蛋白酶抗性肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了蛋白酶抗性肽、制備此類肽的方法，以及包括蛋白酶抗性肽的組合物和利用此類肽進(jìn)行治療的方法。已經(jīng)確定在標(biāo)準(zhǔn)肽合成過程中將α?甲基?官能化氨基酸經(jīng)由在此所描述的方法直接摻入主鏈中以產(chǎn)生蛋白酶抗性肽。優(yōu)選的該α?甲基?官能化氨基酸是α?甲基?苯丙氨酸，并且優(yōu)選的該肽是胰高血糖素樣肽(GLP?1)。
【專利說明】蛋白酶抗性肽 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供了蛋白酶抗性肽、制備此類肽的方法，以及包括蛋白酶抗性肽的組合 物和利用此類肽進(jìn)行治療的方法。在標(biāo)準(zhǔn)肽合成過程中將a-甲基-官能化氨基酸經(jīng)由在此 所描述的方法直接摻入主鏈中。
【背景技術(shù)】
[0002] 長效肽療法的開發(fā)受以下因素阻礙，例如短血漿半衰期和口服生物利用度較差， 主要是肽對酶降解的天然敏感性的結(jié)果。大部分蛋白水解功能是必要的，包括調(diào)芐基本的 生物分子過程，例如關(guān)閉在細(xì)胞表面的肽信號傳導(dǎo)事件、或蛋白和肽在消化過程中的胃分 解。因此，負(fù)責(zé)蛋白酶的活性不能簡單地被抑制，同時(shí)在許多情況下不引起其他代謝紊亂。
[0003] 因此為了克服降解，增強(qiáng)感興趣的肽的酶抗性是令人希望的。通常，利用兩個(gè)主要 方法來增強(qiáng)酶抗性:序列特異性修飾，即影響肽本身的一級結(jié)構(gòu)的那些；以及整體有效修 飾，即改變肽的某些總體物理化學(xué)特征的那些。策略上引入的此類修飾可以降低自然生理 過程的影響，否則這些過程就會消除或失活其作用令人希望的肽，例如酶降解和/或通過腎 超濾的清除。
[0004] 序列特異修飾包括抗蛋白水解的特殊氨基酸的摻入，或更復(fù)雜的修飾，包括天然 存在的側(cè)鏈功能之間的環(huán)化例如二硫鍵形成(Cys-Cys)、或內(nèi)酰胺化(Lys-Glu或Lys-Asp)。 另外的修飾包括在肽主鏈之內(nèi)的非天然氨基酸替代物之間的環(huán)化，例如烯烴復(fù)分解釘合 (stapling)〇
[0005] 整體修飾包括過程如肽脂化，例如棕櫚?；?或聚乙二醇化。棕櫚?；哂挟a(chǎn)生 肽的循環(huán)儲器的作用，該肽在血液血清中與天然豐富的白蛋白微弱地締合。與白蛋白締合 的肽有效地逃過腎超濾，因?yàn)榫喓系膹?fù)合物的尺寸高于腎小球?yàn)V過截取值。當(dāng)該肽從白蛋 白的表面解離時(shí)，其再次游離，以便與內(nèi)源受體相互作用。聚乙二醇化具有物理地屏蔽肽免 于蛋白水解的作用并賦予顯著親水性，當(dāng)水合時(shí)所述親水性大大增加治療性分子的流體動(dòng) 力學(xué)半徑以克服腎清除。然而，脂化和聚乙二醇化對主要肽鏈針對蛋白水解的敏感性均不 具有顯著影響。
[0006] 雖然這些技術(shù)總體上可以廣泛適用于治療性肽，并在某一程度能夠延伸循環(huán)半衰 期，但仍然存在著對于增加肽和蛋白質(zhì)對酶降解的穩(wěn)定性的方法的需要，特別是鑒于產(chǎn)生 可口服給予的肽的期望時(shí)。 發(fā)明概述
[0007] 通篇描述了滿足上述需要的實(shí)施例。
[0008] 在一個(gè)實(shí)施例中，提供了合成肽，該合成肽包括用a-甲基官能化氨基酸對天然氨 基酸殘基的至少一個(gè)取代。適當(dāng)?shù)兀摵铣呻木S持與對應(yīng)的不包括任何取代的合成肽基本 上相同的受體效價(jià)和選擇性。
[0009] 在實(shí)施例中，該至少一個(gè)a-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于被取代的該天然氨基酸殘 基。適當(dāng)?shù)?，該至少一個(gè)a-甲基官能化氨基酸包括a-甲基組氨酸、a-甲基丙氨酸、a-甲基異 亮氨酸、甲基精氨酸、甲基亮氨酸、甲基天冬酰胺、甲基賴氨酸、甲基天冬氨酸、 a-甲基甲硫氨酸、a-甲基半胱氨酸、a-甲基苯丙氨酸、a-甲基谷氨酸、 a-甲基蘇氨酸、a-甲基 谷氨酰胺，a_甲基色氨酸、a-甲基甘氨酸、a-甲基纈氨酸、a-甲基鳥氨酸、a-甲基脯氨酸、a-甲基硒代半胱氨酸、甲基絲氨酸和/或甲基酪氨酸。
[0010] 在實(shí)施例中，該合成肽對蛋白降解，包括例如DPP-IV、腦啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纖 溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。
[0011] 適當(dāng)?shù)?，該天然氨基酸殘基是對蛋白水解裂解敏感的位點(diǎn)。
[0012] 在實(shí)施例中，該肽是一種腸降血糖素類肽，包括但不限于，胰高血糖素樣肽1(GLP- 1)、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)、艾塞那肽(exenatide)加胰高血糖素、促胰液素、腱調(diào) 蛋白、胃泌酸調(diào)節(jié)素和血管活性腸肽(VIP)。
[0013]在其他實(shí)施例中，該肽是膜島素。
[0014]在另外的實(shí)施例中，提供了一種GLP-1肽，該GLP-1肽適當(dāng)?shù)匕ㄓ胊-甲基官能化 氨基酸對天然氨基酸殘基的至少三個(gè)取代，其中該合成GLP-1肽維持與對應(yīng)的不包括這些 取代的合成GLP-1肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。在實(shí)施例中，至少三個(gè)、或至少四個(gè) 甲基官能化氨基酸是甲基苯丙氨酸。適當(dāng)?shù)?，該甲基官能化氨基酸是在位置Phe6、 Tryl3、Phe22和Trp25處取代的a-甲基苯丙氨酸。
[0015]適當(dāng)?shù)?，這些GLP-1肽進(jìn)一步包括在位置2(Aib2)處的氨基異丁酸取代、在位置5 (Ser5)處的絲氨酸修飾、在位置20(a-MeLys20)和28(a-MeLys28)處取代的a-甲基賴氨酸、 位置26 (Val 26)處的纈氨酸修飾、和/或羧基末端脂化或聚乙二醇化。
[0016] 還提供了制備合成肽的方法，這些方法包括在肽中鑒別用于取代的至少一種天然 氨基酸殘基，并且用a_甲基官能化氨基酸取代所鑒別的天然氨基酸殘基。其中該合成肽維 持與對應(yīng)的不包括該取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性，并且其中該合成肽對 蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。
[0017] 在另外的實(shí)施例中，提供了制備一種蛋白水解性穩(wěn)定的肽的方法，這些方法包括 將肽暴露于一種或多種蛋白酶、鑒別是對蛋白水解裂解敏感的位點(diǎn)的至少一個(gè)天然氨基酸 殘基，并且用甲基官能化氨基酸取代所鑒別的氨基酸殘基。其中該合成肽維持與對應(yīng)的 不包括該取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性，并且其中該合成肽對蛋白降解是 實(shí)質(zhì)上有抗性的。
[0018] 還提供了治療患者的方法，這些方法包括給予藥學(xué)上有效量的如在此描述的合成 肽。
[0019] 在其他實(shí)施例中，提供了一種包括以下氨基酸序列的合成GLP-1肽： R1-His-Xl-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- 八1&-父5-6111-父6-打6-八1&-父7-父8-父9-父1〇-父1卜父12-1?2(5￡〇10勵(lì)：2)，其中 ： R1 是Hy、Ac或pGlu; R2 是-NH2 或-OH; XI 是Ala、Aib、Pr〇SGly; X2是Thr、Pro或Ser; 2F_Phe、Tyr、Trp、Tyr-OMe、4I_Phe、2F_Phe、3F_Phe、4F_Phe、1-NaI、2_NaI、Pro 或二-0，0-MePhe； X4是厶;113、厶1&、厶8卩、厶找、131卩、〇1&、0，0-〇1卩、6111、卩5-?116、？116、肌6、高？116、高丁5^、(1-MePhe、a-Me-2F_Phe、Phe、Thr、Trp、Tyr-OMe、41-Phe、2F_Phe、3F_Phe、4F_Phe、Tyr、1-Nal、 2_NaI、Pro、二-0，0-MePhe、a-MeTyr 或二-0，0-MeTyr; X5 是 Aib、Ly s、D-pro、Pro 或 a-MeLy s 或二-0，0-MeLy s; X6是厶；113、厶8卩、厶作、131卩、〇1&、1^11、1^8、2〇1-?116、3〇1-?116、4〇1-?116、？116、高？116、2]\16-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、2CF 3-Phe、3CF3-Phe、4CF3-Phe、0-Phe、0-MePhe、D-phe、4I-Phe、3I-卩116、2卩-?116、0，0-〇1卩、0-厶1&、1^16、1^11、卩5-?116、高丁5^、(1-]/[6?116、(1-]/[6-2卩-?116、361'、丁5^、 Trp、Tyr-OMe、3F_Phe、4F_Phe、Pro、1 _Na I、2_Na I 或二-0，0-MePhe; a-MeTyr、二-0，0-MeTyr、 a-MeTrp 或二-0，0-MeTyr; X7是厶；113、厶坪、131卩、01&、0，0-01卩、卩5-?116、？116、？116、丁5^、高？116、高丁5^、(1-]/[6?116、(1-]/[6-2F_Phe、2Me_Phe、3Me_Phe、4Me_Phe、N1e、Tyr-OMe、4I_Phe、1-NaI、2_NaI、2F_Phe、3F_Phe、 4F_Phe、Pro、N_MeTrp、a-MeTrp、二-0，0-MeTrp、二-0，0-Me-Phe; a-MeTyr 或二-0，0-MeTyr; 父8是厶；113、厶1&、厶坪、厶8卩、6111、犯6、？1'0、361'、1^-]\161^11、(1-]/[61^11、\^1或(1-]/[6\^1; X9是Aib、Glu、Lys、Pro、a-MeVal或a-MeLeu; X10 是 Aib、Glu、Lys、Pr0Sa-MeLys; 父11是八；113、6111、？1'0或361';并且 父12是厶；113、617、6111、1^8、？1'0、(1-]/[6厶坪或(1-]/[61^8。
[0020] 參照附圖，下文詳細(xì)地描述了這些實(shí)施例的另外的實(shí)施例、特征、和優(yōu)點(diǎn)，連同不 同實(shí)施例的結(jié)構(gòu)和操作。 附圖簡要說明
[0021] 圖1示出胰高血糖素樣肽l(GLP-l)中的氨基酸取代的示例性位點(diǎn)。（SEQ ID N0:3) [0022]圖2A-2C示出GLP-1比較物的腦啡肽酶降解。
[0023]圖3A-3D示出根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴露于腦啡肽酶的穩(wěn)定性。 [0024]圖4A-4D示出在暴露于腦啡肽酶240小時(shí)后根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋 白的穩(wěn)定性。
[0025]圖5A-5C示出GLP-1比較物的胰凝乳蛋白酶降解。
[0026] 圖6A-6D示出根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰凝乳蛋白酶的穩(wěn) 定性。
[0027] 圖7A-7D示出根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰凝乳蛋白酶的穩(wěn) 定性。
[0028]圖8A-8C示出GLP-1比較物的胰蛋白酶降解。
[0029] 圖9A-9C示出根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰蛋白酶的穩(wěn)定性。
[0030] 圖10A-10C示出根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴露于胰蛋白酶的穩(wěn)定 性。
[0031] 圖11 A-11B示出GLP-1比較物的血清降解。
[0032] 圖12A-12B示出根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴露于血清的穩(wěn)定性。
[0033]圖13A-13D示出脂化的比較物和脂化的根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白 暴露于胃液的穩(wěn)定性。
[0034]圖14A-14E示出可商購的GLP-1蛋白和根據(jù)在此描述的實(shí)施例的合成GLP-1蛋白暴 露于胃液的穩(wěn)定性研究。
[0035]圖15A-15E示出一種放大的譜圖，其證明可商購的GLP-1肽和根據(jù)在此描述的實(shí)施 例的合成GLP-1肽暴露于胃液的穩(wěn)定性研究。 發(fā)明詳述
[0036] 應(yīng)該領(lǐng)會的是在此展示和描述的這些具體的實(shí)現(xiàn)方式是實(shí)例，并且不旨在以任何 方式在其他方面限制本申請的范圍。
[0037] 在此提及的這些公開的專利、專利申請、網(wǎng)站、公司名稱、以及科學(xué)文獻(xiàn)特此以其 全文形式通過引用而結(jié)合，達(dá)到如同每個(gè)被確切并單獨(dú)地表明而通過引用結(jié)合的相同程 度。在此引用的任何參考文件與本說明書的具體傳授之間的任何沖突應(yīng)以有利于后者的方 式來解決。同樣，在單詞或短語的領(lǐng)域理解的定義與如在本說明書中確切傳授的該單詞或 短語的定義之間的任何沖突應(yīng)以有利于后者的方式來解決。
[0038] 如在本說明書中所使用，單數(shù)形式"一個(gè)/種(a，an)"以及"該"具體地還涵蓋它們 所提及的術(shù)語的復(fù)數(shù)形式，除非本內(nèi)容清楚地另外指明。在此使用術(shù)語"約"以意指大約 (approximately)、在......的附近（in the region of )、粗略地（roughly)、或左右 (around)。當(dāng)術(shù)語"約"與一個(gè)數(shù)值范圍結(jié)合使用時(shí)，它通過擴(kuò)展列舉的數(shù)值的上限和下限 將該范圍加以修飾。通常，在此使用術(shù)語"約"以將一個(gè)數(shù)值以高于和低于該規(guī)定值的20% 的變化加以修飾。
[0039] 在此使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有由本申請涉及的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常 理解的含義，除非另外定義。在此參考了本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的不同方法和材料。陳 述肽合成的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考包括W. C.錢(W. C. Chan)和P. D.懷特(P.D. White).，"Fmoc 固相肽合成：實(shí)用方法"（"Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach"），牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)，牛津(Oxford) (2004)。
[0040] 術(shù)語"多肽"、"肽"、"蛋白質(zhì)"以及"蛋白質(zhì)片段"在此可以互換使用以便表示氨基 酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是一種對應(yīng) 的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物，并且適用于天然存在的氨基酸聚合物以及非天然 存在的氨基酸聚合物。
[0041] 術(shù)語"氨基酸"是指天然存在的以及合成的氨基酸，連同與天然存在的氨基酸功能 類似的氨基酸類似物以及氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是通過遺傳密碼編碼的那些氨 基酸，以及隨后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、y-羧基谷氨酸鹽、以及〇-磷酸絲氨 酸。氨基酸類似物是指以下化合物，這些化合物具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué) 結(jié)構(gòu)，例如與氫相結(jié)合的碳、羰基基團(tuán)、氨基基團(tuán)、以及R基團(tuán)，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲 硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這些類似物能具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)（例如正亮氨酸)或經(jīng)修飾 的肽骨架，但保留了與天然存在氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指以下化學(xué) 化合物，這些化合物具有不同于通常的氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)的、但與天然存在的氨基酸的功 能相類似的結(jié)構(gòu)。術(shù)語"氨基酸"和"氨基酸殘基"通篇可互換地使用。
[0042] 在合成主要肽鏈之后，旨在改進(jìn)肽的代謝穩(wěn)定性的大部分的化學(xué)修飾涉及另外的 化學(xué)操作，例如內(nèi)酰胺化、二硫鍵閉合、脂化或聚乙二醇化。此類修飾常常是耗時(shí)的并且很 可能顯著地增加任何產(chǎn)物的最終商品成本。
[0043] 如在此所描述的，在標(biāo)準(zhǔn)肽合成期間，a-甲基-官能化氨基酸直接摻入主鏈中使得 在此描述的方法更簡單并易于進(jìn)行大規(guī)模制備。關(guān)于天然螺旋的肽(例如腸降血糖素類，如 在此所描述的，包括GLP-1、胰高血糖素、GIP、VIP和促胰液素)的化學(xué)合成，認(rèn)為a-甲基氨基 酸的天然轉(zhuǎn)角誘導(dǎo)效應(yīng)改進(jìn)了肽在合成過程中的粗品產(chǎn)量。
[0044] 如在此所描述的，a-甲基氨基酸在合成肽的合成過程中在所希望的一個(gè)或多個(gè)位 點(diǎn)處被策略性地?fù)饺?。?jīng)修飾的氨基酸允許肽保持天然側(cè)鏈官能性，這常常對肽的受體效 價(jià)是關(guān)鍵的。
[0045] 在此提供了解決肽的天然酶傾向性的組合物和方法。通過用a_甲基官能化氨基酸 的位點(diǎn)特異性摻入來屏蔽敏感位點(diǎn)（例如，易裂開的鍵），提供了如下肽，其證明對酶降解增 加的抗性，同時(shí)仍然保持與野生型肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。 證明蛋白酶抗性的合成肽
[0046] 在實(shí)施例中，提供了包括用a-甲基官能化氨基酸對天然氨基酸殘基的至少一個(gè)取 代的合成肽。在其他實(shí)施例中，提供了包括用甲基官能化氨基酸對天然氨基酸殘基的至 少兩個(gè)取代的合成肽。
[0047]如在此所描述的，"合成肽"是指氨基酸殘基的聚合物，其已經(jīng)通過將一個(gè)氨基酸 的羧基基團(tuán)或C-末端化學(xué)偶聯(lián)至另一個(gè)氨基酸的氨基基團(tuán)或N-末端而產(chǎn)生?；瘜W(xué)肽合成在 肽的C-末端開始并且在N-末端結(jié)束。用于肽合成以產(chǎn)生合成肽的各種方法是本領(lǐng)域熟知 的。
[0048] 如在此所描述的，"a_甲基官能化氨基酸"是指如下氨基酸，其中該氨基酸的第一 (a)碳原子包括結(jié)合至該a碳的一個(gè)甲基基團(tuán)（CH3)取代基。a_甲基官能化氨基酸包括含這 種官能化的二十一種氨基酸中的任一者。
[0049] 如通篇所述，a-甲基官能化氨基酸可以取代，即，可以替換肽中的任何天然氨基 酸。"天然"氨基酸是指存在于天然肽或野生型肽中的氨基酸，其將被取代。
[0050] 取代是指用a_官能化氨基酸替換天然氨基酸。在合成肽的化學(xué)合成過程中，該天 然氨基酸可以容易地被a官能化氨基酸所替換。
[0051 ]雖然在此描述的合成肽可以是任何長度的，即，長度是任意數(shù)目的氨基酸，適當(dāng) 地，合成肽的長度是近似約5個(gè)氨基酸至約200個(gè)氨基酸，長度適當(dāng)?shù)厥羌s10個(gè)氨基酸至約 150個(gè)氨基酸，長度是約20個(gè)氨基酸至約100個(gè)氨基酸，長度是約30個(gè)氨基酸至約75個(gè)氨基 酸，或長度是約20個(gè)氨基酸、約30個(gè)氨基酸、約40個(gè)氨基酸、約50個(gè)氨基酸、約60個(gè)氨基酸、 約70個(gè)氨基酸、約80個(gè)氨基酸、約90個(gè)氨基酸或約100個(gè)氨基酸。
[0052]如通篇所述，在此描述的包含取代天然氨基酸的一種或多種a-官能化氨基酸的合 成肽維持與對應(yīng)的不包括這些取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。在一些情況 下，這些合成肽包含取代天然氨基酸的兩個(gè)或更多個(gè)官能化氨基酸。
[0053]術(shù)語"受體效價(jià)"是指肽的半數(shù)最大(50%)有效濃度(EC5Q)的倒數(shù)。EC5Q是指肽在 指定的暴露時(shí)間之后誘導(dǎo)介于對于肽的選定靶標(biāo)的基線應(yīng)答與最大應(yīng)答之間的一半的生 物應(yīng)答的濃度。因此，表現(xiàn)出小的EC5Q值的肽具有相應(yīng)高的受體效價(jià)，然而表現(xiàn)出大的EC 50 值的肽具有相應(yīng)低的受體效價(jià)，即誘導(dǎo)與受體相關(guān)的應(yīng)答所需要的肽越多，該肽對該受體 的效價(jià)就越小。
[0054] 用于確定受體效價(jià)和EC5Q的方法是本領(lǐng)域中已知的并且適當(dāng)?shù)厣婕按_定一種或多 種細(xì)胞受體應(yīng)答的刺激。例如，通過標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生表達(dá)GLP-1受體(GLP-1R)、胰高血糖素受 體(GCGR)或葡萄糖依賴性促胰島素肽(抑胃多肽)受體(GIPR)的合適的細(xì)胞系。這些不同受 體的肽活化導(dǎo)致下游的cAMP第二信使的產(chǎn)生，其可以在功能活性測定中測得。從這些測量， EC 5q值可容易地確定。
[0055] 如通篇所述，包括a-官能化氨基酸的一個(gè)或多個(gè)取代的合成肽(在此也稱為"經(jīng)取 代的肽"）維持與對應(yīng)的不包括取代的合成肽"基本上相同的"受體效價(jià)。如在此所使用，"基 本上相同的"當(dāng)是指受體效力時(shí)意指當(dāng)將這些經(jīng)取代的肽與不包含任何取代并且最好包含 原始的未經(jīng)修飾的野生型序列、或其他適合的比較物序列（即對照）的肽的受體效價(jià)進(jìn)行比 較時(shí)，這些經(jīng)取代的肽表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)丶s75 %的受體效價(jià)。在另外的實(shí)施例中，當(dāng)將經(jīng)取代的 肽與不包含任何取代并且最好包含原始的未經(jīng)修飾的野生型序列、或其他適合的比較物序 列（即對照）的肽的受體效價(jià)進(jìn)行比較時(shí)，這些經(jīng)取代的肽表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)丶s80%的受體效 價(jià)、或約85 %的受體效價(jià)、或約90 %的受體效價(jià)、或約91 %的受體效價(jià)、或約92 %的受體效 價(jià)、或約93 %的受體效價(jià)、或約94 %的受體效價(jià)、或約95 %的受體效價(jià)、或約96 %的受體效 價(jià)、或約97 %的受體效價(jià)、或約98%的受體效價(jià)、或約99 %的受體效價(jià)、或約99.1 %的受體 效價(jià)、或約9 9.2 %的受體效價(jià)、或約9 9.3 %的受體效價(jià)、或約9 9.4 %的受體效價(jià)、或約 99.5 %的受體效價(jià)、或約99.6 %的受體效價(jià)、或約99.7 %的受體效價(jià)、或約99.8 %的受體效 價(jià)、或約99.9 %的受體效價(jià)、或適當(dāng)?shù)丶s100 %的受體效價(jià)。
[0056] 如通篇所述，包括a-官能化氨基酸的一個(gè)或多個(gè)取代的合成肽還適當(dāng)?shù)鼐S持與對 應(yīng)的不包括這些取代的合成肽"基本上相同的選擇性"。如在此所使用，"選擇性"是指肽結(jié) 合其靶標(biāo)（即激動(dòng)劑，該肽其被設(shè)計(jì)成結(jié)合至激動(dòng)劑），同時(shí)不結(jié)合至其他非靶標(biāo)蛋白的能 力。適當(dāng)?shù)?，?dāng)將經(jīng)取代的肽與不包含任何取代并最好包含原始的未經(jīng)修飾的野生型序列、 或其他適合的比較物序列（即對照）的肽的受體效價(jià)進(jìn)行比較時(shí)，這些經(jīng)取代的肽表現(xiàn)出 "基本上相同的選擇性"并從而表現(xiàn)出約75%的選擇性。在另外的實(shí)施例中，當(dāng)將經(jīng)取代的 肽與不包含任何取代并且最好包含原始的未經(jīng)修飾的野生型序列、或其他適合的比較物序 列（即對照）的肽的選擇性進(jìn)行比較時(shí)，這些經(jīng)取代的肽表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)丶s80%的選擇性、或 約85 %的選擇性、或約90 %的選擇性、或約91 %的選擇性、或約92 %的選擇性、或約93 %的 選擇性、或約94 %的選擇性、或約95 %的選擇性、或約96 %的選擇性、或約97 %的選擇性、或 約98 %的選擇性、或約99 %的選擇性、或約99.1 %的選擇性、或約99.2 %的選擇性、或約 99.3 %的選擇性、或約99.4 %的選擇性、或約99.5 %的選擇性、或約99.6 %選擇性的、或約 99.7 %的選擇性、或約99.8 %的選擇性、或約99.9 %的選擇性、或適當(dāng)?shù)丶s100 %的選擇性。 [0057]適當(dāng)?shù)?，該a-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于野生型蛋白中的被取代的天然氨基酸。也 就是說，原始的野生型肽序列中的氨基酸被具有相同側(cè)鏈的甲基官能化氨基酸取代。換 言之，例如，Phe、Trp、Tyr等分別被 a-MePhe、a-MeTrp、a-MeTyr等取代。
[0058]在另外的實(shí)施例中，a-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于與被取代的天然氨基酸相同的類 另IJ。例如，脂肪族甲基官能化氨基酸取代脂肪族天然氨基酸;羥基甲基官能化氨基酸取 代羥基天然氨基酸;含硫的甲基官能化氨基酸取代含硫天然氨基酸;環(huán)狀甲基官能化 氨基酸取代環(huán)狀天然氨基酸;芳香族甲基官能化氨基酸取代芳香族天然氨基酸;堿性a_ 甲基官能化氨基酸取代堿性天然氨基酸;和/或酸性a_甲基官能化氨基酸取代酸性天然氨 基酸。
[0059] 在另外的實(shí)施例中，該a-甲基官能化氨基酸不對應(yīng)于被取代的天然氨基酸。
[0060] a-甲基官能化氨基酸的商業(yè)來源包括，例如，瑞士的巴亨公司(Bachem AG)。
[0061] 在示例性實(shí)施例中，在此描述的合成肽中的至少一個(gè)a-甲基官能化氨基酸是a-甲 基苯丙氨酸。
[0062] 在又另外的實(shí)施例中，在此描述的合成肽中的至少一個(gè)a-甲基官能化氨基酸選自 甲基官能化組氨酸、甲基官能化丙氨酸、甲基官能化異亮氨酸、甲基官能化精氨 酸、a-甲基官能化亮氨酸、甲基官能化天冬酰胺、a-甲基官能化賴氨酸、甲基官能化天 冬氨酸、a-甲基官能化甲硫氨酸、a-甲基官能化半胱氨酸、甲基官能化苯丙氨酸、a-甲基 官能化谷氨酸，甲基官能化蘇氨酸、甲基官能化谷氨酰胺、甲基官能化色氨酸、甲 基官能化甘氨酸、甲基官能化纈氨酸、a-甲基官能化鳥氨酸、a-甲基官能化脯氨酸、a-甲 基官能化硒代半胱氨酸、甲基官能化絲氨酸以及甲基官能化酪氨酸。
[0063]如通篇所述，在此描述的合成肽對蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。
[0064]如在此所使用，"蛋白降解"意指將肽分解為更小的肽或甚至氨基酸，通常由肽鍵 通過酶的水解所引起。
[0065]通篇所提供的對蛋白降解"實(shí)質(zhì)上有抗性"的合成肽表明在酶通常有活性的（即， 適合的PH、溫度、其他環(huán)境條件）的條件中暴露于該酶中持續(xù)一段限定的時(shí)間之后，至少約 50%的合成肽保持完整。適當(dāng)?shù)?，在此提供的合成肽對持續(xù)以下時(shí)間的蛋白降解是實(shí)質(zhì)上 有抗性的：至少4小時(shí)，更適當(dāng)?shù)刂辽?小時(shí)、至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、至少36小時(shí)、至少48 小時(shí)、至少72小時(shí)、至少96小時(shí)、至少120小時(shí)、至少144小時(shí)、至少168小時(shí)、至少192小時(shí)、至 少216小時(shí)、至少240小時(shí)、或約36小時(shí)至約240小時(shí)、約48小時(shí)至240小時(shí)、約72小時(shí)至約240 小時(shí)、約96小時(shí)至約240小時(shí)、約120小時(shí)至約240小時(shí)、約144小時(shí)至約240小時(shí)、約168小時(shí) 至約240小時(shí)、約192小時(shí)至約240小時(shí)、或約216小時(shí)至約240小時(shí)。在另外的實(shí)施例中，在酶 通常有活性的條件中暴露于該酶持續(xù)一段限定的時(shí)間之后，至少約80%的合成肽保持完 整，或在酶通常有活性的條件中暴露于該酶持續(xù)一段限定的時(shí)間之后，更適當(dāng)?shù)刂辽偌s 60 %、至少約70 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %、至少約96 %、至少約 97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.1%、至少約99.2%、至少約99.3 %、至少約 99.4%、至少約99.5%、至少約99.6%、至少約99.7%、至少約99.8%、至少約99.9%、或至 少約100 %的合成肽保持完整。
[0066] 所提供的合成肽是適當(dāng)?shù)貙υ诓溉閯?dòng)物體內(nèi)（適當(dāng)?shù)卦谌梭w內(nèi)）發(fā)現(xiàn)的一種或多 種酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。例如，這些合成肽是適當(dāng)?shù)貙σ韵赂黜?xiàng)中的一種或多種的 蛋白降解有抗性:二肽基肽酶-IV(DPP-IV)、腦啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、激肽 釋放酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胃蛋白酶。在適合的實(shí)施例中，這些合成肽是對兩種或更 多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、或適當(dāng) 地所有的所列舉的酶的蛋白降解有抗性。在此所描述的合成肽還可以對本領(lǐng)域中已知的其 他酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。在實(shí)施例中，在此所描述的這些合成肽是對消化（胃）酶和/ 或血液/血清中的酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。
[0067] 在實(shí)施例中，在此所描述的合成肽是對DPP-IV和腦啡肽酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗 性。在實(shí)施例中，在此所描述的這些合成肽是對胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性 蛋白酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。在實(shí)施例中，在此所描述的合成肽是對纖溶酶、凝血酶和 激肽釋放酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。在實(shí)施例中，在此所描述的這些合成肽是對胃蛋白 酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。在實(shí)施例中，在此所描述的這些合 成肽是對胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白降解實(shí)質(zhì)上有抗性。
[0068] 如在此所描述的，包括在通篇所提供的方法中，用a-官能化氨基酸取代天然氨基 酸適當(dāng)?shù)匕l(fā)生在是對蛋白水解裂解敏感的位點(diǎn)的天然氨基酸殘基處。也就是說，被取代的 氨基酸殘基被確定為其中蛋白水解酶在天然（即，野生型）肽的裂解肽鍵中有活性的位點(diǎn)。 用于確定蛋白水解裂解的位點(diǎn)的方法在本領(lǐng)域是熟知的且在此所描述的。
[0069] 可以根據(jù)在此提供的方法制備任何類別的肽，以產(chǎn)生具有所列舉的特征的合成 肽。
[0070] 在示例性實(shí)施例中，這些合成肽是腸降血糖素類肽。可以如在此所描述的制備的 示例性合成腸降血糖素類肽包括但不局限于，胰高血糖素樣肽l(GLP-l)、葡萄糖依賴性促 胰島素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱調(diào)蛋白、胃泌酸調(diào)節(jié)素或血管活性腸 肽(VIP) 〇
[0071] 另外類別的肽可以如在此所描述的來制備。
[0072]在實(shí)施例中，在此所描述的合成肽是GLP-1肽。在另外的實(shí)施例中，在此所描述的 合成肽是膜島素。
[0073]可以制備為用以產(chǎn)生具有所列舉的特征的合成肽的在此所描述的各種肽和肽類 別的天然(野生型)肽序列是本領(lǐng)域熟知的。
[0074] G P L - 1的天然氨基酸序列是本領(lǐng)域中已知的，如以下所列出的： HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID N0:l)〇
[0075]在實(shí)施例中，提供了合成GLP-1肽，這些合成GLP-1肽包括用a-甲基官能化氨基酸 對天然氨基酸殘基的至少三個(gè)取代。如通篇所述，適當(dāng)?shù)?，該合成GLP-1肽維持與對應(yīng)的不 包括這些取代的合成GLP-1肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。
[0076]在實(shí)施例中，該至少三個(gè)a-甲基官能化氨基酸取代對應(yīng)的天然氨基酸殘基。也就 是說，如在此所描述的，天然蛋白中的氨基酸被相同的對應(yīng)的a-甲基官能化氨基酸取代。
[0077] 在另外的實(shí)施例中，該三個(gè)a-甲基官能化氨基酸是a-甲基苯丙氨酸。在此類實(shí)施 例中，不必要的是，將被a-甲基官能化苯丙氨酸取代的天然氨基酸本身為苯丙氨酸。而是， 如在此所描述的，簡單地通過用來自同類的a-甲基官能化氨基酸（即，芳香族氨基酸）替換 一種天然芳香族氨基酸，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在此所描述的合成肽表現(xiàn)出所維持的受體效價(jià)和選擇性 連同增加的穩(wěn)定性的所希望的特征。
[0078] 在另外的實(shí)施例中，在此所描述的合成肽可以進(jìn)一步包括通過脂化的修飾，所述 脂化包括羧基末端脂化或氨基末端脂化或主鏈脂化。制備具有這種脂化的合成肽的方法是 本領(lǐng)域中已知的。已經(jīng)確定，與在此所述的其中天然氨基酸被a-甲基官能化氨基酸所取代 的實(shí)施例組合，C-末端脂化提供了另外的穩(wěn)定性，特別是在暴露于血清和胃液期間。
[0079] 適當(dāng)?shù)?，在此提供的合成GLP-1肽包括四種a-甲基官能化氨基酸。在實(shí)施例中，該 四種a-甲基官能化氨基酸取代對應(yīng)的氨基酸。在示例性實(shí)施例中，該四種a-甲基官能化氨 基酸在位置Phe6、Tryl3、Phe22和Trp25處取代，并且在另外的實(shí)施例中，該四種a-甲基官能 化氨基酸是在位置Phe6、Tryl3、Phe22和Trp25處取代的a-甲基苯丙氨酸。
[0080] 在另外的實(shí)施例中，在此提供的合成GLP-1肽包括六種a-甲基官能化氨基酸。在實(shí) 施例中，該六種a_甲基官能化氨基酸取代對應(yīng)的氨基酸。在示例性實(shí)施例中，該六種a-甲基 官能化氨基酸在位置?1^6、1'巧13、1^820、？11622、1'印25和1^828處取代，并且在另外的實(shí)施 例中，該六種a-甲基官能化氨基酸是在Phe6、Try 13、Phe22和Trp25位置處取代的四種a-甲 基苯丙氨酸以及在位置Lys20和Lys28處取代的兩種a-甲基賴氨酸。
[0081] 在適合的實(shí)施例中，在此所描述的GLP-1合成肽適當(dāng)?shù)剡M(jìn)一步包括在位置2(Aib2) 處的氨基異丁酸取代。在又另外的實(shí)施例中，在此所描述的GLP-1合成肽適當(dāng)?shù)剡M(jìn)一步包括 在位置5處用絲氨酸取代蘇氨酸(Thr5Ser;T5S)。在又另外的實(shí)施例中，在此所描述的GLP-1 合成肽適當(dāng)進(jìn)一步包括在位置26處用纈氨酸取代亮氨酸(Leu26Val ;L26V)。
[0082] 在實(shí)施例中，在此所描述的合成GLP-1肽對蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的，所述蛋白 降解包括但不局限于以下各項(xiàng)中的一種或多種的降解:DPP-IV、腦啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、 纖溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和胃蛋白酶。
[0083] 在另外的實(shí)施例中，在此提供了包括以下氨基酸序列的GLP-1肽，按次序?yàn)椋?br>[0084] R1-His-Xl-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-Xll-X12-R 2(SEQ ID NO:2), 其中： R1 是Hy、Ac或pGlu; R2 是-NH2 或-OH; XI 是Ala、Aib、Pr〇SGly; X2是Thr、Pro或Ser; 2F_Phe、Tyr、Trp、Tyr-OMe、4I_Phe、2F_Phe、3F_Phe、4F_Phe、1-NaI、2_NaI、Pro 或二 Me-Phe; X4是厶;113、厶1&、厶8卩、厶找、131卩、〇1&、0，0-〇1卩、6111、卩5-?116、？116、肌6、高？116、高丁5^、(1-MePhe、a-Me-2F_Phe、Phe、Thr、Trp、Tyr-OMe、41-Phe、2F_Phe、3F_Phe、4F_Phe、Tyr、1-Nal、 2_NaI、Pro或二-0，0-Me_Phe; X5是Aib、Lys、D_pro、Prol^a-MeLys; X6是厶；113、厶8卩、厶作、131卩、〇1&、1^11、1^8、2〇1-?116、3〇1-?116、4〇1-?116、？116、高？116、2]\16-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、2CF 3-Phe、3CF3-Phe、4CF3-Phe、0-Phe、0-MePhe、D-phe、4I-Phe、3I-卩116、2卩-?116、0，0-〇1卩、0-厶1&、1^16、1^11、卩5-?116、高丁5^、(1-]/[6?116、(1-]/[6-2卩-?116、361'、丁5^、 Trp、Tyr-0Me、3F-Phe、4F-Phe、Pro、1-NaI、2_NaI 或二-0，0-Me_Phe; X7是厶；113、厶坪、131卩、01&、0，0-01卩、卩5-?116、？116、？116、丁5^、高？116、高丁5^、(1-]/[6?116、(1-]/[6-2F_Phe、2Me_Phe、3Me_Phe、4Me_Phe、N1e、Tyr-OMe、4I_Phe、1-NaI、2_NaI、2F_Phe、3F_Phe、 4F_Phe、Pro、N-MeTrp、a-MeTrp 或二，0-Me-Phe; 父8是厶；113、厶1&、厶坪、厶8卩、6111、犯6、？1'0、361'、1^-]\161^11、(1-]/[61^11或\^1; X9 是 Aib、Glu、Lys、a-MeValSPro; X10是Aib、Glu、a-MeLys或Pro; 父11是八；113、6111、？1'0或361';并且 父12是厶;113、617、6111、？1'0或(1-]/[6八坪。
[0085] 適當(dāng)?shù)?，GLP-1肽由在SEQ ID N0:2中所列出的氨基酸序列組成，即，僅由在完整序 列中并按所列舉的順序列舉的氨基酸組成，如在SEQ ID N0:2中所列出的。 制備合成肽的方法
[0086]還提供了制備合成肽的方法。
[0087] 在一些實(shí)施例中，這些方法適當(dāng)?shù)匕ㄔ谠撾闹需b別用于取代的至少一個(gè)天然氨 基酸殘基。在其他實(shí)施例中，這些方法適當(dāng)?shù)匕ㄔ谠撾闹需b別用于取代的至少兩個(gè)天然 氨基酸殘基。然后用a_甲基官能化氨基酸取代所鑒別的天然氨基酸殘基。
[0088] 如通篇所述，通過在此提供的方法制備的合成肽適當(dāng)?shù)鼐S持與對應(yīng)的不包括取代 的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。此外，根據(jù)在此描述的方法制備的合成肽還對 蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。
[0089] 適當(dāng)?shù)兀诖颂峁┑姆椒ㄖ?，取代的a-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于被取代的天然氨 基酸殘基，并且在另外的實(shí)施例中，取代的甲基官能化氨基酸對應(yīng)于與被取代的天然氨 基酸殘基相同的類別。
[0090] 在另外的實(shí)施例中，取代的a_甲基官能化氨基酸是a_甲基苯丙氨酸。在示例性實(shí) 施例中，a-甲基苯丙氨酸取代對應(yīng)的天然氨基酸，但在方法的另外的實(shí)施例中，該a-甲基苯 丙氨酸并非必須對應(yīng)于其中發(fā)生取代的相同天然氨基酸。
[0091] 在適合的實(shí)施例中，根據(jù)在此描述的方法制備的合成肽對以下各項(xiàng)中的一種或多 種是實(shí)質(zhì)上有抗性的:DPP_IV、腦啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋 白酶、彈性蛋白酶和胃蛋白酶降解。
[0092] 在實(shí)施例中，將合成肽在諾瓦席恩? (NOVASYN@)TGR樹脂上制備為C-末端甲 酰胺。在環(huán)境溫度下，將氨基酸（天然和非天然兩者）使用于匪P中的HCTU/DIPEA適當(dāng)?shù)嘏?聯(lián)，用乙酸酐和吡啶的溶液加帽殘余官能團(tuán)。在環(huán)境溫度下，使用DMF中的哌啶將Fmoc適當(dāng) 地解封閉。
[0093] 如在此所描述的，在肽中鑒別用于取代的至少一個(gè)天然氨基酸殘基適當(dāng)?shù)匕ㄨb 別在對酶促裂解敏感的位點(diǎn)處的氨基酸。鑒別在對酶促裂解敏感的位點(diǎn)處的氨基酸的示例 性方法是本領(lǐng)域熟知的。在實(shí)施例中，鑒別在對酶促裂解敏感的位點(diǎn)處的氨基酸的方法適 合地包括在其中酶有活性的條件下(例如，合適的PH、緩沖條件、溫度等)將天然肽（即，野生 型肽)暴露于單一酶持續(xù)預(yù)定的時(shí)間量，并且測量該肽的酶降解產(chǎn)物。用于測量酶降解產(chǎn)物 的示例性方法包括，例如，反相液相色譜-質(zhì)譜法。
[0094] 適當(dāng)?shù)兀瑢㈦娜芤禾砑又了Ｍ牡鞍酌傅娜芤褐?。將肽和酶適當(dāng)?shù)卦诩s37°C下 進(jìn)行共孵育。將經(jīng)孵育的肽-酶混合物的等分部分周期性地取出，進(jìn)行淬滅以阻滯蛋白水解 活性，并且通過液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS)進(jìn)行分析。通過UV吸收（例如，在21 Onm處）以及通 過使用質(zhì)量檢測器(ESI+模式)的電離化兩者適當(dāng)?shù)貦z測分析物。將肽的酶促裂解產(chǎn)生的肽 種類(片段)進(jìn)行后處理分析，并且使用它們的分子質(zhì)量來鑒別精確的裂解位置(在每一情 況下突出顯示易斷開的鍵）。
[0095] 在實(shí)施例中，在此所描述的方法被適當(dāng)?shù)赜脕碇苽渚哂兴信e特征的任何類別的 肽。
[0096] 在示例性實(shí)施例中，這些方法被用來制備腸降血糖素類肽?？梢匀缭诖嗣枋鲋苽?的示例性合成腸降血糖素類肽包括但不局限于，胰高血糖素樣肽l(GLP-l)、葡萄糖依賴性 促胰島素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱調(diào)蛋白和胃泌酸調(diào)節(jié)素。
[0097]另外類別的肽可以如在此所描述的來制備。
[0098]在實(shí)施例中，這些方法被用來制備合成GLP-1肽。在另外的實(shí)施例中，這些方法被 用來制備合成胰島素。
[0099] 在另外的實(shí)施例中，提供了制備蛋白水解性穩(wěn)定的肽的方法。適當(dāng)?shù)?，此類方法?括將肽暴露于一種或多種蛋白酶、鑒別是對蛋白水解裂解敏感的位點(diǎn)的至少兩個(gè)天然氨基 酸殘基，并且用甲基官能化氨基酸取代所鑒別的氨基酸殘基。
[0100] 如通篇所述，適當(dāng)?shù)兀祟惙椒ㄌ峁┮环N合成肽，該合成肽維持與對應(yīng)的不包括一 個(gè)或多個(gè)取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。在另外的實(shí)施例中，這些方法還 提供一種合成肽，該合成肽對蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。
[0101] 適當(dāng)?shù)?，在此提供的方法中，取代的a-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于被取代的天然氨 基酸殘基，并且在另外的實(shí)施例中，取代的甲基官能化氨基酸對應(yīng)于與被取代的天然氨 基酸殘基相同的類別。
[0102] 在又另外的實(shí)施例中，取代的a_甲基官能化氨基酸選自選自a_甲基官能化組氨 酸、a-甲基官能化丙氨酸、甲基官能化異亮氨酸、a-甲基官能化精氨酸、甲基官能化亮 氨酸、a-甲基官能化天冬酰胺、a-甲基官能化賴氨酸、a-甲基官能化天冬氨酸、a-甲基官能 化甲硫氨酸、甲基官能化半胱氨酸、甲基官能化苯丙氨酸、甲基官能化谷氨酸，甲 基官能化蘇氨酸、甲基官能化谷氨酰胺、甲基官能化色氨酸、甲基官能化甘氨酸、a_ 甲基官能化纈氨酸、甲基官能化鳥氨酸、甲基官能化脯氨酸、甲基官能化硒代半胱氨 酸、甲基官能化絲氨酸以及甲基官能化酪氨酸。
[0103] 在另外的實(shí)施例中，取代的a_甲基官能化氨基酸是a_甲基苯丙氨酸和/或a_甲基 賴氨酸。在示例性實(shí)施例中，a_甲基苯丙氨酸和/或a-甲基賴氨酸取代對應(yīng)的天然氨基酸， 但在方法的另外的實(shí)施例中，該a_甲基苯丙氨酸和/或a-甲基賴氨酸并非必須對應(yīng)于其中 發(fā)生取代的相同天然氨基酸。
[0104] 在適合的實(shí)施例中，根據(jù)在此描述的方法制備的合成肽對以下各項(xiàng)中的一種或多 種是實(shí)質(zhì)上有抗性的:DPP_IV、腦啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋 白酶、彈性蛋白酶和胃蛋白酶降解。
[0105] 在實(shí)施例中，在此所描述的方法被適當(dāng)?shù)赜脕碇苽渚哂兴信e特征的任何類別的 肽。
[0106] 在示例性實(shí)施例中，這些方法被用來制備腸降血糖素類肽?？梢匀缭诖嗣枋鲋苽?的示例性合成腸降血糖素類肽包括但不局限于，胰高血糖素樣肽l(GLP-l)、葡萄糖依賴性 促胰島素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱調(diào)蛋白和胃泌酸調(diào)節(jié)素。
[0107] 另外類別的肽可以如在此所描述的來制備。
[0108] 在實(shí)施例中，這些方法被用來制備合成GLP-1肽。在另外的實(shí)施例中，這些方法被 用來制備合成胰島素。 包括合成肽的配制品
[0109] 還提供了包括在此所描述的合成肽的配制品（或藥物組合物）。適當(dāng)?shù)兀祟惻渲?品包括如在此所描述的合成肽以及載體。此類配制品可以按通篇所述的各種方法容易地給 予。在一些實(shí)施例中，該配制品包括藥學(xué)上可接受的載體。
[0110] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的載體"意指不干擾合成肽的生物活性的有效性的一種或多 種非毒性材料。此類制劑常規(guī)地可以含有鹽、緩沖劑、防腐劑、相容的載體以及任選地其他 治療劑。配制品常規(guī)地還可以含有適合給予人的相容固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物 質(zhì)。術(shù)語"載體"表示天然的或合成的有機(jī)或無機(jī)成分，合成肽與該載體組合以促進(jìn)應(yīng)用。
[0111] 如在此所描述的配制品可以調(diào)配用于特定劑量?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳的 期望反應(yīng)。舉例來說，如由治療情況所指示的，可以給予單次推注，可以隨著時(shí)間給予若干 分次劑量，或可以按比例地減少或增加劑量。尤其有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組 合物，以便于劑量的給予和均勻性。如在此使用的劑量單位形式是指用于有待治療的受試 者的、適合作為單一劑量的物理上離散的單位;每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算以與需要的藥用載體 相關(guān)的產(chǎn)生所希望的療效的預(yù)定量的合成肽。劑量單位形式的規(guī)格是通過以下各項(xiàng)指定并 且直接取決于以下各項(xiàng)：（a)合成肽的獨(dú)特特征和有待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果，以及(b)在混 配這種合成肽的領(lǐng)域中的固有限制。
[0112] 在此所描述的配制品可以被配制用于特定的給藥途經(jīng)，如口服、經(jīng)鼻、經(jīng)肺、局部 (包括經(jīng)頰和舌下）、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道和/或腸胃外給藥。這些配制品可以合宜地呈現(xiàn)為單位 劑型，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法來制備。可以與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑 型的合成肽的量將取決于正在被治療的受試者、以及特定的給藥模式而變化?？梢耘c載體 材料組合以產(chǎn)生單一劑型的合成肽的量一般將是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。 利用合成肽治療的方法
[0113] 在此還提供了治療患者的方法，這些方法包括向?qū)ζ溆行枰幕颊呓o予合成肽， 例如，在此所描述的配制品。
[0114] 可以按在此所描述的不同方法給予合成肽的適合受試者是哺乳動(dòng)物，如例如人 類、狗、貓、靈長類動(dòng)物、牛、綿羊、馬、豬等。
[0115] 可以通過在此所描述的不同方法中的任一種向該受試者給予合成肽的示例性方 法包括但不限于，靜脈內(nèi)（IV)、瘤內(nèi)（IT)、病灶內(nèi)（IL)、霧化、經(jīng)皮、口服、內(nèi)窺鏡、局部、肌內(nèi) (IM)、皮內(nèi)（ID)、眼內(nèi)（10)、腹膜內(nèi)（IP)、透皮(TD)、鼻內(nèi)（IN)、腦內(nèi)（1C)、器官內(nèi)（例如肝 內(nèi)）、緩釋植入物，或皮下給藥，或經(jīng)由使用滲透栗或機(jī)械栗給藥。
[0116] 適當(dāng)?shù)?，合成肽在適合的診斷之后盡快給予，例如在數(shù)小時(shí)或數(shù)天之內(nèi)。有待給予 的合成肽的持續(xù)時(shí)間和量易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定并且通常取決于肽和所治療的 疾病或障礙的類型。
[0117] 如在此所描述，適當(dāng)?shù)剡@些不同方法是對哺乳動(dòng)物受試者進(jìn)行，該哺乳動(dòng)物受試 者是人類，包括任何年齡的成人和兒童。
[0118] 在實(shí)施例中，治療的方法包括治療被診斷為患有糖尿病的患者，包括給予治療有 效量的如在此所描述的適合的合成肽，適當(dāng)?shù)厥侨缭诖怂枋龅暮铣蒅LP-1肽。
[0119] 如在此使用的，術(shù)語"治療有效量"是指合成肽或配制品的量，該量足以降低疾病 或障礙(或其一種或多種癥狀）的嚴(yán)重性，改善此類疾病或障礙的一種或多種癥狀，防止這 種疾病或障礙的進(jìn)展，致使這種疾病或障礙的消退，或者增強(qiáng)或改善另一種療法的一種或 多種治療效果。在一些實(shí)施例中，治療有效量不能事先指定，并且可以由照護(hù)者(例如，由醫(yī) 師或其他醫(yī)療服務(wù)提供者)使用各種方式(例如劑量調(diào)整)確定。適當(dāng)?shù)闹委熡行Я窟€可以 通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)使用例如動(dòng)物模型來確定。
[0120] 在實(shí)施例中，提供了治療被診斷為患有糖尿病的患者的方法，這些方法包括向患 者給予治療有效量的合成胰島素。
[0121] 如在此所描述，給予在此所描述的合成肽或配制品的適當(dāng)方法是口服遞送。如在 此所描述，合成肽對以下項(xiàng)是實(shí)質(zhì)上有抗性的：蛋白降解，即在口服給藥之后在胃中被酶降 解。
[0122] 相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易清楚的將是在不背離任何這些實(shí)施例的范圍的情 況下，可以對在此描述的這些方法和應(yīng)用做出其他適合的修改和適配。以下這些實(shí)例僅僅 出于說明的目的被特此包括并不旨在是限制性的。 實(shí)例 實(shí)例1:蛋白水解抗性肽的化學(xué)合成和測試 1 ?引g
[0123] 以下提供了用于制備如在此描述的蛋白水解抗性肽的示例性方法。2.縮寫
[0124] Boc，叔丁氧基羰基；DIPEA，N，N-二異丙基乙胺;DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DMS0，二 甲亞砜;ESI，電噴霧電離;Fmoc，9-芴基甲氧基羰基;GIP，抑胃多肽;GLP-1，胰高血糖素樣肽 1;HCTU，0-(lH-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯;RP-HPLC，反相高效液 相色譜法;EC 5Q，半數(shù)最大(50 % )有效濃度;LC/MS，與液相色譜聯(lián)用的質(zhì)譜;MeCN，乙腈;NMP， N-甲基吡咯烷酮;Pbf，2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基;PBS，磷酸鹽緩沖鹽水； 1，叔丁基;TFA，三氟乙酸;TIS，三異丙基硅烷;Tris，三(羥甲基)氨基甲烷;Trt，三苯基甲 基;UV，紫外線。 3.實(shí)驗(yàn) 3.1肽合成 3.1.1材料
[0125] N-a-Fmoc-L-氨基酸獲自瑞士巴亨公司（Bachem AG)。特殊氨基酸獲自德國愛麗思 生物技術(shù)有限公司（Iris Biotech AG)，或通過中國康龍化成（Pharmaron)制備。 NOVASYN?TGR(TentaGel Rink)和NOVASYN ?TGA(TentaGel Wang)合成樹脂獲自德 國達(dá)姆施塔特市（Darmstadt)默克生物科學(xué)（Merck Biosciences)的諾瓦生物化學(xué) (Novabiochem)。使用該Fmoc/tBu方案通過自動(dòng)化合成(PTI Prelude)制備所有肽。天冬酰 胺(Asn)與谷氨酰胺(Gin)作為它們的側(cè)鏈三苯甲基(Trt)衍生物摻入。色氨酸(Trp)與賴氨 酸(Lys)作為它們的側(cè)鏈Boc衍生物摻入。絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)與酪氨酸(Tyr)作為側(cè) 鏈tBu醚摻入，并且天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)作為它們的側(cè)鏈WBu酯摻入。精氨酸(Arg) 作為側(cè)鏈Pbf?衍生物摻入。合成試劑獲自英國多賽特(Dorset)的西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。溶劑以可獲得的最高等級獲自德國達(dá)姆施塔特市（Darmstadt)的默克公司 (Merck)，并且未經(jīng)進(jìn)一步純化而使用。 3.1.2用于包含a-甲基氨基酸的肽的化學(xué)合成的通用程序
[0126] 除非另外說明，將所有肽在諾瓦席恩@ (NOVASYN ?)TGR樹脂上制備為C-末 端甲酰胺(最初取代0.24mm〇le/g)。在環(huán)境溫度下，將所有氨基酸(天然和非天然兩者)使用 在匪P中的HCTU/DIPEA偶聯(lián)，用乙酸酐和吡啶的溶液加帽殘余官能團(tuán)。在環(huán)境溫度下，使用 DMF中的哌啶(20 % v/v)將Fmoc解封閉。 3.1.3線性肽的裂解和純化
[0127] 在環(huán)境溫度下，伴隨著攪拌，將粗肽通過使用TFA(95%V/v)、TIPS(2.5% V/v)、水 (2.5%v/v)的混合物處理從樹脂支持體上裂解。將裂解等分部分合并，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行 濃縮并且通過添加冷二乙醚進(jìn)行沉淀，通過離心來分離固體。將粗肽在干氮流下干燥，在 20%MeCN/水(v/v)中重構(gòu)并過濾。經(jīng)30分鐘將粗肽使用安捷倫(Agilent)Polaris C8-A固 定相（21.2x 250_，5微米）、用從 10%至70%MeCN(0.1%TFA v/v)于水(0.1%TFA v/v)中 的線性溶劑梯度洗脫、使用Varian SD-1制備型星雙栗系統(tǒng)、通過在210nm的UV吸收監(jiān)測進(jìn) 行色譜分析。將含有所希望的肽的部分合并，冷凍(干冰/丙酮)并凍干。 3.1.4肽分析和表征(合成后）
[0128] 通過單四極LC/MS、使用沃特斯質(zhì)量Lynx 3100平臺表征純化的肽。在環(huán)境溫度下， 將分析物通過在沃特斯X-橋C18固定相(4.6x 100111111，3微米)上、使用10%-90%1160叫0.1% TFA v/v)于水(0.1%TFA v/v)中的線性二元梯度以1.5mL min+經(jīng)10分鐘洗脫進(jìn)行色譜分 析。通過在210nm處的UV吸收以及通過使用沃特斯3100質(zhì)量檢測器(ESI+模式）的電離化兩 者檢測分析物，該質(zhì)量檢測器對比計(jì)算的理論值驗(yàn)證分子量。使用安捷倫1260Infinity系 統(tǒng)記錄分析型RP-HPLC譜。在40°C下，將分析物通過在沃特斯Polaris C8-A固定相（4.6x 100111111，3微米)上、以10%-90%]\^〇~(0.1%1卩厶￥八)于水(0.1%1卩厶￥八）中的線性二元梯 度以1.5mL mirT1經(jīng)15分鐘洗脫進(jìn)行色譜分析。 4酶促裂解研究 4.1評價(jià)包含a-甲基殘基的肽的蛋白水解抗性
[0129] 評估以下可商購的純化蛋白酶在已知有傾向的位點(diǎn)處裂解野生型腸降血糖素和 經(jīng)修飾的含有甲基氨基酸的腸降血糖素的能力。 表1:可商購的純化蛋白酶的實(shí)例
[0130]中性肽鏈內(nèi)切酶(腦啡肽酶）：將1 .Oyg rhNEP在900yL的測定緩沖液中重構(gòu)，該測 定緩沖液包括:50mM Tris、50mM NaCl、50mM NaHC03,使用NaOH(l.OM)調(diào)節(jié)至pH 8.3。
[0131] 胃蛋白酶:將1. Omg的來自豬胃粘膜的凍干胃蛋白酶在900yL的以下測定緩沖液中 重構(gòu)：10mM HC1，提供在pH 2.0下的0.4%(w/v)溶液。
[0132] 胰蛋白酶:將lmg/mL來自豬胰腺的凍干胰蛋白酶的溶液在以下測定緩沖液中重 構(gòu)：50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl、lmM HC1，調(diào)節(jié)到pH 7.8。
[0133] 胰凝乳蛋白酶：將l.Oyg rhCTRC在900yL的以下測定緩沖液中重構(gòu)：50mM Tris、 10mM CaCl2、150mMNaCl、lmM HC1，調(diào)節(jié)至pH 7.8。 4.1.2程序
[0134] 將用于評價(jià)的肽制備成于純水、注射用無菌鹽水(0.9%w/v NaCl/水)或IX PBS (達(dá)爾伯克(Dulbecco))中的濃度為1.0mg/mL的溶液。將100yL(100yg/mL肽）的這些溶液添 加至900此的每種蛋白酶溶液中。進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)在暴露于血清和胃液過程中的蛋白 降解。對于血清研究，將肽與50 %雌性斯普拉-道來(Sprague-Dawl ey)品系大鼠血清（SD大 鼠血清)進(jìn)行孵育。對于胃液研究，將肽與新鮮大鼠胃液1:1 (體積:體積)進(jìn)行孵育。
[0135] 將肽和酶(或血清或胃液)在37 °C的溫度調(diào)節(jié)水浴中共孵育實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間。在每 個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，將1〇〇此等分部分（lOiig肽）的經(jīng)孵育的肽-酶混合物周期性地取出，通過添 加等體積的5%TFA(v/v)于1:1水/乙腈中淬滅，以阻滯蛋白水解活性，并且通過液相色譜-質(zhì)譜法(LC/MS):安捷倫Polaris C8-A柱(4.6x 100mm，3微米）、使用 10%-90%MeCN(0.1% TFA v/v)于水(0.1%TFA v/v)中的線性二元梯度以1.5mL mirT1經(jīng)30分鐘在環(huán)境溫度下進(jìn) 行分析。通過在210nm處的UV吸收以及通過使用沃特斯3100質(zhì)量檢測器(ESI+模式）的電離 化兩者來檢測分析物。將源自肽的酶促裂解的新肽種類(片段)進(jìn)行后處理分析，并且使用 它們的分子質(zhì)量來鑒別精確的裂解位置(在每一情況下突出顯示易斷開的鍵）。
[0136] 適當(dāng)?shù)蒯槍ι飳W(xué)活性(例如，一種或多種細(xì)胞受體應(yīng)答的刺激），檢測在此描述 的合成GLP-1肽的生物活性/受體效價(jià)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法在HEK293細(xì)胞或CH0細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá) 人、小鼠、大鼠、或狗GLP-1受體(GLP-1R)、胰高血糖素受體(GCGR)或葡萄糖依賴性促胰島素 肽(抑胃多肽)受體(GIPR)的穩(wěn)定細(xì)胞系。這些不同受體的肽活化導(dǎo)致下游的cAMP第二信使 的累積，其可以在功能活性測定中測得。
[0137] 使用"測定緩沖液"進(jìn)行cAMP測定:測定緩沖液:在含有25mM HEPES的HBSS(西格瑪 公司（Sigma)編號H8264)中的0.1%BSA(西格瑪公司編號A3059)，pH 7.4并且含有0.5111]\1 IBMX(西格瑪公司編號17018)。
[0138] 使用低蛋白結(jié)合的384孔板(格瑞納公司（Greiner)編號781280)來進(jìn)行制作在測 定緩沖液中的測試樣品的十一次1比5連續(xù)稀釋。所有樣品稀釋度均制作一式兩份。
[0139] 將表達(dá)感興趣受體的細(xì)胞的凍結(jié)的冷凍小瓶在水浴中迅速解凍，轉(zhuǎn)移到預(yù)加溫的 測定緩沖液中并且在240xg旋轉(zhuǎn)離心5分鐘。以批次依賴性優(yōu)化的濃度將細(xì)胞重新懸浮在測 定緩沖液中（例如，hGCGR細(xì)胞為2x 105個(gè)細(xì)胞/ml，hGLP-lR和hGIPR細(xì)胞為lx 105個(gè)細(xì)胞/ ml) 〇
[0140] 從稀釋板上將5iiL重復(fù)樣品壓印到黑色淺孔u(yù)型底部的384孔板（康寧公司 (Corning)編號3676)上。為此，添加5yL細(xì)胞懸液，并且將這些板在室溫下孵育30分鐘。
[0141] 使用可商購的cAMP動(dòng)態(tài)2HTRF試劑盒(Cisbio,目錄號62AM4PEJ)，遵循按照制造商 的建議的兩步方案測定cAMP水平。簡要地說，通過將抗cAMP穴狀化合物（供體熒光團(tuán)）和 cAMP-d2(受體熒光團(tuán)）各1/20稀釋于提供在該試劑盒中的綴合與裂解緩沖液中而單獨(dú)地將 它們制成。將5yL抗cAMP穴狀化合物添加到測定板的所有孔中，并且將5yL cAMP-d2添加到 除了非特異性結(jié)合(NSB)孔之外的所有孔中，向其上添加綴合與裂解緩沖液。將這些板在室 溫下孵育一個(gè)小時(shí)，并且然后在易美遜(Envision) (I自金埃爾默(Perkin Elmer))上使用 320nm的激發(fā)波長和620nm與665nm的發(fā)射波長進(jìn)行讀數(shù)。然后確定在cAMP測定中確定的合 成肽的EC 5q值。
[0142] 在用于確定生物活性/受體效價(jià)的另外的實(shí)驗(yàn)中，將具有人、小鼠或大鼠GCGR或 GLP-1受體的穩(wěn)定重組表達(dá)的CH0細(xì)胞在如上文的測定緩沖液中培養(yǎng)。在lx細(xì)胞冷凍培養(yǎng) 基-DMS0無血清（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich))中以lx 107或2x 107/小瓶制備冷 凍保存細(xì)胞母液并且在-80 °C下保存。將細(xì)胞在37 °C迅速解凍，并且然后稀釋在含有血清白 蛋白（對于人、大鼠、和小鼠血清白蛋白分別為4.4 %、3.2 %和3.2 % )的測定緩沖液(如上文 的緩沖液）中。將肽連續(xù)稀釋在100%DMS0中，并且然后按照規(guī)定的終濃度在含有血清白蛋 白的測定緩沖液(如上文）中稀釋100倍。然后將稀釋的肽轉(zhuǎn)移到384黑色淺孔微量滴定測定 板中。將細(xì)胞添加到測定板上并且在室溫孵育30分鐘。孵育之后停止測定，并且按照制造商 的指南使用可獲自CisBio生物測定公司（CisBio Bioassays)的HTRF?動(dòng)力d2cAMP測定試 劑盒測量cAMP水平。將板在珀金埃爾默的ENVISION?熒光讀板儀上進(jìn)行讀數(shù)。人和大鼠 血清白蛋白購自西格瑪奧德里奇公司，而小鼠血清白蛋白購自Equitech生物有限公司。
[0143] 如制造商的指南中所述將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成％ A F，并且通過4-參數(shù)邏輯擬合法進(jìn)行分 析以確定EC5Q值。所確定的EC5Q值取決于所測試的肽在重組細(xì)胞系中的GLP-1受體和胰高血 糖素受體兩者上的效價(jià)并且取決于該肽對血清白蛋白的親和力，該親和力決定游離肽的 量。與血清白蛋白的結(jié)合增加所獲得的EC 5Q值?？苫赾AMP產(chǎn)生隨著SA濃度的變化來計(jì)算處 于血漿濃度的白蛋白的游離肽的部分以及在0%血清白蛋白（SA)的EC 5q。為了比較在不同肽 之間并且在經(jīng)過不同的條件下在GLP-1R和GCGR上的活性的平衡，可使這些活性相關(guān)聯(lián)，其 中EC 5Q與比較物肽的活性有關(guān)。
[0144] 適當(dāng)?shù)蒯槍ι飳W(xué)活性(例如，一種或多種細(xì)胞受體應(yīng)答的刺激），檢測在此描述 的合成GLP-1肽的生物活性/受體效價(jià)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法在HEK293S或CH0細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)人、 小鼠、大鼠、或狗GLP-1受體(GLP-1R)、胰高血糖素受體(GCGR)或葡萄糖依賴性促胰島素肽 (抑胃多肽)受體(GIPR)的穩(wěn)定細(xì)胞系。這些不同受體的肽活化導(dǎo)致下游的cAMP第二信使的 產(chǎn)生，其可以在功能活性測定中測得。
[0145] 使用"測定培養(yǎng)基"進(jìn)行cAMP測定： 測定培養(yǎng)基：在DMEM(吉布科公司（Gibco)編號41966)中的10%FBS，含有0.5mM IBMX (西格瑪公司（Sigma)編號17018)。
[0146] 使用低蛋白結(jié)合的384孔板(格瑞納公司（Greiner)編號781280)來進(jìn)行制作在測 定培養(yǎng)基中的測試樣品的十一次1比5連續(xù)稀釋。所有樣品稀釋度均制作一式兩份。
[0147] 將表達(dá)感興趣受體的細(xì)胞的凍結(jié)的冷凍小瓶在水浴中迅速解凍，轉(zhuǎn)移到預(yù)加溫的 測定培養(yǎng)基中并且在240xg旋轉(zhuǎn)離心5分鐘。以優(yōu)化的濃度將細(xì)胞重新懸浮在測定培養(yǎng)基中 (例如，hGCGR細(xì)胞為lx 105個(gè)細(xì)胞/ml，hGLP-lR和hGIPR細(xì)胞為0.5x 105個(gè)細(xì)胞/ml)。
[0148] 從稀釋板上將5iiL重復(fù)樣品壓印到黑色淺孔u(yù)型底部的384孔板（康寧公司 (Corning)編號3676)上。為此，添加5yL細(xì)胞懸液，并且將這些板在室溫下孵育30分鐘。
[0149] 使用可商購的cAMP動(dòng)態(tài)2HTRF試劑盒(Cisbio,目錄號62AM4PEJ)，遵循按照制造商 的建議的兩步方案測定cAMP水平。簡要地說，通過將抗cAMP穴狀化合物（供體熒光團(tuán)）和 cAMP-d2(受體熒光團(tuán)）各1/20稀釋于提供在該試劑盒中的綴合與裂解緩沖液中而單獨(dú)地將 它們制成。將5yL抗cAMP穴狀化合物添加到測定板的所有孔中，并且將5yL cAMP-d2添加到 除了非特異性結(jié)合(NSB)孔之外的所有孔中，向其上添加綴合與裂解緩沖液。將這些板在室 溫下孵育一個(gè)小時(shí)，并且然后在易美遜(Envision) (I自金埃爾默(Perkin Elmer))上使用 320nm的激發(fā)波長和620nm與665nm的發(fā)射波長進(jìn)行讀數(shù)。然后確定在cAMP測定中確定的合 成肽的EC 5q值。
[0150] 在用于確定生物活性/受體效價(jià)的另外的實(shí)驗(yàn)中，將具有人、小鼠或大鼠GlucR或 GLP-1受體的穩(wěn)定重組表達(dá)的CH0細(xì)胞在DMEM 10%FBS和遺傳霉素（100μg/ml)中培養(yǎng)。在lx 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基-DMS0無血清（西格瑪奧德里奇公司）中以2x l〇V小瓶制備冷凍保存細(xì)胞 母液并且在-80°C下保存。將細(xì)胞在37°C迅速解凍，并且然后稀釋在含有血清白蛋白（對于 人、大鼠、和小鼠血清白蛋白分別為4.4%、3.2 %和3.2 % )的測定緩沖液(DMEM)中。將肽連 續(xù)稀釋在DMS0中，然后按照規(guī)定的終濃度在含有血清白蛋白的DMEM中稀釋100倍。然后將稀 釋的肽轉(zhuǎn)移到384黑色淺孔微量滴定測定板中。將細(xì)胞添加到測定板上并且在室溫孵育30 分鐘。孵育之后停止測定，并且按照制造商的指南使用可獲自CisBio生物測定公司（CisBio B i 〇 a s s a y s )的H T R F龍動(dòng)力d 2 c A M P測定試劑盒測量c A M P水平。將板在珀金埃爾默的 ENVISION?熒光讀板儀上進(jìn)行讀數(shù)。人和大鼠血清白蛋白購自西格瑪奧德里奇公司，而 小鼠血清白蛋白購自Equ i t e ch生物有限公司。
[0151] 如制造商的指南中所述將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成％ A F，并且通過4-參數(shù)邏輯擬合法進(jìn)行分 析以確定EC5Q值。所確定的EC5Q值取決于所測試的肽在重組細(xì)胞系中的GLP-1受體和胰高血 糖素受體兩者上的固有效價(jià)并且取決于所述肽對血清白蛋白的親和力，該親和力決定游離 肽的量。與血清白蛋白的結(jié)合增加所獲得的EC 5Q值。可基于cAMP產(chǎn)生隨著HSA濃度的變化來 計(jì)算處于血漿濃度的白蛋白的游離肽的部分以及在〇%HSA的EC 5q。為了比較在不同肽之間 并且在經(jīng)過不同的條件下在GLP-1R和GlucR上的活性的平衡，可使這些活性相關(guān)聯(lián)，其中 EC 5q與比較物肽的活性有關(guān)。 4.1.3結(jié)果
[0152] 胰高血糖素樣肽1的酶促裂解的分析指明用于取代的適合的位點(diǎn)，如在圖1中所示 為八以、？1^6、了 743、1^2()、？11622、1^ 25、1^28、以及厶找3()。在下表2中示出的是一個(gè)示例性設(shè) 計(jì)流，其展示用于開發(fā)一種如在此描述的合成的、胰高血糖素樣肽l(GLP-l)的迭代，其中這 些氨基酸位點(diǎn)連同其他被取代。應(yīng)該認(rèn)識到，這種設(shè)計(jì)流可以容易地應(yīng)用于任何所希望的 肽，以產(chǎn)生如所希望的蛋白酶保護(hù)肽。 表2









[0153] 然后使用這些不同肽在暴露于選擇蛋白酶之后的穩(wěn)定性連同EC5q測定來引導(dǎo)所希 望的合成肽的選擇。
[0154] 圖2A-2C示出對標(biāo)準(zhǔn)GLP-1比較物的腦啡肽酶穩(wěn)定性研究的結(jié)果，針對該標(biāo)準(zhǔn)GLP-1比較物將經(jīng)修飾的類似物的穩(wěn)定性/效價(jià)進(jìn)行比較，該標(biāo)準(zhǔn)GLP-1比較物為H-(Aib) 2-EGT5FTSDV1QSSYLE15GQAAK 2QEFIAW25LVKGR3Q(SEQ ID N0:4)。箭頭展示原始峰的位置，以及在 用該蛋白酶孵育之后的4小時(shí)、21小時(shí)和68小時(shí)處的降解。如所示的，快速降解發(fā)生在所有 四種芳香族殘基的氨基-末端，其中該肽經(jīng)24小時(shí)被完全降解。
[0155] 圖 3A-3D 示出對合成 GLP-1 肽（11-(厶訃）2-￡6-(5)5-(€[-]\^卩）6-丁50￥ 1°55-(€[-]^卩）13-1^156〇4六1(2(^-(€[-]^?) 22-14-(€[-]\^?)251^1?1?3()，5￡〇10吣:38)的腦啡肽酶穩(wěn)定性研究的結(jié) 果。如所證明的，具有在位置Phe6、Tyrl3、Phe22和Trp25處取代的a-甲基苯丙氨酸連同在位 置5處用絲氨酸取代蘇氨酸的合成GLP-1肽經(jīng)96小時(shí)時(shí)程展示無蛋白降解。如在此描述進(jìn)行 的效力測量指示合成61^-1肽與61^-1比較物肽(5￡〇10從) :4)等效。
[0156] 為了證明腦啡肽酶在該實(shí)驗(yàn)中仍然是活性的，在240小時(shí)之后添加GLP-1比較物肽 (SEQ ID N0:4)。如圖4A中所示，SEQ ID N0:38的GLP-1合成肽在10天之后仍是穩(wěn)定的。（參 見圖4A-4D中的方框1。）在圖4B-4D中，比較物肽的添加在僅1小時(shí)之后很快開始降解(參見 方框2)，其中在24小時(shí)之前顯著降解發(fā)生(參見方框3)。
[0157] 圖5A-5C示出對標(biāo)準(zhǔn)GLP-1比較物(SEQ ID N0:4)的胰凝乳蛋白酶穩(wěn)定性研究的結(jié) 果。箭頭展示原始峰的位置，以及在用該蛋白酶孵育45分鐘和2小時(shí)之后的降解。如所示的， 快速降解發(fā)生在所有疏水殘基的羧基-末端，其中該肽在45分鐘之前被完全降解。
[0158] 圖6A-6C示出對合成GLP-1肽(SEQ ID N0:38)的胰凝乳蛋白酶穩(wěn)定性研究的結(jié)果。 如所證明的，合成GLP-1肽展示在48小時(shí)之前降解發(fā)生，其中僅僅在Leu26/Val27處觀察到 裂解。
[0159] 圖 7A-7C 示出對合成 GLP-1 肽（11-(厶訃）2-￡6-(5)5-(€[-]\^卩）6-丁50￥ 1°55-(€[-]^卩）13-LE15GQAA-(a-MeK)20E-(a-MeF) 22-IA-(a-MeF)25-(V)26-V-(a-MeK)28-G-(G)30,SEQ ID NO: 51)的胰凝乳蛋白酶穩(wěn)定性研究的結(jié)果。如所證明的，用纈氨酸取代亮氨酸26導(dǎo)致合成GLP-1肽展示超過60小時(shí)的穩(wěn)定性，而未觀察到主要裂解產(chǎn)物。
[0160] 圖8A-8C示出對標(biāo)準(zhǔn)GLP-1比較物（SEQ ID N0:4)的胰蛋白酶穩(wěn)定性研究的結(jié)果。 在90分鐘之前，快速蛋白降解發(fā)生在Ly s2()、Ly s28和Arg3()的羧基側(cè)。
[0161] 圖9A-9C示出對合成GLP-1肽(SEQ ID N0:38)的胰蛋白酶穩(wěn)定性研究的結(jié)果。如所 證明的，合成GLP-1肽展示在90分鐘之前降解發(fā)生在Lys'Lys28和Arg 3()的羧基側(cè)。
[0162] 圖10A-10C示出對合成GLP-1肽(SEQ ID N0:51)的胰蛋白酶穩(wěn)定性研究的結(jié)果。如 所證明的，Lys20和Lys28兩者被a-甲基賴氨酸、Arg30被Gly30以及Leu26被Val26的取代導(dǎo) 致合成GLP-1肽展示顯著超過18小時(shí)的延長的穩(wěn)定性。
[0163] 圖11A-11B示出對標(biāo)準(zhǔn)GLP-1比較物（SEQ ID N0:4)的血清穩(wěn)定性研究的結(jié)果?？?速蛋白降解發(fā)生在60小時(shí)之后，得到痕量完整肽，其中血清蛋白酶的顯著自溶產(chǎn)生了肽片 段，這些肽片段擋住了該譜圖。
[0164] 圖12A-12B示出對合成GLP-1肽(SEQ ID N0:38)的血清穩(wěn)定性研究的結(jié)果。在60小 時(shí)之后，大約64%的肽保持完整，其中血清蛋白酶的自溶產(chǎn)生肽片段，這些肽片段擋住了該 譜圖。
[0165] 圖1 3 A - 1 3 D示出對月旨化的比較物G L P - 1肽（H - ( A i b ) 2 -EGT5FTSDV1QSSYLE15GQAAK2QEFIAW 25LVKGR3Q-(K-棕櫚），SEQ ID NO: 5)以及一種脂化的、蛋 白酶保護(hù)的 GLP-1 肽（H-Uibp-EG-OLh-MeFZ-TSDViQsS-h-MeF^-LEBGQAA-h-MeK) 20E-(a-MeF) 22-IA-(a-MeF)25-(V)26-V-(a-MeK)28-G-(G) 3°_K(棕櫚），SEQ ID N0:52)的胃液 穩(wěn)定性研究的結(jié)果。該脂化的、蛋白酶保護(hù)的GLP-1蛋白的穩(wěn)定性顯著超過脂化的比較物的 穩(wěn)定性。
[0166] 圖14A-14E示出對一種可商購的GLP-1激動(dòng)劑（利拉魯肽，諾和諾德公司 0(^(^(^虹4))的胃液穩(wěn)定性研究的結(jié)果，如與該脂化的、蛋白酶抗性3￡〇1〇^) :52相比 的。該脂化的、蛋白酶抗性的GLP-1肽的穩(wěn)定性顯著超過利拉魯肽的穩(wěn)定性。甚至進(jìn)一步在 示出放大譜圖的圖15A-15E中證明了穩(wěn)定性的顯著差異，指示該受保護(hù)的GLP-1肽(SEQ ID NO: 52)隨著時(shí)程幾乎未改變的譜圖。
[0167] 本申請中所引述的所有文件、專利、期刊論文和其他材料通過引用結(jié)合在此。
[0168] 盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的若干實(shí)施例，參照附圖完整地描述本發(fā)明，但應(yīng)理解的是， 不同變化和修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以是顯而易見的。應(yīng)理解，此類變化和修改都包 括在如所附權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明的范圍內(nèi)，除非它們背離該范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種合成肽，包括用α-甲基官能化氨基酸對天然氨基酸殘基的至少一個(gè)取代，其中 該合成肽維持與對應(yīng)的不包括這些取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性。2. 如權(quán)利要求1所述的合成肽，其中該至少一個(gè)α-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于被取代的 該天然氨基酸殘基。3. 如權(quán)利要求1所述的合成肽，其中該至少一個(gè)α-甲基官能化氨基酸選自下組，該組由 以下各項(xiàng)組成:α-甲基組氨酸、α-甲基丙氨酸、α-甲基異亮氨酸、α-甲基精氨酸、α-甲基亮氨 酸、甲基天冬酰胺、甲基賴氨酸、甲基天冬氨酸、甲基甲硫氨酸、甲基半胱氨酸、 α-甲基苯丙氨酸、α-甲基谷氨酸、α-甲基蘇氨酸、α-甲基谷氨酰胺，α-甲基色氨酸、α-甲基甘 氨酸、α-甲基纈氨酸、α-甲基鳥氨酸、α-甲基脯氨酸、α-甲基硒代半胱氨酸、α-甲基絲氨酸以 及α-甲基酪氨酸。4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的合成肽，其中該合成肽對蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性 的。5. 如權(quán)利要求4所述的合成肽，其中該合成肽對DPP-IV、腦啡肽酶、胰凝乳蛋白酶、纖溶 酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的合成肽，其中該天然氨基酸殘基是對蛋白水解裂解 敏感的位點(diǎn)。7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的合成肽，其中該肽是腸降血糖素類肽。8. 如權(quán)利要求7所述的合成肽，其中該肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胰高血糖素 樣肽l(GLP-l)、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)、艾塞那肽加胰高血糖素、促胰液素、腱調(diào)蛋 白、胃泌酸調(diào)節(jié)素和血管活性腸肽(VIP)。9. 如權(quán)利要求1所述的合成肽，其中該肽是胰島素。10. -種包括用α-甲基官能化氨基酸對天然氨基酸殘基的至少三個(gè)取代的合成GLP-1 肽，其中該合成GLP-1肽維持與對應(yīng)的不包括這些取代的合成GLP-1肽基本上相同的受體效 價(jià)。11. 如權(quán)利要求10所述的合成GLP-1肽，其中該至少三個(gè)α-甲基官能化氨基酸是α-甲基 苯丙氨酸。12. 如權(quán)利要求10所述的合成GLP-1肽，包括四個(gè)α-甲基官能化氨基酸。13. 如權(quán)利要求12所述的合成GLP-1肽，其中該四個(gè)α-甲基官能化氨基酸是在Phe6、 Tryl3、Phe22和Trp25位置處取代的α-甲基苯丙氨酸。14. 如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的合成GLP-1肽，進(jìn)一步包括在位置2(Aib2)處的氨 基異丁酸取代。15. 如權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的合成GLP-1肽，進(jìn)一步包括在位置5(Ser5)處的絲 氨酸修飾。16. 如權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)所述的合成GLP-1肽，進(jìn)一步包括在位置Lys20和Lys28 處取代的α -甲基賴氨酸。17. 如權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)所述的合成GLP-1肽，進(jìn)一步包括取代亮氨酸26的纈氨 酸。18. 如權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)所述的合成GLP-1肽，進(jìn)一步包括C-末端脂化。19. 如權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)所述的合成GLP-1肽，其中該合成GLP-1肽對蛋白降解是 實(shí)質(zhì)上有抗性的。20. 如權(quán)利要求19所述的合成GLP-1肽，其中該合成GLP-1肽對DPP-IV、腦啡肽酶、胰凝 乳蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是實(shí)質(zhì) 上有抗性的。21. -種制備合成肽的方法，該方法包括： a. 在該肽中鑒別用于取代的至少一個(gè)天然氨基酸殘基;并且 b. 用α_甲基官能化氨基酸取代所鑒別的天然氨基酸殘基， 其中該合成肽維持與對應(yīng)的不包括該取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性， 并且 其中該合成肽對蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中該取代的α-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于該被取代的 天然氨基酸殘基。23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中該取代的α-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸。24. 如權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中該合成肽對DPP-IV、腦啡肽酶、胰凝乳 蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是實(shí)質(zhì)上 有抗性的。25. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中該鑒別包括鑒別在對酶促裂解敏感的位點(diǎn)處的氨 基酸。26. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中該肽是腸降血糖素類肽。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中該肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胰高血糖素 樣肽l(GLP-l)、胰高血糖素、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)、以及艾塞那肽。28. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中該肽是胰島素。29. -種制備蛋白水解性穩(wěn)定的肽的方法，該方法包括： a. 將肽暴露于一種或多種蛋白酶； b. 鑒別是對蛋白水解裂解敏感的位點(diǎn)的至少一個(gè)天然氨基酸殘基;并且 c .用α-甲基官能化氨基酸取代所鑒別的氨基酸殘基， 其中該合成肽維持與對應(yīng)的不包括該取代的合成肽基本上相同的受體效價(jià)和選擇性， 并且 其中該合成肽對蛋白降解是實(shí)質(zhì)上有抗性的。30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中該取代的α-甲基官能化氨基酸對應(yīng)于該被取代的 天然氨基酸殘基。31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中該取代的α-甲基官能化氨基酸是α-甲基苯丙氨酸。32. 如權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中該合成肽對DPP-IV、腦啡肽酶、胰凝乳 蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和/或胃蛋白酶降解是實(shí)質(zhì)上 有抗性的。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中該肽是腸降血糖素類肽。34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中該肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:胰高血糖素 樣肽1 (GLP-1)、葡萄糖依賴性促胰島素肽(GIP)、以及艾塞那肽。35. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中該肽是胰島素。36. -種治療患者的方法，該方法包括向該患者給予藥學(xué)上有效量的如權(quán)利要求1所述 的合成肽。37. -種治療被診斷為患有糖尿病的患者的方法，該方法包括向該患者給予治療有效 量的如權(quán)利要求10所述的合成GLP-1肽。38. -種治療被診斷為患有糖尿病的患者的方法，該方法包括向該患者給予治療有效 量的如權(quán)利要求9所述的合成胰島素。39. 如權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中該給予是口服。40. -種合成GLP-1肽，包括以下氨基酸序列： R1-His-Xl-Glu-Gly-X2-X3-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-X4-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-X5-Glu-X6-Ile-Ala-X7-X8-X9-X10-m-X12-R 2(SEQ ID NO:2)，其中： R1 是Hy、Ac或pGlu; R2 是-NH2 或-OH; XI是Ala、Aib、Pro或Gly; X2是Thr、Pro或Ser; 2F-Phe、Tyr、Trp、Tyr-〇Me、4I-Phe、2F-Phe、3F-Phe、4F_Phe、1-NaI、2_NaI、Pro 或二-β，β-Me-Phe; }(4是六;[13、六1&、六8卩、六作、81卩、〇1&、0，0-〇1卩、611145-?116、？116、肌6、高？116、高171'、〇-MePhe、a-Me-2F-Phe、Phe、Thr、Trp、Tyr-〇Me、4I-Phe、2F-Phe、3F-Phe、4F_Phe、Tyr、1-NaI、 2_NaI、Pro或二-β，β-Me-Phe; X5是Aib、Lys、D-pro、Pro或α-MeLys; X6 是六;113、六8卩、六作、81卩、〇1&、1^11、1^8、2〇1-?116、3〇1-?116、4〇1-?116、？116、高？116、2]\^-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、2CF3-Phe、3CF 3-Phe、4CF3-Phe、0-Phe、0-MePhe、D-phe、4I-Phe、3I- Trp、Tyr-〇Me、3F-Phe、4F_Phe、Pro、1-NaI、2_NaI 或二-β,β-Me-Phe; 2F-Phe、2Me-Phe、3Me-Phe、4Me-Phe、Nle、Tyr-〇Me、4I_Phe、1-NaI、2_NaI、2F_Phe、3F_Phe、 4F_Phe、Pro、N-MeTrp、α-MeTrp 或二-β，β-Me-Phe; }(8是六;!_13、六1&、六作、六8卩、6111、犯6、？1'〇、361'、?^-]^1^11、〇-]^1^11或\^1; X9 是六;!_13、6111、1^8、〇-]^\^1或？1'〇; X10是Aib、Glu、a_MeLys或Pro; )(11是六;!_13、6111、？1'〇或361';并且 }(12是六;[13、617、6111、？1'〇或〇-]^八作。
【文檔編號】A61K38/28GK105849123SQ201480067307
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月10日
【發(fā)明人】J.雷維爾, M.貝納雷
【申請人】免疫醫(yī)療有限公司