玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF1轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF1轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記及其應(yīng)用，屬于作物遺傳育種領(lǐng)域。已獲得的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF1轉(zhuǎn)基因水稻材料具有明顯的節(jié)水耐旱表型，本發(fā)明根據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF1基因的核苷酸序列，在CDS內(nèi)設(shè)計分子標記的引物，運用PCR技術(shù)獲得ZmPIF1的DNA片段并對該DNA片段進行測序，依據(jù)ZmPIF1的特異性片段篩選得到本發(fā)明分子標記的引物，從而獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIF1轉(zhuǎn)基因水稻特異的分子標記。本發(fā)明的分子標記重復(fù)性好、擴增穩(wěn)定、操作簡便、成本低廉，可以用來檢測水稻背景中的玉米ZmPIF1基因，為今后利用ZmPIF1基因轉(zhuǎn)基因水稻進行分子標記輔助選擇提供堅實的基礎(chǔ)。
【專利說明】
玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmP IF1轉(zhuǎn)基因水稻的分子標巧及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記及其應(yīng)用，屬于作物 遺傳育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 1、玉米ZmPIFl轉(zhuǎn)錄因子簡介
[0003] 全球干旱、半干旱地區(qū)約占耕地面積的一半，運些地區(qū)水分供應(yīng)不足、森林植被疏 稀、生態(tài)環(huán)境惡化、水±流失嚴重、自然災(zāi)害頻繁；即使在±壤水分充足的情況下，水分虧缺 也常常會發(fā)生，從而影響到光合作用、物質(zhì)運輸、蛋白質(zhì)合成和細胞伸長等生理過程。干旱 會造成植物不同程度的脫水，引起植物體內(nèi)一系列的生理代謝變化，所W又將干旱、高鹽等 非生物脅迫稱為水分脅迫或滲透脅迫。
[0004] 植物應(yīng)答滲透脅迫的過程是一個設(shè)及到多基因、多信號途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜 過程，大體上可將運些基因及其表達產(chǎn)物分成兩類：即功能蛋白和調(diào)節(jié)蛋白；功能蛋白是指 在抵抗?jié)B透脅迫中直接起作用的蛋白質(zhì);而調(diào)節(jié)蛋白是在逆境中參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)控 基因表達，間接起保護作用的蛋白，其主要包括:傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子等。
[0005] 植物在逆境脅迫下可誘導(dǎo)合成大量抗逆的化合物和蛋白質(zhì)，運些與抗逆境相關(guān)的 化合物和蛋白質(zhì)又受轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子可W通過與順式作用元件結(jié) 合，啟動抗逆相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄，通過抗逆功能基因的表達使植物作出適應(yīng)逆境脅迫的 代謝調(diào)整。近年來，在提高作物抗逆性的分子育種中，研究重點已逐漸從改良個別基因轉(zhuǎn)到 改良或增強一個或多個發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子上，運樣能促使多個功能基因發(fā)揮作用， W期獲得綜合抗逆性狀改良的植物。
[0006] 光敏色素作用因子（phytochrome-interacting factors ,PIFs)也稱PILs (phytochrome interacting factor-like)，屬于擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的第15亞族。植 物PIFs家族轉(zhuǎn)錄因子能夠與CANNTG序列（又稱E-box)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié)啟動子中含E-box元件的功能基因或調(diào)控基因的表達，從而參與植物的各種抗逆性反應(yīng)。目前利用農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻，通過對其后代群體生理生化功能 的研究，發(fā)現(xiàn)ZmPIFl基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的抗旱表型；但目前還沒有追蹤玉米 ZmPIFl基因的分子標記，而發(fā)展ZmPIFl基因有效的特異分子標記對ZmPIFl轉(zhuǎn)基因材料的后 續(xù)利用十分必要。
[0007] 2、分子標記技術(shù)的發(fā)展
[000引2.1基于分子雜交技術(shù)的分子標記
[0009]限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymo巧hism,RFLP)， 1974年Grodzicker等創(chuàng)立了RFLP技術(shù)，用作腺病毒溫度敏感突變的遺傳標記(Grodzicker et al，1974)，它是一種WDNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標記。利用特定的限制性內(nèi)切 酶切割不同的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，通過凝膠電泳分離出不同帶，然后與克 隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。
[0010] 2.2基于PCR技術(shù)的分子標記
[0011] 2.2.1 隨機擴增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymo巧hism DNA,RAPD)
[0012] 1990年由Williams等人利用PCR技術(shù)發(fā)展的檢測DNA多態(tài)性的方法(Williams et al，1990)。它利用隨機引物(一般為8~IObp)通過PCR反應(yīng)非定點擴增DNA片段，然后用凝膠 電泳分析擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。擴增片段多態(tài)性便反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài) 性。但是RATO受反應(yīng)條件影響較大，因而其檢測的重復(fù)性較差。
[0013] 2.2.2序列標簽位點（Sequence Tagged Sites,STS)
[0014] 1989年Olson等提出，是對W特定對引物序進行PCR特異擴增的一類分子標記的統(tǒng) 稱。通過設(shè)計特定的引物，使其與基因組DNA序列中特定結(jié)合位點結(jié)合，從而可用來擴增基 因組中特定區(qū)域，分析其多態(tài)性。
[0015] 2.2.3簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat,SSR)
[0016] 也稱微衛(wèi)星DNA(Tautz et al，1989;Love et al，1990)，是一類由 I~6個堿基組 成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)序列，其中最常見是雙核巧酸重復(fù)和S核巧酸重復(fù)，如（CA)n、 (AT)n、（TG)n、(GGC)n、(GAT)n等。每個微衛(wèi)星DNA的核屯、序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目一般為 10~60,它們廣泛分布于絕大多數(shù)真核生物基因組中，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)重復(fù) 數(shù)目的不同。微衛(wèi)星序列兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物，通過 PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段，由于核屯、序列串聯(lián)重復(fù)數(shù)目不同，因而能夠擴增出不同長度的 PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)分離片段的大小決定多態(tài)性。SS財示記一般檢測到 的是單一的多等位基因位點，而且呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子。但是，傳統(tǒng)的 SSR分子標記開發(fā)方法工作量大，需花費大量人力、物力，而且效率較低。
[0017] 2.2.4簡單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simple sequence repeat, ISSR)
[0018] Zietkeiwitcz等于1994年提出的一種W微衛(wèi)星為基礎(chǔ)的分子標記，它檢測的是兩 個SSR之間的一段短DNA序列上的多態(tài)性。由于SSR序列廣泛分布于高等生物的基因組中，所 WISSR具有很強的多態(tài)性。目前，ISS財示記已廣泛應(yīng)用于多種植物品種鑒定、遺傳作圖、基 因定位、遺傳多樣性等研究中，但在長穗偃麥草中沒有進行研究。
[0019] 2.2.5反轉(zhuǎn)座子位點間擴增多態(tài)性（inter-retrotransposon ampl if ied polymorphism,IRAP)
[0020] 其原理是根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中LTR的保守序列設(shè)計引物，運些引物在PCR過程中可 W與LTR序列退火，從而擴增出相鄰的同一家族的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子成員間的片段。也可W根據(jù) 反轉(zhuǎn)錄酶基因的相對保守序列設(shè)計引物進行擴增化alendar et al.1999)。目前，IRAP分子 標記技術(shù)已應(yīng)用于大麥化alendar et al,1999;Kalendar et al,2000;Lei曲 et al, 2003)、相橘(Bret6 et al, 2001)、網(wǎng)茅(Yannic et al, 2004)、馬鈴馨等植物的遺傳研究 中。
[0021 ] 2.2.6 反轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴增多態(tài)性（retrotr an sposon microsatellite amplified polymorphism,REMAP)
[0022] 是一種基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的標記技術(shù)化alendar et al, 1999) ,REMAP技術(shù)原理是 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR保守序列和微衛(wèi)星序列設(shè)計引物，然后進行PCR，擴增出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn) 座子與鄰近的微衛(wèi)星間的片段，從而檢測出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與鄰近簡單重復(fù)序列之間的多態(tài) 性。
[0023] 2.3基于限制性酶切和PCR技術(shù)的DNA標記
[0024] 擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Rragment Length Polymo巧hism,AFLP)AFLP是 1993年荷蘭科學(xué)家Zbaeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DN A多態(tài)性的新方法(Zbaeau et al， 1993) dAFLP是RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物，先利用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切割成不同大小 的DNA片段，再使雙鏈人工接頭與酶切片段相邊接，作為擴增反應(yīng)的模板DNA，然后W人工接 頭的互補鏈為引物進行預(yù)擴增，最后在接頭互補鏈的基礎(chǔ)上添加1~3個選擇性核巧酸作引 物對模板DNA基因再進行選擇性擴增，通過聚丙締酷胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片 段，根據(jù)擴增片段長度的不同檢測出多態(tài)性。隨著技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，AFLP技術(shù)已廣泛 應(yīng)用于植物種質(zhì)鑒定(Thomas et al, 1995)、遺傳圖譜構(gòu)建(Ma;rgues et al, 1998)、目的基 因定位及遺傳多態(tài)性檢測(Pakniyat et al, 1997)等方面。
[0025] 2.4基于DNA忍片技術(shù)的分子標記
[00%] 2.4.1 單核巧酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymo巧hism,SNP)
[0027] Lander于1996年提出的第S代DNA遺傳標記，是指在基因組水平上由于單個核巧 酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，其多態(tài)性頻率大于1%。從分子水平上對單個核巧酸的差 異進行檢測。
[00巧]2.4.2多樣性微陣列技術(shù)(Diversity arrays technology,DArT)
[0029] Jaccoud等于2001年開發(fā)了 一種新的分子標記技術(shù)多樣性微陣列技術(shù)(Diversity arrays technology,DA巧），并成功應(yīng)用于水稻研究中。DArT技術(shù)是依賴忍片雜交的方法來 區(qū)分基因組中座位多態(tài)性的差異;將待檢測的不同樣本的基因組DNA等量混合后經(jīng)相關(guān)限 制性內(nèi)切酶處理，根據(jù)電泳結(jié)果選擇回收不同大小DNA片段及一系列DNA操作而達到基因組 復(fù)雜性減少，該部分DNA即為基因組代表(Genomic r邱resentation)，并通過相關(guān)過程將該 部分DNA固定到玻片上形成點陣列的忍片。W不同樣本單獨經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理所獲的基因 組代表為探針，并組成相應(yīng)的探針組合對忍片進行雜交，由于不同樣本的基因組DNA序列有 差異，因而與忍片上同一點序列雜交的效率不一致，忍片上只有與探針DNA互補的點才具有 雜交信號，通過掃描儀可識辨不同顏色雜交信號的強弱或有無來確定待檢測樣本的遺傳差 別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點與不足，本發(fā)明提供了一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基 因水稻分子標記及其應(yīng)用；已獲得的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl基因的轉(zhuǎn)基因水稻材料具有明顯 的節(jié)水耐旱表型;根據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl基因的核巧酸序列，在蛋白質(zhì)編碼區(qū)CDS內(nèi)設(shè)計 本發(fā)明分子標記的引物，運用PCR技術(shù)獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl的DNA片段并進行測序，依 據(jù)玉米ZmPIFl的特異性片段篩選得到本發(fā)明分子標記的引物，而獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl 轉(zhuǎn)基因水稻分子標記;該分子標記重復(fù)性好、擴增穩(wěn)定、操作簡便、成本低廉。
[0031 ]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0032] 本發(fā)明所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記，長度為1189bp，其擴 增序列如SEQ ID No. 1所示。
[0033] 本發(fā)明所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記的引物，其序列如SEQ ID No.2和沈Q ID No.3所示：
[0034] SEQ ID No.2：ZmPIFl-F 5'CCGAGCCACAATCTGAGTT 3'；
[0035] SEQ ID No.3：ZmPIFl-R 5'AGTATTTGTGGATCTCCGGT 3'〇
[0036] 本發(fā)明還公開了玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記在檢測轉(zhuǎn)基因材料 或分子標記輔助選擇育種中的應(yīng)用。
[0037] 玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記的制備方法如下:根據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子 ZmPIFl的核巧酸序列，在蛋白編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計所述分子標記的引物，運用PCR技術(shù)獲得玉米轉(zhuǎn) 錄因子ZmPIFl的DNA片段并對該DNA片段進行測序，依據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl的特異性片段 篩選得到所述分子標記的引物，從而獲得所述玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標 記。
[0038] 本研究W玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻DNA為實驗組、W野生型水稻(武運梗7 號)DNA為對照組，通過普通PCR擴增可區(qū)分實驗組和對照組之間序列的差異片段，運些片段 可視為玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻DNA的特異片段，再結(jié)合普通PCR的富集，能高效地 擴增出玉米ZmPIFl的DNA片段;經(jīng)回收、測序，最后轉(zhuǎn)化成玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻 的分子標記。
[0039] 本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0040] 1、本發(fā)明利用PCR技術(shù)，獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的特異分子標記1 個，成功效率高達100 %。
[0041] 2、本發(fā)明的分子標記重復(fù)性好，擴增穩(wěn)定，操作簡便，成本低廉，可W用來檢測水 稻背景中的玉米ZmPIFl基因，為今后利用ZmPIFl基因轉(zhuǎn)基因水稻育種中進行分子標記輔助 選擇提供堅實的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0042] 圖1為玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻T2代純合株系內(nèi)巧光定量檢測；其中，WT-野生型，VC-空載體，OEl-OEll為ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻；
[0043] 圖2(a)和（b)為玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻在±壤中的耐旱性研究；其中， WT-野生型，VC-空載體，OEl、0E3、0E7為ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻；
[0044] 圖3為基因組特異分子標記在不同玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻材料中的擴 增;其中，泳道1-5為ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻TO代，泳道6為陰性對照，泳道7為陽性對照；
[0045] 圖4為玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻基因組特異分子標記的穩(wěn)定性檢測;其中， M為Marker DL2000,泳道1為質(zhì)粒，泳道2、3為WT、VC，泳道4-14為11個ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻T2 代純系。
【具體實施方式】
[0046] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0047] 實施例1:實驗材料的獲得
[004引根據(jù)ZmPIFl基因的序列設(shè)計引物，利用RT-PCR技術(shù)從玉米品種鄭單958(購于揚州 田源種業(yè)公司）總CDNA中擴增得到ZmPIFl基因；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到野生型水稻植株 (武運梗7號），獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻。
[0049] 實施例2: PCR引物序列
[0050]根據(jù)玉米耐旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl基因的核巧酸序列，在蛋白編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計引 物，引物的序列如下：
[0化1] ZmPIFl-F:5'-CCGAGCCACAATCTGAGTT-3'(沈Q ID No.2)，
[0052] ZmPIFl-R:5'-AGTATTTGTGGATCTCCGGT-3'(SEQ ID No.3)；
[0053] 其擴增片段為1189bp，即為玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記的序列 (沈Q ID No. 1)。
[0化4] 實施例3:玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株的鑒定
[0055] 采用SDS酪-氯仿法微量提取水稻基因組DNA，其步驟如下：
[0056] 1.取兩片幼嫩葉片（約0.2g)，剪碎裝入2ml的離屯、管中，置于液氮中冷卻，用俟子 搗碎至粉末狀；
[0化7] 2.加入70化1的抽提緩沖液A，輕輕混勻后，于65°C水浴30min(每5min上下顛倒混 勻一次）；
[005引3.取出稍冷卻至室溫，加入等體積的酪/氯仿(各35化1)，上下顛倒充分混勻，抽提 IOmin;
[0化9] 4.1200化pm，離屯、5min，吸取上清到一新的離屯、管中；
[0060] 5.加0.7倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫放置lOmin，可見絮狀沉淀；
[0061 ] 6.12000巧 m，離屯、lOmin，棄去上清；
[0062] 7.加入70化1的70 %的乙醇清洗沉淀；
[0063] 8.12000巧 m，離屯、5min，棄去上清；
[0064] 9.室溫下驚干；
[00化]10.加入30iU的TER溶解，37°C溫浴60min后，-2(TC保存。
[0066] 取Iiil DNA作為模板，W實施例2中的引物進行PCR擴增，擴增條件為：94°C預(yù)熱 Smin; 94°C，40s，58°C，40s，72°C，2min，共35個循環(huán)；72°C，IOmin。W轉(zhuǎn)基因水稻DNA為模板， 能擴增出長度為1189bp的目的片段，證明目的基因 ZmPIFl已經(jīng)整合入水稻基因組中。
[0067] 實施例4:轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)化水稻后的抗逆分析
[0068] 獲得11個純合轉(zhuǎn)化株系，進行ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻T2代純合株系內(nèi)巧光定量檢測， 結(jié)果顯示在運11個轉(zhuǎn)基因純合材料中ZmPIFl均表達，并未發(fā)生基因沉默(如圖1所示）。選取 OEl、0E3和0E7S個轉(zhuǎn)基因材料做進一步分析，主要有W下內(nèi)容：
[0069] 植株抗干旱的研究。在進行干旱處理時，將±壤中生長40天左右且長勢比較一致 的野生型和ZmPIFl轉(zhuǎn)基因株系的植株進行自然干旱脅迫處理，干旱脅迫7天后，將它們重新 置于清水環(huán)境中進行恢復(fù)培養(yǎng)。如圖2所示，在干旱脅迫7天后，野生型植株的葉片表現(xiàn)出嚴 重的萎黃現(xiàn)象，部分植株并已死亡，而轉(zhuǎn)基因植株雖有部分葉片發(fā)生萎黃，但大部分植株的 葉片及莖干仍保持綠色?；謴?fù)10天后野生型植株無法恢復(fù)而死亡，轉(zhuǎn)基因植株卻能恢復(fù)生 長變綠。上述試驗結(jié)果表明，在遭受到干旱脅迫時，轉(zhuǎn)基因水稻比野生型水稻表現(xiàn)出更強的 干旱脅迫耐受性，而且在干旱脅迫處理終止后，轉(zhuǎn)基因水稻比野生型水稻表現(xiàn)出更快的恢 復(fù)速度。
[0070] 實施例5:玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻特異分子標記的擴增和穩(wěn)定性
[0071] 獲得的特異分子標記是否穩(wěn)定對其應(yīng)用非常重要，利用相同引物對ZmPIFl轉(zhuǎn)基因 水稻陽性材料進行PCR，結(jié)果表明所發(fā)展的特異分子標記是非常穩(wěn)定的，可W跟蹤玉米 ZmPIFl轉(zhuǎn)錄因子。W武運梗7號為背景的玉米ZmPIFl轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)基因水稻，選擇上述引物對 T0、T2代進行擴增。從圖3結(jié)果可W看出，所得擴增標記和預(yù)期條帶大小一致，表明TO代中有 玉米ZmPIFl基因的存在。相同分子標記在同一轉(zhuǎn)基因材料的不同世代中可W穩(wěn)定遺傳，圖4 表明該株系T2代均有玉米ZmPIFl基因在不同單株中穩(wěn)定存在。
【主權(quán)項】
1. 玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記，其特征在于，所述分子標記的擴增序 列如SEQ ID No.l所示。2. -種權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記的引物，其特征 在于，所述分子標記的引物的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示： SEQ ID No.2:ZmPIFl-F 5'CCGAGCCACAATCTGAGTT 3'； SEQ ID No.3:ZmPIFl-R 5'AGTATTTGTGGATCTCCGGT 3'。3. -種權(quán)利要求1所述的玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記在檢測轉(zhuǎn)基因材 料或分子標記輔助選擇育種中的應(yīng)用。4. 一種玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記的制備方法，其特征在于，所述方 法如下：根據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl的核苷酸序列，在蛋白編碼區(qū)內(nèi)設(shè)計如SEQ ID No. 2和 SEQ ID No.3所示的引物，運用PCR技術(shù)獲得玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl的DNA片段并對該DNA片段 進行測序，依據(jù)玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl的特異性片段篩選得到如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3 所示的引物，從而獲得所述玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmPIFl轉(zhuǎn)基因水稻的分子標記。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838789SQ201610247580
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】高勇, 陳建民, 吳美琴, 任小蕓, 梁恩興, 張冬平, 陸怡
【申請人】揚州大學(xué)