用于定性檢測(cè)白血病融合基因的引物、探針、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于檢測(cè)白血病融合基因的引物和探針組合、含有該引物和探針組合的試劑盒以及采用該引物和探針組合或試劑盒進(jìn)行白血病融合基因檢測(cè)的多重?zé)晒釸T?PCR方法。本發(fā)明基于多重?zé)晒釸T?PCR技術(shù)，簡單、快捷，靈敏度高。此外，本發(fā)明通過合理的引物和探針搭配，有效避免了引物與引物之間、引物與探針之間以及探針與探針之間的相互作用，減少了檢測(cè)誤差。采用本發(fā)明的檢測(cè)方法可以全面地對(duì)45種白血病融合基因進(jìn)行定性檢測(cè)，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，為臨床白血病的診斷、療效評(píng)價(jià)以及預(yù)后提供了非常重要的檢測(cè)手段。
【專利說明】
用于定性檢測(cè)白血病融合基因的引物、探針、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于定性檢測(cè)白血病融合基因的引物、 探針、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白血病是兒童和青年中最常見的一種惡性克隆性疾病。多項(xiàng)研究表明大部分的白 血病患者中存在某種染色體結(jié)構(gòu)的畸變(缺失、重復(fù)、倒位、易位等），這些是導(dǎo)致白血病發(fā) 生以及發(fā)展的重要原因。染色體結(jié)構(gòu)的畸變，會(huì)導(dǎo)致原癌基因及抑癌基因的結(jié)構(gòu)變異，使得 癌基因、原癌基因突變激活，抑癌基因缺失或失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。因而 不同的融合基因已經(jīng)成為不同類型白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。如慢性髓細(xì)胞白血病 (CML)中的BCR-ABL1融合基因，急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)中的PML-RARA融合基因已成為 各自的分子標(biāo)志并進(jìn)一步成為治療的靶標(biāo)。2000年WHO關(guān)于白血病分型的標(biāo)準(zhǔn)中更是將其 中一些常見的異常歸納為白血病基本診斷的標(biāo)準(zhǔn)之一。鑒于白血病相關(guān)融合基因的檢測(cè)對(duì) 于白血病診斷、分型、臨床治療選擇、預(yù)后療效評(píng)價(jià)以及微小殘留病(MRD)檢測(cè)上的臨床價(jià) 值，融合基因檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)具有極大的臨床意義和市場(chǎng)價(jià)值。
[0003] 目前，融合基因的檢測(cè)方法主要包括染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)以及聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。與染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)相比，PCR檢測(cè)方法具有快速 有效、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上有較廣的應(yīng)用。多重PCR技術(shù)是指在同一個(gè)PCR體系中加入 多對(duì)引物，能夠同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)DNA片段。作為PCR重要的衍生技術(shù)，多重PCR可以同時(shí)擴(kuò)增 多個(gè)目的基因，具有節(jié)省時(shí)間、降低成本、提高效率的優(yōu)點(diǎn)，尤其是能夠提高檢測(cè)的靈敏度。 熒光RT-PCR是在逆轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，其主要優(yōu)勢(shì)在于用實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)代 替普通的PCR以及電泳分析。實(shí)時(shí)熒光PCR具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)閉管操作、封閉狀態(tài)檢測(cè)，減少 了模板污染和假陽性的可能；（2)無需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，操作更簡便快速；（3)靈敏度 高，可以檢測(cè)單拷貝基因；（4)特異性高，可通過探針與靶序列特異性的結(jié)合，特異性地檢測(cè) 目的基因；（5)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值進(jìn)行定量分析。2003年25個(gè)歐洲實(shí)驗(yàn)室通過EAC項(xiàng)目 (Europe Against Cancer Program)合作，對(duì)白血病中常見的10個(gè)融合基因的檢測(cè)建立了 標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，包括熒光PCR引物以及探針（Leukemia，2003,17,2318- 2357)。之后許多針對(duì)白血病融合基因的熒光檢測(cè)方法都是在此項(xiàng)研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來 的。
[0004] 然而，多重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)需要在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，甚至是多 條探針，這樣就增加了多對(duì)引物以及多條探針在反應(yīng)體系中相互作用以及形成二聚體的幾 率，從而降低了PCR反應(yīng)的特異性和效率，甚至不能擴(kuò)增出特異性目標(biāo)產(chǎn)物。此外，隨著人們 對(duì)白血病研究的不斷深入，越來越多的白血病融合基因已被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前檢測(cè)白血病融合基 因的方法已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)于同時(shí)檢測(cè)絕大部分融合基因的需求，亟需一種快速、 有效且易于標(biāo)準(zhǔn)化的能同時(shí)定性檢測(cè)絕大部分白血病融合基因的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，基于最新的白血病融合基因數(shù)據(jù)庫，重 新設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)白血病融合基因的檢測(cè)引物和探針以及多重?zé)晒釸T-PCR方法。本發(fā)明的 檢測(cè)方法快速、有效且易于對(duì)45種白血病融合基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的高靈敏度定性檢測(cè)。
[0006] 為此，本發(fā)明一方面提供了一種用于檢測(cè)白血病融合基因的引物和探針組合，其 由SEQ ID N0.1-114所示的引物和探針組成。
[0007] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該引物和探針組合進(jìn)一步由第1-12組引物和探針組 成，其中第1組由SEQ ID N0.1-9所示的引物和SEQ ID N0.10-11所示的探針組成，第2組由 SEQ ID N0.12-16所示的引物和SEQ ID N0.17-18所示的探針組成，第3組由SEQ ID NO. 19- 27所示的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探針組成，第4組由SEQ ID NO.30-35所示的引物 和SEQ ID NO. 36-38所示的探針組成，第5組由SEQ ID NO. 39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所示的探針組成，第6組由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示 的探針組成，第7組由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探針組成，第 8組由SEQ ID N0.63-66所示的引物和SEQ ID N0.67-88所示的探針組成，第9組由SEQ ID NO.69-76所示的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探針組成，第10組由SEQ ID NO.79-87所示 的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探針組成，第11組由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探針組成，第12組由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示的探針組成。
[0008] 本發(fā)明通過選擇相關(guān)基因斷裂位點(diǎn)上游序列和下游序列，來進(jìn)行特異性多重?zé)晒?RT-PCR引物和探針的設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)的引物Tm值均在60°C附近，整合搭配各個(gè)引物，從而盡量 避免了引物二聚體的產(chǎn)生;探針Tm值均在70°C附近，避免了探針與其他非特異性序列之間 的結(jié)合，同時(shí)也避免了探針相互之間形成復(fù)雜的二聚體，提高了 PCR擴(kuò)增的特異性和效率。
[0009] 針對(duì)45種白血病融合基因，本發(fā)明設(shè)計(jì)的具體引物和探針情況如表1所示。
[0010] 表1、本發(fā)明的引物和探針情況表
[0014]
[0015] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，部分探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端連接熒 光淬滅基團(tuán)TAMRA;其余探針的5 '端連接熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3 '端連接熒光淬滅基團(tuán)TAMRA; 內(nèi)參基因 GAPDH探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3'端連接熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
[0016] 本發(fā)明另一方面提供了一種用于檢測(cè)白血病融合基因的試劑盒，其包含本發(fā)明所 述的引物和探針組合。
[0017] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒中全部引物的濃度為3pm〇lAU，全部探針的 濃度為 2ρηιο1/μ1。
[0018] 本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明所述的引物和探針組合在制備檢測(cè)白血病融合基 因試劑盒中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明再一方面提供了本發(fā)明所述的引物和探針組合，或者本發(fā)明所述的試劑盒 在檢測(cè)白血病融合基因中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明最后一方面提供了一種檢測(cè)白血病融合基因的多重?zé)晒釸T-PCR方法，其包 含以下步驟：
[0021] 1、獲取待測(cè)樣品的cDNA。
[0022] cDNA合成可以采用Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，簡要流程如下：
[0023] 取 1 ~5ug總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，取50ug/ml的Random Prime 1.5ul和 15ul的RNA產(chǎn)物， 70°C反應(yīng)5min以促進(jìn)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，放置冰上至少2min。加入5 X Reaction Buffer 6uK25mM MgCl2 3.8uKPCR Nucleotide Mixl.5uK RNasinRibonuclease Inhibitor 0.3ul、GoScript? Reverse Transcriptaselul、Nuclease_Free Water 0.9ul至終體積 30ul 〇
[0024] 逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?5°C5min ;42°C60min;70°C 15min。將獲得的 cDNA 用Nuclease-Free Water進(jìn)行相應(yīng)地稀釋(根據(jù)總RNA濃度進(jìn)行計(jì)算），稀釋后的cDNA用來進(jìn)行融合基因的多重 熒光RT-PCR定性檢測(cè)。
[0025] 2、采用本發(fā)明所述的引物和探針組合，或采用本發(fā)明所述的試劑盒，以步驟1中獲 取的cDNA為模板，進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，并收集熒光信號(hào)。
[0026]在本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)中，20ul的反應(yīng)體系包括：10ul的熒光PCR反應(yīng) 液、lul的R0X Reference Dye、5ul的稀釋后cDNA模板（Nuclease-Free Water作為陰性對(duì) 照）、2ul的引物探針混合液以及2ul的Nuclease-Free Water。
[0027] 在ABI 7500熒光PCR儀上運(yùn)行程序?yàn)椋合冉?jīng)過5〇1：21^11，95°(：1〇1^11;然后再經(jīng)過95 °C 15sec，6CTC30sec，共 45 個(gè)循環(huán)。
[0028] 3、分析內(nèi)參基因 GATOH的擴(kuò)增結(jié)果，如果CT值小于30，檢測(cè)過程有效，如果CT值大于 35,重新進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)。
[0029]在本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)中，內(nèi)參對(duì)照引物和探針采用人GAPDH基因，陰性 對(duì)照（水）中未添加 cDNA模板。只有內(nèi)參基因 GAPDH的CT值小于30時(shí)，檢測(cè)過程才有效，才進(jìn) 入結(jié)果判讀步驟。
[0030] 4、內(nèi)參基因 GAPDH的CT值小于30時(shí)，進(jìn)行白血病融合基因的結(jié)果判讀。
[0031] 在采用本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)后，只有當(dāng)內(nèi)參基 因 GATOH有J0E焚光信號(hào)，且其中1管中能夠檢測(cè)出FAM或J0E焚光信號(hào)，無模板對(duì)照品無信號(hào) 時(shí)，待測(cè)樣本的檢測(cè)結(jié)果才有效且呈陽性。
[0032] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，部分探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端連接熒 光淬滅基團(tuán)TAMRA;其余探針的5 '端連接熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3 '端連接熒光淬滅基團(tuán)TAMRA; 內(nèi)參基因 GAPDH探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3'端連接熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
[0033]在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，全部引物的濃度為3pm〇lAU，全部探針的濃 度為 2ρηιο1/μ1。
[0034] 由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點(diǎn)。
[0035] 1、與現(xiàn)有的染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)相比，本發(fā)明的檢測(cè)方法基于多 重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)，因此簡單、快捷，靈敏度高。同時(shí)，本發(fā)明采用的多重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)與 多重巢式RT-PCR相比，具有更高的靈敏度和特異性。
[0036] 2、本發(fā)明的檢測(cè)方法通過合理的引物和探針搭配，可以有效避免引物與引物之 間、引物與探針之間以及探針與探針之間的相互作用，從而提高了特異性，降低了假陽性， 減少了檢測(cè)誤差。
[0037] 3、本發(fā)明的檢測(cè)方法可以全面地對(duì)45種白血病融合基因進(jìn)行高靈敏度的定性檢 測(cè)，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，為臨床白血病的診斷、療效評(píng)價(jià)以及預(yù)后提供了非常重要的檢測(cè) 手段。
【附圖說明】
[0038] 圖1:具有代表性的白血病融合基因 （BCR-ABL1、CBFB-MYH11、PML-RARA和AML1- ΕΤ0)的斷裂位點(diǎn)以及引物和探針設(shè)計(jì)位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0039] 圖2:實(shí)施例1中采用白血病融合基因陽性細(xì)胞系和陰性細(xì)胞系檢測(cè)本發(fā)明檢測(cè)體 系特異性的熒光擴(kuò)增曲線圖。
[0040] 圖3:實(shí)施例2中采用白血病融合基因陽性細(xì)胞系檢測(cè)本發(fā)明檢測(cè)體系重復(fù)性的熒 光擴(kuò)增曲線圖。
[0041] 圖4:實(shí)施例3中采用白血病融合基因陽性細(xì)胞系和陰性細(xì)胞系檢測(cè)本發(fā)明檢測(cè)體 系靈敏性的熒光擴(kuò)增曲線圖。
[0042]圖5:實(shí)施例4中采用本發(fā)明檢測(cè)體系進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)的熒光擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本 發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0044]實(shí)施例1:利用融合基因陽性細(xì)胞系和陰性細(xì)胞系檢測(cè)本發(fā)明檢測(cè)體系的特異性 [0045] 本實(shí)施例以確定含有BCR-ABLl(p210)融合基因的K562陽性細(xì)胞系、AML1-ET0融合 基因的Kasumi細(xì)胞系以及不含融合基因的HL60陰性細(xì)胞系來驗(yàn)證本發(fā)明檢測(cè)方法的可行 性及特異性。其中K562細(xì)胞系、Kasumi細(xì)胞系、HL60細(xì)胞系均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有 限責(zé)任公司。
[0046]本實(shí)施例的具體檢測(cè)方法如下：
[0047] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0048] 按照細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作培養(yǎng)K562細(xì)胞系、Kasumi細(xì)胞系以及HL60細(xì)胞系，置于 37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0049] 2、核酸提取
[0050] 建議使用TIANGEN RNAprep Pure Blood Kit試劑盒，按照試劑盒說明書操作來提 取細(xì)胞系中的RNA，之后立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
[0051] 3、逆轉(zhuǎn)錄
[0052]建議使用Promega GoScript? Reverse Transcriptase試劑盒，按照試劑盒說明 書操作來獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用Nuclease-Free Water進(jìn)行相應(yīng)地稀釋(根據(jù)總RNA濃 度進(jìn)行計(jì)算），稀釋后的cDNA用來進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)。
[0053] 4、多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)
[0054] (1)多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)
[0055] 20ul的反應(yīng)體系中依次加入Nuclease-Free Water 2ul、稀釋后的cDNA模板5ul、 ROX Reference Dye lul、引物探針混合液2ul、熒光PCR反應(yīng)液10ul。
[0056] 在ABI 7500熒光PCR儀上運(yùn)行程序?yàn)椋合冉?jīng)過5〇1：21^11，95°(：1〇1^11;然后再經(jīng)過95 °C 15sec，6CTC30sec，共 45 個(gè)循環(huán)。
[0057] 擴(kuò)增過程中儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)。
[0058] (2)數(shù)據(jù)收集處理和分析
[0059]熒光PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)參GATOH的擴(kuò)增結(jié)果，如果其CT值小于30，表明整 個(gè)檢測(cè)過程有效;如果其CT值大于35，則需要重新驗(yàn)證檢測(cè)。
[0060] (3)結(jié)果檢測(cè)
[0061] 本發(fā)明多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系特異性的擴(kuò)增曲線結(jié)果參見說明書附圖2。其中 圖2A為K562陽性細(xì)胞系的融合基因檢測(cè)結(jié)果，圖2B為Kasumi陽性細(xì)胞系的融合基因檢測(cè)結(jié) 果，圖2C為HL60陰性細(xì)胞系的融合基因檢測(cè)結(jié)果，圖2D為陰性對(duì)照(水)的檢測(cè)結(jié)果。
[0062] 從附圖2可以看出，圖2A、2B、2C中都可以檢測(cè)到內(nèi)參GATOH的熒光信號(hào)，且GAPDH的 Ct值都小于30，說明整個(gè)檢測(cè)過程有效。K562陽性細(xì)胞系中含有BCR-ABL1的融合基因，R3中 特異性地檢測(cè)到FAM標(biāo)記的BCR-ABL1熒光信號(hào)，如圖2A所示；Kasumi陽性細(xì)胞系中含有 AML1-ET0的融合基因，R9中特異性地檢測(cè)到HEX標(biāo)記的AML1-ET0熒光信號(hào)，如圖2B所示； HL60陰性細(xì)胞系中不含融合基因，除了內(nèi)參GAPDH的熒光信號(hào)外，R1-R12中均檢測(cè)不到其他 的熒光信號(hào)，如圖2C所示；陰性對(duì)照無模板，擴(kuò)增不出內(nèi)參基因 GATOH和融合基因，因而也檢 測(cè)不到熒光信號(hào)，如圖2D所示。
[0063] 由此可見，本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果與融合基因陽性細(xì)胞系及陰性細(xì)胞系的特性相一 致，表明利用本發(fā)明的檢測(cè)體系可以特異性地進(jìn)行白血病融合基因的定性檢測(cè)。
[0064] 實(shí)施例2:利用融合基因陽性細(xì)胞系檢測(cè)本發(fā)明檢測(cè)體系的重復(fù)性
[0065] 本實(shí)施例同樣以確定含有BCR-ABL1融合基因的K562陽性細(xì)胞系、AML1-ET0融合基 因的Kasumi細(xì)胞系來驗(yàn)證本發(fā)明檢測(cè)體系的重復(fù)性。
[0066]具體檢測(cè)方法如下：
[0067]采用與實(shí)施例1相同的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以K562cDNA和 Kasumi cDNA為模板，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)三次，重復(fù)性檢測(cè)的熒光PCR擴(kuò)增曲線參見說明書 附圖3。其中圖3A為K562陽性細(xì)胞系的融合基因檢測(cè)結(jié)果，圖3B為Kasumi陽性細(xì)胞系的融合 基因檢測(cè)結(jié)果。如圖3A所示，K562的陽性細(xì)胞系進(jìn)行三次重復(fù)檢測(cè)，均檢測(cè)到內(nèi)參GAPDH基 因和融合基因 BCR-ABL1的熒光信號(hào)，且GAPDH和BCR-ABL1的CT值吻合得很好；同樣地， Kasumi的陽性細(xì)胞系的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相吻合。通過本實(shí)施例表明，利用本發(fā)明的檢 測(cè)體系進(jìn)行白血病融合基因的多重?zé)晒釸T-PCR定性檢測(cè)具有很好的重復(fù)性。
[0068]實(shí)施例3:利用融合基因陽性細(xì)胞系和陰性細(xì)胞系檢測(cè)本發(fā)明檢測(cè)體系的靈敏度 [0069] 本實(shí)施例同樣以確定含有BCR-ABLl(p210)融合基因的K562陽性細(xì)胞系、AML1-ET0 融合基因的Kasumi細(xì)胞系以及不含融合基因的HL60陰性細(xì)胞系來驗(yàn)證本發(fā)明檢測(cè)體系的 靈敏性。具體檢測(cè)方法如下：
[0070] 以HL-60細(xì)胞系（不含融合基因的陰性細(xì)胞系）分別對(duì)K562細(xì)胞系（含有BCR-ABL1 融合基因的陽性細(xì)胞系）和Kasumi細(xì)胞系（含有AML-ET0融合基因的陽性細(xì)胞系）進(jìn)行 100 %、10 %、1%、1%〇、0 · 5%〇、0 · 25%〇、0 · 125%〇 (稀釋后陽性細(xì)胞系與陰性細(xì)胞系的比例）的 稀釋，用稀釋好的混合細(xì)胞系提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)。
[0071] 采用與實(shí)施例1相同的多重?zé)晒釸T-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，多重?zé)晒釸T-PCR的 擴(kuò)增曲線參見說明書附圖4。圖4A 代表 100%Κ562、10%Κ562、1%Κ562、1%〇Κ562、0.5%〇Κ562、 0 · 25%〇Κ562和0 · 125%〇Κ562的熒光檢測(cè)結(jié)果；圖4B代表 100 %Kasumi、10 %Kasumi、1 % Kasumi、l%〇Kasumi、0 · 5%〇Kasumi、0 · 25%〇Kasumi 和0 · 125%〇Kasumi 的焚光檢測(cè)結(jié)果。
[0072] 由此可見，當(dāng)達(dá)到0.125%〇K562或0.125%〇Kasumi細(xì)胞（8000個(gè)HL60細(xì)胞中含有1個(gè) K562或1個(gè)Kasumi細(xì)胞)時(shí)，本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系檢測(cè)出的融合基因 BCR-ABL1 和AML 1 -ΕΤ0的CT值仍小于35，而相應(yīng)的巢式RT-PCR方法卻檢測(cè)不到相應(yīng)的融合基因。由此 表明，與巢式RT-PCR相比，本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系對(duì)白血病融合基因的檢測(cè)靈 敏度遠(yuǎn)高于相應(yīng)的巢式RT-PCR檢測(cè)方法。
[0073]實(shí)施例4:采用本發(fā)明的檢測(cè)體系進(jìn)行臨床樣本的檢測(cè)
[0074]本實(shí)施例采集臨床白血病患者外周血或骨髓血樣本，按照本發(fā)明的檢測(cè)體系進(jìn)行 45種融合基因的定性檢測(cè)。其中檢測(cè)到的融合基因的異構(gòu)體包括8〇?481^1(?190)、8〇?- △81^(?210)、卩]\^-1^1^(1^型）、？]\^-1^1^(5型）、〇8卩8-]\〇^11(厶型）、511^^1^42厶-?8父1、 AML1-ET0、TEL-AML1、SET-CAN、DEK-CAN、MLL-ELL、MLL-AF^PMLL-AF6#。
[0075]利用本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系檢測(cè)臨床樣本，操作步驟包括血液樣本中 白細(xì)胞RNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA和多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)。具體的操作方法同本發(fā)明實(shí)施 例1。臨床樣本檢測(cè)的熒光擴(kuò)增曲線參見說明書附圖5。其中圖5A為采用本發(fā)明的多重?zé)晒?RT-PCR檢測(cè)到的4種融合基因異構(gòu)體的熒光結(jié)果，包括BCR-ABLl(pl90)、BCR-ABLl(p210)、 PML-RARA(L型）和PML-RARA(S型）；圖5B為采用本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)到的3種融合 基因異構(gòu)體的熒光結(jié)果，包括CBFB-MYH11(A型）、SIL-TAL1和E2A-TOX1;圖5C為采用本發(fā)明 的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)到的4種融合基因異構(gòu)體的熒光結(jié)果，包括AML1-ET0、SET-CAN、DEK- CAN和MLL-ELL。
[0076]由此可見，利用本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系，檢測(cè)到的臨床樣本融合基因 的型別幾乎覆蓋了臨床上常見的白血病融合基因，且檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷相一致。
[0077]以上結(jié)果表明，本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系可以全面地進(jìn)行白血病45種融 合基因的定性篩查。并且與巢式RT-PCR檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的多重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)體系 具有較高的靈敏度和特異性，檢測(cè)工序簡單，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，為白血病的診斷、化療 及預(yù)后提供了一種更加全新快速簡便的基因診斷技術(shù)，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)白血病融合基因的引物和探針組合，其由SEQ ID NO.1-114所示的引 物和探針組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針組合，其進(jìn)一步由第1-12組引物和探針組成，其中 第1組由SEQ ID NO. 1-9所示的引物和SEQ ID NO. 10-11所示的探針組成，第2組由SEQ ID NO. 12-16所示的引物和SEQ ID NO. 17-18所示的探針組成，第3組由SEQ ID NO. 19-27所示 的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探針組成，第4組由SEQ ID NO.30-35所示的引物和SEQ ID NO.36-38所示的探針組成，第5組由SEQ ID NO.39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所 示的探針組成，第6組由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示的探針組成， 第7組由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探針組成，第8組由SEQ ID NO.63-66所示的引物和SEQ ID NO.67-88所示的探針組成，第9組由SEQ ID NO.69-76所示 的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探針組成，第10組由SEQ ID NO.79-87所示的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探針組成，第11組由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探針組成，第12組由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示 的探針組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物和探針組合，其中部分探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán) FAM，3 '端連接熒光淬滅基團(tuán)TAMRA;其余探針的5 '端連接熒光報(bào)告基團(tuán)JOE，3 '端連接熒光 淬滅基團(tuán)TAMRA;內(nèi)參基因 GAPDH探針的5 '端連接熒光報(bào)告基團(tuán)JOE，3 '端連接熒光淬滅基團(tuán) TAMRA〇4. 一種用于檢測(cè)白血病融合基因的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物 和探針組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中全部引物的濃度為3ρπι〇1/μ1，全部探針的濃度為 2ρηιο1/μ1 〇6. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合在制備檢測(cè)白血病融合基因試劑盒中 的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合，或者權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在 檢測(cè)白血病融合基因中的應(yīng)用。8. -種檢測(cè)白血病融合基因的多重?zé)晒釸T-PCR方法，其包含以下步驟： (1) 獲取待測(cè)樣品的cDNA; (2) 采用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合，或采用權(quán)利要求4或5所述的試 劑盒，以步驟(1)中獲取的cDNA為模板，進(jìn)行多重?zé)晒釸T-PCR擴(kuò)增，并收集熒光信號(hào)； (3) 分析內(nèi)參基因 GAPDH的擴(kuò)增結(jié)果，如果CT值小于30,檢測(cè)過程有效，如果CT值大于35， 重新進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)； (4) 內(nèi)參基因 GAPDH的CT值小于30時(shí)，進(jìn)行白血病融合基因的結(jié)果判讀。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中部分探針的5 '端連接熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3 '端連接 熒光淬滅基團(tuán)TAMRA;其余探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3'端連接熒光淬滅基團(tuán) TAMRA;內(nèi)參基因 GAPDH探針的5'端連接熒光報(bào)告基團(tuán)JOE，3'端連接熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中全部引物的濃度為3ρπι〇1/μ1，全部探針的濃度 為 2ρηιο1/μ1 〇
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105838792SQ201610254799
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月22日
【發(fā)明人】鄭仲征, 杜金偉, 張鵬, 王莉萍, 潘捷, 杜可明
【申請(qǐng)人】上海荻碩貝肯生物科技有限公司