì)帕尼單抗/西妥 昔單抗產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，建議定期（每3-6月）進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。 陽200] (9)該患者開始進(jìn)行帕尼單抗/西妥昔單抗治療9個(gè)月后，采集其外周血，對(duì)血漿 /血清中游離DNA進(jìn)行抽提，重復(fù)W上（1)-(5)步驟。 陽2〇U (10)經(jīng)檢測(cè)，該患者的KRAS G13D位點(diǎn)突變陽性，突變率為3. 14%，見（圖如，提 示患者已出現(xiàn)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥，產(chǎn)生耐藥的時(shí)間是在開始帕尼單抗/西妥昔單 抗治療第6個(gè)月到9個(gè)月之間，提示患者應(yīng)及時(shí)調(diào)整治療方案。 陽202]
陽203] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種對(duì)KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 提供一檢測(cè)樣本，所述的檢測(cè)樣本是血漿樣本或血液樣品； (2) 對(duì)所述的檢測(cè)樣本進(jìn)行DNA抽提處理，從而獲得含抽提DNA的DNA抽提物，其中對(duì) 于每2毫升的檢測(cè)樣本而言，所述DNA抽提物是體積為20-100微升且DNA濃度大于30ng/ 微升的提取液； (3) 以步驟（2)所得到的DNA提取物為模板，進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)，從而獲得含 所述的耐藥突變位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；和 (4) 對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而得出KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)的突變形式和/或比 例。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反應(yīng)體系中含有PCR擴(kuò)增引物 對(duì)，以及用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針。3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的樣本來自于結(jié)直腸癌患者。4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，在所述步驟（2)中，所述的抽提處理包 括步驟： (2a)將血漿樣本，用蛋白酶K進(jìn)行消化處理，從而獲得蛋白質(zhì)被裂解的消化液； (2b)向所述消化液中加入RNA carrier，處理一段時(shí)間，從而獲得經(jīng)處理的混合液； (2c)對(duì)上一步驟經(jīng)處理的混合液，用固相載體對(duì)DNA進(jìn)行特異性吸附，從而獲得吸附 有DNA的固相載體； (2d)對(duì)上一步驟的吸附有DNA的固相載體，進(jìn)行洗脫，從而獲得含洗脫DNA的洗脫液， 即為含抽提DNA的DNA抽提物。5. -種KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的特異引物對(duì)； (b) RNA carrier ； (c) 使用說明書（如插頁），其中，所述說明書記載了權(quán)利要求1所述的方法； 其中，所述的突變位點(diǎn)包括KRAS G13D。6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括： (d) 位于所述第一容器內(nèi)或另一不同容器內(nèi)的用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針。7. -種KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的用于特異性擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的特異引物對(duì)，并且 引物對(duì)的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4中所示，或引物對(duì)的序列如SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8 中所示； (b) RNA carrier ； (c) 使用說明書（如插頁），其中，所述說明書記載了權(quán)利要求1所述的方法； (d) 位于所述第一容器內(nèi)或另一不同容器內(nèi)的用于檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針，所述的用于 檢測(cè)突變位點(diǎn)的探針包括：突變型特異探針和野生型特異探針；并且所述的突變型探針的 序列如SEQIDNO :l或SEQIDNO:5所示；所述的野生型探針的序列如SEQIDNO:2或SEQ ID NO:6 所示。8. -種如權(quán)利要求5或7所述的試劑盒或其中所述特異性引物對(duì)或探針的用途，其特 征在于，用于制備：(a)用于檢測(cè)或判斷腫瘤患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗的耐藥性的試劑 盒；(b)用于判斷腫瘤患者是否適合使用或繼續(xù)使用帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療的試 劑盒。9. 一種腫瘤患者帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟：用 如權(quán)利要求1-4任一所述的方法進(jìn)行KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)；和 若檢測(cè)結(jié)果為陽性，則判定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗耐藥；若檢測(cè)結(jié)果為陰性，則 判定患者對(duì)帕尼單抗/西妥昔單抗敏感。10. -種腫瘤患者治療方法，其特征在于，包括步驟： (a) 用如權(quán)利要求1所述的方法，對(duì)所述對(duì)象進(jìn)行KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)， 并對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陰性的對(duì)象，采用帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn)行治療； (b) 在一個(gè)或多個(gè)治療周期之中或之后，用如權(quán)利要求1所述的方法，對(duì)所述對(duì)象再次 進(jìn)行KRAS基因耐藥突變位點(diǎn)G13D檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陰性的對(duì)象，繼續(xù)采用帕尼單抗/ 西妥昔單抗進(jìn)行治療；對(duì)于對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽性的對(duì)象，停止采用帕尼單抗/西妥昔單抗進(jìn) 行治療。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105838778SQ201510017010
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2015年1月13日
【發(fā)明人】丁飛飛, 許騁, 沈波, 易靜, 張楨珍, 吳云鳴, 樓敬偉, 張有成, 王青兵, 劉濤, 劉冰
【申請(qǐng)人】上海寶藤生物醫(yī)藥科技股份有限公司, 上海張江轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研發(fā)中心有限公司, 上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司