一種致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的說是一種致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用。具體為所述致病哈氏弧菌遺傳標記具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列，其應用為利用遺傳標記可特異性的檢測致病哈氏弧菌。本發(fā)明基于該標記可快速、準確檢測致病哈氏弧菌，應用范圍廣泛，并且簡單易行，無需細菌培養(yǎng)、DNA提取等步驟。
【專利說明】
一種致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領域，尤其是一種致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]哈氏弧菌(Vibr1 harveyi)廣泛分布于海水環(huán)境中，是海水養(yǎng)殖動物最重要的細菌性病原之一，能夠感染脊椎與非脊椎動物，包括魚、蝦、貝、螺、海參等。同其它感染一樣，致病哈氏弧菌感染的早期診斷將有利于疾病的防控。然而，同霍亂弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌等重要水產(chǎn)傳染性病原一樣，即同一種弧菌中只有少數(shù)分子流行病學特征的毒力菌株能導致暴發(fā)性流行病的發(fā)生，而絕大多數(shù)菌株為非毒力菌株，且不具致病性致病，哈維氏弧菌不同菌株之間的毒力相差甚遠，許多菌株為海洋環(huán)境(包括海洋動物體內(nèi)環(huán)境)的正常菌株;而有些菌株則是海水養(yǎng)殖動物的常見病原，對全球海水養(yǎng)殖魚類、蝦蟹類和貝類都造成了十分嚴重的危害。目前，已有幾種利用分子生物學手段檢測哈氏弧菌的方法，包括通過PCR分析溶血素基因vhh、調(diào)控蛋白基因toxR、促旋酶基因gyrB、vhhP2基因以及16S rRNA基因。由于這些基因皆不能區(qū)分有毒株和無毒株，無法準確診斷哈氏弧菌疾病，且有些方法需要細菌培養(yǎng)及DNA提取，在操作上有一定的時間要求和技術(shù)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記及其應用。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記:序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列。
[0005]特異性分子遺傳標記的應用:所述遺傳標記可特異性的檢測致病哈氏弧菌。
[0006]1、根據(jù)序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列所示的致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記，涉及的引物為:引物3858P1F(5 ’ -TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3，)和3858P1R(5 ’ -ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3’)。
[0007]、待測魚組織樣品的制備:于無菌條件下取魚腦、肝臟、脾臟、腎臟，將腦、肝臟、脾臟、腎臟加入Iml無菌生理鹽水進行勻漿，而后進行稀釋，待用。
[0008]、環(huán)境樣品的制備:自環(huán)境中取20ml水體，用孔徑為80?120μπι快速定量分析濾紙過濾，除去大顆粒雜質(zhì)，濾液經(jīng)12000rpm離心1min，去掉上清，沉淀用ΙΟΟμΙ無菌水重懸，于沸水中煮沸5 min。
[0009]、取ΙΟμΜ的3858P1F和3858P1R為引物，以2μ1步驟2或3中的樣品為模板，進行PCR擴增，若得到656 bp PCR產(chǎn)物，即可確定待測魚組織樣品被致病哈氏弧菌感染。
[0010]所述步驟2的組織勻漿液用無菌水進行10 X稀釋，而后將稀釋液于沸水中煮沸5min。所述步驟3的沉淀用0.5ml無菌水重懸。所述步驟4的PCR反應體系為20μ1 ;PCR過程為:94°〇51^11預變性模板0嫩，然后941€458，601€458，72°(:11^11，20-25個循環(huán)后再在72°(:延伸反應1min0
[0011]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
1、準確性較高，本發(fā)明所用的遺傳標記存在于致病哈氏弧菌中而且具有一定的屬內(nèi)保守性，因而與其它弧菌交叉反應的可能性很??；
2、快速簡單。本發(fā)明的致病哈氏弧菌檢測方法實施過程簡單，毋需細菌培養(yǎng)、DNA提取等步驟，只需常規(guī)的PCR，2?3小時即可獲得結(jié)果；
3、應用范圍廣，本發(fā)明的檢測方法對樣品無特殊要求，可以檢測環(huán)境及生物源性樣品；
4、本發(fā)明通過致病哈氏弧菌基因特異分子標記片段385-8，該片段存在于致病哈氏弧菌中，但不存在于非致病哈氏弧菌及其它弧菌中，包括與哈氏弧菌進化關(guān)系非常近的溶藻弧菌、副溶血弧菌中，因而該基因片段是一種特異的致病哈氏弧菌遺傳標記，用其作為PCR探針可以準確、快速地從多種生物和環(huán)境樣品中檢測致病哈氏弧菌。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明從魚組織中檢測致病哈氏弧菌的電泳圖譜(其中泳道M:DNA markerDL2000;泳道1、2、3、4分別為以注射過⑶H11385的石斑魚腦、肝臟、脾臟、腎臟為模板所得的PCR產(chǎn)物;泳道5為陽性對照;泳道6、7為陰性對照，分別為以注射過PBS的肝臟、腎臟為模板所得的PCR產(chǎn)物)。
[0013]圖2為海水體中檢測致病哈氏弧菌的電泳圖譜(其中泳道M:DNA marker DL2000；泳道T為添加干擾菌和陽性菌GDHl 1385海水樣，泳道C為只添加干擾菌未添加陽性菌海水樣)。
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法:
1、質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“寶生物工程(大連)有限公司”的相應試劑盒；
2、PCR反應各種組分皆購于“寶生物工程(大連)有限公司”；
實施例1
致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記由序列表SEQ ID N0.1中的385-8堿基序列組成。
[0015]序列表SEQID N0.1為: TACATCTACCATTTCCGTAAACATGAAGTTGAACACCGACCCGAATGCGGCGCTGTCTGACATTCTGGCAAAA
ACCAACTCCGTTCGCTCACAACTTCCAAAAGAAGCGGAAGACCCAACAGTAACGATGTCGACTGGCTCGACTACCGCGGTACTGTACATCGGTTTCACCAGTGACGAGTTGTCTTCTAGCCAGATCACCGACTATCTTGAGCGTGTAATCAACCCGCTGCTATTTACGGTAAATGGTGTATCGAAAGTTGACCTATACGGTGGTATGAAATACGCGCTACGCGTATGGCTAGATCCAGCGAAAATGGGCGCACTTAAGCTGACAGCAACCGACGTGATGACGGTACTAAACGCCAACAACTATCAGTCGGCAACCGGTCAGGCGACAGGTGAATTCGTACTTTACAACGGTAGCGCAGATACTCAAGTATCCAACGTTGCTGAACTCGAAGCGCTGGTTGTTAAAACTGGTGAAGGTGACGTCATTCGTCTTGGCGACATTGCGAAAGTGACCTTAGAGAAGAGCCACGACGTTTACCGCGCAAGTGCGAACGGTCAAGAGGCTGTAGTTGCAGCGATCAACGCGGCACCAAGTGCTAACCCAATCAACATCGCGGCAGATGTGCTGAAACTTTTACCTCAAT(a)序列特征:
長度:656bp 類型:堿基序列鏈型:單鏈拓撲結(jié)構(gòu):線性
(b)分子類型:雙鏈DNA
(c)假設:否 ⑷反義:否
(e)最初來源:哈氏弧菌GDHl1385
(f)特異性名稱:3858P1
致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其遺傳標記可特異性的檢測致病哈氏弧菌。
[0016]魚組織中致病哈氏弧菌的檢測:
1)石斑魚的人工感染
在液體2216E培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈氏弧菌⑶Hl 1385 (保存于海南省熱帶水生生物技術(shù)重點實驗室菌種保藏中心，保藏編號為:PBVH33111),30 °C,振蕩培養(yǎng)至OD6qq為0.6，4 °C，8000g離心5min，收集菌體，將其懸浮于生理鹽水中至終濃度為I X 16 cfy/ml。將10尾石斑魚(體重15?20g/尾)隨機分為2組，每組5尾，一組為實驗組(T組)，腹腔注射上述哈氏弧菌懸浮液(ΙΟΟμΙ/尾)，另一組為對照組(C組)，每尾魚分別腹腔注射ΙΟΟμΙ生理鹽水。
[0017]其中2216Ε液體培養(yǎng)基組成成分按重量百分比計:0.5 %蛋白胨，0.1 %酵母膏，
0.01%，3%似(:1，96.4%!120，調(diào)？!1值至7.4;生理鹽水組成成分按重量百分比計:0.85%NaCl；
2)石斑魚組織樣品制備
在上述步驟I)石斑魚感染48 h后，于無菌條件下取魚腦、肝臟、脾臟、腎臟，置于玻璃勻漿器中，加入Iml生理鹽水進行勻漿。將組織勻漿液用無菌水進行10X稀釋。將稀釋液于于沸水中煮沸5 min。
[0018]3)PCR 檢測
在0.2ml PCR管中，加入下列成分:2μ1上述步驟2)高溫處理后的組織漿液稀釋液，濃度 ΙΟμΜ 弓I 物3858P1F (5’-TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3 ’)和3858ΡI R(5 ’-ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3，)各Ιμ?， 2μ1 10XPCR buffer [200mM Tris-NCl(pH
8.4)，200mM KCl，15mM MgCl2],2μ1 1mM dNTPs(各 2.5 mmol/L)，0.25μ1 Taq DNA 聚合酶，加水至總體積為20μ1。
[0019]其中引物3858P1F和3858P1R為致病哈氏弧菌片段385-8特異性引物，其PCR產(chǎn)物大小為656bp。
[0020]按下列條件進行PCR:94°C5min 預變性模板 DNA，然后 94°C45s，60°C45s，72°Clmin，20-25個循環(huán)后再在72°C延伸反應lOmin。取5μ1 PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳觀察。結(jié)果表明(見附圖1)，只有用注射哈氏弧菌的石斑魚組織勻漿液做模版的PCR擴增出一條656bp的陽性條帶，而用注射生理鹽水的石斑魚組織勻漿液做模版的PCR則無任何條帶。
[0021]實施例2
水體中致病哈氏弧菌的檢測 I)水樣制備準備兩份滅菌海水(命名為C和T)，分別取20ml水體，C海水液加入終濃度為分別為14cfu/ml的無毒哈氏弧菌，溶藻弧菌V.alginolyticus ATCC 33787，副溶血弧菌V.parahemolyticus ATCC17802，擬態(tài)弧菌V.mimicus ATCC 33653，弗氏弧菌V.furnissiiATCC 33813和需鈉弧菌V.natriegens ATCC 33788，T海水液除加入上述細菌外，再加入終濃度為14 cfu/ml的致病哈氏弧菌⑶Hl 1385。C、T海水液分別用孔徑為80?120μπι快速定量分析濾紙過濾，除去大顆粒雜質(zhì)，濾液經(jīng)12000rpm離心1min，去掉上清，沉淀用0.1ml無菌水中重懸，于沸水中煮沸5 min。
[0022]2)PCR 檢測
在0.2ml PCR管中，加入下列成分:2μ1上述步驟I)高溫處理過的C或T重懸液，濃度10μM弓I 物3858P1F (5’-TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3’WP3858PlR(5’-ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3，)各Ιμ?， 2μ1 10XPCR buffer [200mM Tris-NCl(pH
8.4)，200mM KCl，15mM MgCl2],2μ1 1mM dNTPs(各 2.5 mmol/L)，0.25μ1 Taq DNA 聚合酶，加水至總體積為20μ1。
[0023]PCR反應條件同實施例1步驟3)。結(jié)果表明(見附圖2)，只有添加了致病哈氏弧菌的⑶Hl 1385的T組海水樣擴增出一條656bp的陽性條帶，C組海水樣無任何PCR條帶，說明T組水樣含有致病哈氏弧菌，C組水樣不含有致病哈氏弧菌。
[0024]以上結(jié)果表明，本發(fā)明的致病性哈氏弧菌檢測方法可以快速準確地檢測組織以及海水樣品中的致病哈氏弧菌。
【主權(quán)項】
1.一種致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記，其特征在于:致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記為序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列所示。2.如權(quán)利要求1所述的致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特征在于:所述遺傳標記可特異性的檢測致病哈氏弧菌。3.如權(quán)利要求2所述的致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特征在于: (1)、根據(jù)序列表SEQID N0.1中的堿基序列所示的致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記，涉及的引物為:引物3858P1F(5 ’ -TACATCTACCATTTCCGTAAACA-3，)和3858P1R(5 ’ -ATTGAGGTAAAAGTTTCAGCACATC-3’)； (2)、待測組織樣品的制備:于無菌條件下取魚腦、肝臟、脾臟、腎臟，將腦、肝臟、脾臟和腎臟加入Iml無菌生理鹽水進行勻漿，而后進行稀釋，待用； (3)、環(huán)境樣品的制備:自環(huán)境中取20ml水體，用孔徑為80?120μπι快速定量分析濾紙過濾，除去大顆粒雜質(zhì)，濾液經(jīng)12000rpm離心1min，去掉上清，沉淀用ΙΟΟμΙ無菌水重懸，于沸水中煮沸5 min； (4)、取ΙΟμΜ的3858P1F和3858P1R為引物，以2μ1步驟(2)或(3)中的樣品為模板，進行PCR擴增，若得到656bp PCR產(chǎn)物，即可確定待測魚組織樣品及海水樣品被哈氏弧菌感染。4.如權(quán)利要求3所述的致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特征在于:所述步驟(2)的組織勻漿液用無菌水進行1X稀釋，而后將稀釋液于沸水中煮沸5 min。5.如權(quán)利要求3所述的致病性哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特征在于:所述步驟(3)的沉淀用0.1ml無菌水重懸。6.如權(quán)利要求3所述的致病哈氏弧菌特異性分子遺傳標記的應用，其特征在于:所述步驟(4)的PCR反應體系為20yl;PCR過程為:94°C5min預變性模板DNA，然后94°C45s，60°C45s，72°C Imin，20-25個循環(huán)后再在72°C延伸反應lOmin。
【文檔編號】C12Q1/04GK105838803SQ201610310289
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】徐先棟, 周永燦, 謝珍玉, 王世鋒, 蔡巖, 劉開放
【申請人】海南大學