編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸和使用其生產(chǎn)阿洛酮糖的方法
【專利摘要】提供了阿洛酮糖3?差向異構(gòu)酶、編碼該酶的多核苷酸、攜帶該多核苷酸的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞及它們的用途。KCCM11405P20130329
【專利說(shuō)明】
編碼阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的多核苷酸和使用其生產(chǎn)阿洛酮糖 的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本公開(kāi)涉及阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶、編碼該阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的多核苷酸、 攜帶該多核苷酸的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞及它們?cè)谏a(chǎn)阿洛酮糖中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向異構(gòu)體，甜度為D-果糖的70%。與D-果糖不同，阿洛 酮糖在體內(nèi)很大程度上不被代謝，因此發(fā)現(xiàn)用于在血糖控制、齒洞預(yù)防和肝臟的脂肪生成 抑制中用作各種功能食品的糖成分。
[0003] 廣泛用作糖替代物的糖醇在攝入一定量或更多量時(shí)具有引起腹瀉的副作用，而已 知阿洛酮糖沒(méi)有副作用。
[0004] 因此，阿洛酮糖已經(jīng)引起人們對(duì)將其用作甜味劑有廣泛興趣，但是由于阿洛酮糖 在自然界很少發(fā)現(xiàn)，因此其有效生產(chǎn)是應(yīng)用于食品工業(yè)的前提條件。
[0005] 通常，阿洛酮糖通過(guò)化學(xué)方法由D-果糖通過(guò)鉬酸根離子的催化作用生產(chǎn)得到。同 時(shí)，最近已知使用來(lái)自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的阿洛酮糖差向異構(gòu) 酶的生物學(xué)方法是最有效的方法之一?；瘜W(xué)方法具有在糖蜜處理或葡萄糖異構(gòu)化過(guò)程中只 產(chǎn)生極少量阿洛酮糖的缺點(diǎn)，該方法昂貴，且產(chǎn)生副產(chǎn)物。此外，生物學(xué)方法的缺點(diǎn)在于生 產(chǎn)成本高，且產(chǎn)量低。
[0006] 因此，需要可以在適于工業(yè)化的溫度和pH條件下以高產(chǎn)量且無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生的方式 生產(chǎn)阿洛酮糖的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問(wèn)題
[0008] -種實(shí)施方式提供能夠?qū)-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的酶的氨基酸序列。
[0009] 另一種實(shí)施方式提供編碼該酶的多核苷酸。
[0010] 再一種實(shí)施方式提供攜帶該多核苷酸的重組載體。
[0011] 又一種實(shí)施方式提供含有該重組載體的重組細(xì)胞。
[0012] 又一種實(shí)施方式提供用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，所述組合物包含選自由以下組 成的組中的至少一種:酶、編碼所述酶的多核苷酸、攜帶所述多核苷酸的重組載體和含有所 述重組載體的重組細(xì)胞。
[0013] 還有一種實(shí)施方式提供一種使用選自由以下組成的組中的至少一種生產(chǎn)阿洛酮 糖的方法:酶、編碼所述酶的多核苷酸、攜帶所述多核苷酸的重組載體和含有所述重組載體 的重組細(xì)胞。
[0014] 技術(shù)方案
[0015] 從土壤中分離并鑒定具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的高活性的新型粘著劍菌 (Ensifer adhaerens)菌株(粘著劍菌SYG29;登記號(hào):KCCM11405P)。對(duì)粘著劍菌菌株的全部 基因的分析首先揭示出編碼負(fù)責(zé)將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的酶的多核苷酸及其核苷酸序 列。
[0016] 另外，將該多核苷酸插入重組載體中，并使其表達(dá)以提供具有由D-果糖生產(chǎn)阿洛 酮糖的活性的酶，從而完成了本發(fā)明。
[0017] 即，在本發(fā)明中，鑒定功能未知的蛋白的氨基酸序列和編碼該蛋白的基因的核苷 酸序列，該蛋白被認(rèn)為是能夠以高產(chǎn)量生產(chǎn)阿洛酮糖的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶。因此，本 發(fā)明的一個(gè)方面涉及該基因和該蛋白在生產(chǎn)阿洛酮糖中的用途以及該蛋白作為D-阿洛酮 糖差向異構(gòu)酶的用途。
[0018] 一種實(shí)施方式提供了一種蛋白，該蛋白包含SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，或基 本由該氨基酸序列組成。該蛋白可能具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的活性。因此，另一種實(shí) 施方式提供阿洛酮糖差向異構(gòu)體酶，該阿洛酮糖差向異構(gòu)酶包含SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列或基本由該氨基酸序列組成，并且具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的活性。該酶可能 具有D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)化活性。例如，該蛋白或該酶可以得自（源自）粘著劍菌，但是不 限于此。
[0019]該蛋白或該酶可以具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，但是只要該氨基酸序列 保留將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的活性(例如，D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)化活性），就可通過(guò)置 換、插入和/或缺失使其突變。例如，該蛋白或該酶可以在保留將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的 活性的情況下包含與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有70%或更高、80%或更高、90%或更 高、95%或更高、98%或更高或99%或更高的同源性的氨基酸序列。
[0020] 如通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)測(cè)得的，具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1共有至少70%的同源性的氨基酸序列的蛋白或酶 的分子量范圍可以為27~33kDa，例如29~31kDa。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的另外的方面，本發(fā)明提供編碼包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基 本由該氨基酸序列組成的蛋白的多核苷酸。此外，本發(fā)明的又一方面提出包含(攜帶)編碼 該蛋白的多核苷酸的重組載體。本發(fā)明的又一方面提供含有(包含）該重組載體的重組細(xì) 胞，即用該重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此，該重組細(xì)胞可以表達(dá)所述蛋白。
[0022]編碼該蛋白的多核苷酸可以包含以下，或基本由以下組成：SEQ ID N0:2所示的核 苷酸序列或與SEQ ID N0:2具有基本同一性的核苷酸序列。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"基本同 一性"是指，如通過(guò)比對(duì)程序所分析的，多核苷酸包含與參考序列相比具有至少70%序列同 一^性、至少80 %序列同一1性、至少90 %序列同一1性、至少95 %序列同一1性、至少98 %序列同 一性、至少99%序列同一性或100%序列同一性的序列，并且通過(guò)該多核苷酸序列編碼的蛋 白保留將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的活性。
[0023] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易意識(shí)到，具有基本同一性的編碼與參考酶活性相同的 酶蛋白的多核苷酸可通過(guò)借助本領(lǐng)域公知的基因工程技術(shù)進(jìn)行置換、插入或缺失一個(gè)或多 個(gè)核苷酸來(lái)制備。兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性比較可以使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序來(lái) 計(jì)算并用百分比（％)表示。
[0024] 多核苷酸可以自身單獨(dú)使用，或者可以以被重組載體攜帶的方式使用。術(shù)語(yǔ)"重組 載體"是指能夠遞送可操作地連接的感興趣的多核苷酸的重組核酸分子。感興趣的多核苷 酸可以可操作地連接至選自啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止因子中的至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。此外，多 核苷酸可以可操作地連接至例如化學(xué)化合物誘導(dǎo)元件或溫度敏感元件?；瘜W(xué)化合物誘導(dǎo)元 件可以選自由乳糖操縱子、T7啟動(dòng)子和trc啟動(dòng)子組成的組。源自T7噬菌體的T7啟動(dòng)子也含 有T7終止子。
[0025] 可以使用本領(lǐng)域公知的方法將重組載體構(gòu)建為克隆或表達(dá)用載體。任何適合在基 因重組中使用的載體都可以用作重組載體。例如，該載體可以選自由質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒表 達(dá)載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒)和具有相同功能的病毒載體組 成的組，但并不限于它們。詳細(xì)地，重組載體可以適于在大腸桿菌中表達(dá)，并且可以基于選 自由口￡1\口131^1'1'(^1^和口1](]組成的組中的一種進(jìn)行構(gòu)建。
[0026] 只要具有允許蛋白表達(dá)(過(guò)量表達(dá))的表達(dá)系統(tǒng)，任何微生物都可以用作重組載體 轉(zhuǎn)化為的宿主細(xì)胞。例如，大腸桿菌可能是有用的。大腸桿菌的實(shí)例包括但不限于:BL21、 廁109、1(-12、1^392、1^1、0115€[和13110，優(yōu)選121(0￡3)。此外，宿主細(xì)胞可能是從包括以下 的腸細(xì)菌和菌株中可選擇的：芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subti 1 is)和蘇云金芽抱桿菌（Baci 1 lus thuringiensis);棒狀桿菌（Corynebacteria spp ?)，諸如谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum);沙門氏菌屬（Salmonella spp.)，諸如鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium);粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens);和各種假單胞菌屬(Pseudomonas spp.) 0
[0027] 對(duì)于重組載體轉(zhuǎn)化為宿主細(xì)胞，其可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任何方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例 如，該方法的示例性的非限制性實(shí)例包括：原生質(zhì)體融合法、電穿孔法、基因槍法 (projectile bombardment)和病毒載體感染法。
[0028] 如上所述，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基本由該氨基酸序列組成的蛋白為 具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的高活性的酶蛋白。因此，該包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列 或基本由該氨基酸序列組成的蛋白或表達(dá)該蛋白的重組細(xì)胞可以有用地用于阿洛酮糖的 生產(chǎn)。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提出一種用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，包含選自 由以下組成的組中的至少一種:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基本由該氨基酸序列組 成的蛋白、編碼該蛋白的多核苷酸、攜帶該多核苷酸的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì) 胞、該重組細(xì)胞的培養(yǎng)物和該重組細(xì)胞的裂解物。用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物可以用于由 用作底物(base)的D-果糖生產(chǎn)阿洛酮糖。含有由重組細(xì)胞生產(chǎn)的酶蛋白的該培養(yǎng)物可以包 含該重組細(xì)胞，或者可以另外為不含細(xì)胞的形式。所述裂解物可以來(lái)源于重組細(xì)胞的裂解 或可以包含通過(guò)使裂解物離心得到的上清液，以使其在任何一種情況下都含有由重組細(xì)胞 產(chǎn)生的酶蛋白。除非本文另作說(shuō)明，重組細(xì)胞是指選自由菌株的細(xì)胞群、菌株的培養(yǎng)物和菌 株的裂解物組成的組中的至少一種。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供一種使用選自以下中的至少一種生產(chǎn)阿洛 酮糖的方法:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或基本由該氨基酸序列組成的蛋白、編碼該蛋 白的多核苷酸、攜帶該多核苷酸的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞、該重組細(xì)胞的培 養(yǎng)物和該重組細(xì)胞的裂解物(下文統(tǒng)稱為"酶蛋白"）。該生產(chǎn)阿洛酮糖的方法包括酶蛋白與 D-果糖的反應(yīng)。在一種實(shí)施方式中，酶蛋白與D-果糖之間的反應(yīng)可以通過(guò)使酶蛋白與D-果 糖接觸來(lái)進(jìn)行。在另一種實(shí)施方式中，酶蛋白與D-果糖之間的接觸可以通過(guò)例如將酶蛋白 與D-果糖混合或使D-果糖與固定在支持物上的酶蛋白接觸來(lái)進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中， 酶蛋白與D-果糖之間的反應(yīng)可以通過(guò)在含有D-果糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞的細(xì)胞群來(lái) 進(jìn)行。酶蛋白與D-果糖之間的反應(yīng)導(dǎo)致D-果糖轉(zhuǎn)化，從而由D-果糖生產(chǎn)阿洛酮糖。
[0031 ] 在生產(chǎn)阿洛酮糖的方法中，當(dāng)使用在反應(yīng)混合物中濃度為0.001mg/ml~2 .Omg/ ml、0?003mg/ml~2.Omg/ml、0?003mg/ml~1?Omg/ml、0.Olmg/ml~2?Omg/ml或0?01mg/ml~ 1. Omg/ml的酶蛋白時(shí)，可以在阿洛酮糖的生產(chǎn)中帶來(lái)效率。當(dāng)使用濃度低于下限的酶蛋白 時(shí)，阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率可能差。另一方面，過(guò)高濃度的酶蛋白降低阿洛酮糖生產(chǎn)的工業(yè)經(jīng)濟(jì) 性。
[0032]為了在該方法中有效地生產(chǎn)阿洛酮糖，使用在反應(yīng)混合物中濃度為40~80% (重 量/體積），例如濃度為55~75% (重量/體積）的用作底物的D-果糖。D-果糖的濃度低于下限 可能以這種方式降低阿洛酮糖的經(jīng)濟(jì)可行性。另一方面，如果D-果糖的濃度高于上限，D-果 糖不太容易溶解。因此，濃度優(yōu)選落入該范圍內(nèi)。D-果糖可以為在緩沖液或水（例如，蒸餾 水)中的溶液的形式。
[0033]在較高的pH值下，酶蛋白活性更強(qiáng)。它們?cè)诩s為7或高于7的pH下，或在約為7.5或 高于7.5的pH下，例如在7.5~10的pH下保持90%或更高的活性(參見(jiàn)圖5)。當(dāng)考慮這種對(duì)于 酶蛋白最佳的條件時(shí)，反應(yīng)可以在以下pH下進(jìn)行:pH為7或更高或pH為7.5或更高，例如，pH 為7~ll、pH為7~10、pH為7~9、pH為7.5~11411為7.5~10或口11為7.5~9。另外，反應(yīng)可以 在30°C或更高的溫度，例如40°C或更高的溫度下進(jìn)行。然而，底物D-果糖在70°C或更高的溫 度下可能有變褐的傾向。因此，反應(yīng)可以在40~70°C，例如42~65°C、45~62°C、50~60°C或 52~57°C的溫度條件下進(jìn)行。另外，較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致較高的阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率。推薦使反 應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)或更長(zhǎng)，例如2小時(shí)或更長(zhǎng)、3小時(shí)或更長(zhǎng)、4小時(shí)或更長(zhǎng)、5小時(shí)或更長(zhǎng)或6小時(shí) 或更長(zhǎng)。然而，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選設(shè)定在48小時(shí)內(nèi)，因?yàn)楫?dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)超過(guò)48小時(shí)時(shí)，阿洛酮 糖的轉(zhuǎn)化率的增量變得微小，或者可能減小。因此，反應(yīng)時(shí)間可以設(shè)定為1~48小時(shí)、2~48 小時(shí)、3~48小時(shí)、4~48小時(shí)、5~48小時(shí)或6~48小時(shí)?？紤]到工業(yè)和經(jīng)濟(jì)方面，反應(yīng)時(shí)間可 以落入1~48小時(shí)、2~36小時(shí)、3~24小時(shí)、3~12小時(shí)或3~6小時(shí)的范圍內(nèi)，但是并不限于 此。選擇該條件使由D-果糖到阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率最大。
[0034] 另外，當(dāng)在生產(chǎn)阿洛酮糖的方法中使用重組細(xì)胞時(shí)，其濃度可以設(shè)定為在整個(gè)反 應(yīng)混合物為511^((1〇￥:干細(xì)胞重量)/1111或更高，例如5~10〇11^((1〇￥)/1]11、10~9〇11^((1〇￥)/1]11、 20 ~80mg(dcw)/ml、30 ~70mg(dcw)/ml、40 ~60mg(dcw)/ml 或 45 ~55mg(dcw)/ml。如果細(xì)胞 群的濃度低于下限，表現(xiàn)出差的阿洛酮糖轉(zhuǎn)化活性或幾乎沒(méi)有阿洛酮糖轉(zhuǎn)化活性。另一方 面，濃度超過(guò)上限意味著細(xì)胞擁擠，所述細(xì)胞有可能起到阿洛酮糖的整個(gè)轉(zhuǎn)化率優(yōu)化的障 礙物的作用。
[0035] 具有阿洛酮糖轉(zhuǎn)化活性的酶蛋白可以表現(xiàn)出活性受金屬離子控制的金屬酶的性 質(zhì)，因此，金屬離子的存在可能促進(jìn)由酶蛋白催化的反應(yīng)，從而提高阿洛酮糖的產(chǎn)量。能夠 促進(jìn)阿洛酮糖的產(chǎn)量提高的金屬離子可以選自由以下組成的組:銅離子、錳離子、鈣離子、 鎂離子、鋅離子、鎳離子、鈷離子、鐵離子、鋁離子及它們的任意組合。例如，可以使用錳離子 和鎂離子中的任意一種或二者。當(dāng)金屬離子的量低于O.lmM時(shí)，對(duì)阿洛酮糖的產(chǎn)量的提高只 有略微作用。因此，使用量為O.lmM或更大的金屬離子。另一方面，當(dāng)金屬離子的量超過(guò)5mM 時(shí)，與該過(guò)剩的量相比，添加的作用是微小的。這樣，金屬離子的量設(shè)定為5mM或更少。例如， 使用量為0.1 mM~5mM，例如0.1~2mM或0.5~1.5mM的金屬離子。
[0036] 因此，用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物可以進(jìn)一步包含其種類和量為如上所述的金屬 離子。同樣，用于生產(chǎn)阿洛酮糖的方法可以進(jìn)一步包括其添加種類和量為如上所述的金屬 離子。在一種實(shí)施方式中，可以向底物D-果糖或D-果糖與酶蛋白的混合物中添加金屬離子。 在另一種實(shí)施方式中，金屬離子可以添加到固定有酶蛋白的支持物中（在添加 D-果糖之前） 或固定有酶蛋白的支持物與D-果糖的混合物中（在添加 D-果糖之后），或者金屬離子可以以 與D-果糖的混合物的形式添加或單獨(dú)與D-果糖一起添加。使用時(shí)，可以在向培養(yǎng)基中添加 金屬離子之后、之前或在向培養(yǎng)基中添加金屬離子的同時(shí)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞。
[0037] 只要為長(zhǎng)時(shí)間保持菌株或由該菌株產(chǎn)生的酶蛋白的活性創(chuàng)建環(huán)境，就可以使用任 何用于將該菌株或該酶蛋白固定到其上的支持物。例如，褐藻酸鈉可以用作該支持物。褐藻 酸鈉，一種天然存在的在褐藻的細(xì)胞壁中大量發(fā)現(xiàn)的膠體多糖，由0-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸組成，二者之間為共價(jià)m-4鍵。考慮到將菌株或酶穩(wěn)定地固定于其上，線性聚合 物可能對(duì)于阿洛酮糖的產(chǎn)量有利。在一種實(shí)施方式中，可以使用1.5~4.0% (重量/體積)的 褐藻酸鈉溶液(例如，褐藻酸鈉水溶液），例如約2.5 % (重量/體積）的褐藻酸鈉溶液來(lái)固定 菌株。作為實(shí)例，使菌株的細(xì)胞群、含有由該菌株產(chǎn)生的酶的培養(yǎng)肉湯或該菌株的裂解物與 1~2體積的褐藻酸鈉水溶液混合，使用注射器栗和真空栗將該混合物滴入0.2M的鈣離子溶 液中，以形成該菌株的細(xì)胞群、含有由該菌株產(chǎn)生的酶的培養(yǎng)物或該菌株的裂解物固定于 其上的珠。可以使用通常的方法(例如，透析、沉淀、吸附、電泳、親和色譜法或離子交換色譜 法)將酶從菌株、菌株的培養(yǎng)物或菌株的裂解物中純化出來(lái)。
[0038] -種實(shí)施方式提供用于生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，包括使選自由以下組成的組中的至 少一種與D-果糖反應(yīng)(或接觸）：包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、編碼該蛋白的多核 苷酸、攜帶該多核苷酸的重組載體、含有該重組載體的重組細(xì)胞、該重組細(xì)胞的培養(yǎng)物和該 重組細(xì)胞的裂解物。
[0039] 在一種實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)阿洛酮糖的方法可以包括：制備和純化阿洛酮糖差 向異構(gòu)酶蛋白，所述阿洛酮糖差向異構(gòu)酶蛋白包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1的氨基酸序列共有70%或更高的同源性的氨基酸序列；以及使該蛋白與D-果糖反 應(yīng)(或接觸）。
[0040] 在一種實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)阿洛酮糖的方法包括:培養(yǎng)和分離表達(dá)包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列或基本由該氨基酸序列組成的蛋白的重組細(xì)胞；以及使該重組細(xì)胞 或從該重組細(xì)胞分離出的酶蛋白與D-果糖反應(yīng)(或接觸）。
[0041] 重組細(xì)胞的培養(yǎng)可以在培養(yǎng)基中和在本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)菌株(宿主細(xì)胞)的性 質(zhì)容易選擇的條件下進(jìn)行。例如，培養(yǎng)可以為連續(xù)型培養(yǎng)、半連續(xù)型培養(yǎng)或分批型培養(yǎng) (batch-type culture)，但不限于此。培養(yǎng)基包含溶液和用于支撐宿主細(xì)胞（例如大腸桿 菌)或細(xì)胞內(nèi)含物的固體、半固體或剛性支持物，并且可以選自由標(biāo)準(zhǔn)2YT、LB、S0B和TB培養(yǎng) 基組成的組。
[0042] 通常，重組細(xì)胞的培養(yǎng)物可以在適合培養(yǎng)宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌）的條件下獲 得。例如，可以在35 °C~37 °C下在以150~250rpm攪拌下培養(yǎng)重組細(xì)胞。為了誘導(dǎo)酶蛋白的 過(guò)量表達(dá)，可以添加誘導(dǎo)物，例如本領(lǐng)域中通常使用的誘導(dǎo)物。作為實(shí)例，當(dāng)誘導(dǎo)元件為乳 糖操縱子或trc啟動(dòng)子時(shí)，可以使用乳糖或IPTG(異丙基硫代半乳糖吡喃糖苷)作為 誘導(dǎo)物。誘導(dǎo)的時(shí)間可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定。
[0043] 可以通過(guò)離心和/或過(guò)濾從培養(yǎng)物分離重組細(xì)胞。酶蛋白可以匯集在通過(guò)均質(zhì)化 菌株并離心勻漿獲得的上清液中，或者可以通過(guò)分級(jí)分離上清液并任選地通過(guò)色譜法純化 級(jí)分得到。例如，將分離的菌株懸于50mM磷酸鹽緩沖液中、裂解并離心。將上清液負(fù)載到Ni-NTA柱(Qiagen)中，隨后用20mM和250mM的咪唑洗脫酶蛋白。
[0044] 在該方法中，與D-果糖的反應(yīng)可以在用于優(yōu)化酶蛋白活性的條件下進(jìn)行，例如在7 或更高的pH或7.5或更高的pH下，例如在7~11、7~10、7~9、7.5~11、7.5~10或7.5~9的 pH下，和/或在40~70°C的溫度下，例如在42~65°C、45~62°C、50~60°C或52~57°C的溫度 下?？梢允褂迷诜磻?yīng)混合物中濃度為40~70% (重量/體積），例如50~75 % (重量/體積）的 D-果糖。已知D-果糖在該范圍內(nèi)，該方法可以經(jīng)濟(jì)有效地產(chǎn)生阿洛酮糖。
[0045] 另外，如果使用分離的重組細(xì)胞，優(yōu)選在與D-果糖反應(yīng)之前用例如0.85 % (重量/ 體積)NaCl清洗兩次或更多次。
[0046] 此外，與D-果糖的反應(yīng)可以在由錳和鎂組成的至少一種金屬的離子存在下進(jìn)行。 可以使用濃度為〇. ImM~5mM，例如0.1~2mM或0.5mM~1.5mM的金屬離子。金屬離子濃度小 于下限不能為酶的活性帶來(lái)充分的促進(jìn)。當(dāng)使用濃度高于上限的金屬離子時(shí)，與使用的量 相比，獲得的作用的增量微小。
[0047] 使用本發(fā)明的方法由D-果糖生產(chǎn)阿洛酮糖后，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易 地，例如，從由離心、過(guò)濾、結(jié)晶、離子交換色譜法及組合組成的組中選擇的通常方法純化 阿洛酮糖。
[0048] 有益效果
[0049] 根據(jù)本發(fā)明所述的新型阿洛酮糖差向異構(gòu)酶蛋白是具有生產(chǎn)阿洛酮糖的活性的 酶，在工業(yè)可應(yīng)用的條件下熱穩(wěn)定性優(yōu)異，具有長(zhǎng)的半壽期，并且便于由D-果糖以高產(chǎn)量大 量生產(chǎn)阿洛酮糖。因此，預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶和使用該酶生產(chǎn)阿洛 酮糖的方法有用地用在各種食品、藥品和化妝品工業(yè)中。
【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1是舉例說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的純化程序的SDS-PAGE的圖片（泳道 1:粗酶;泳道2:硫酸銨;泳道3:熱處理;泳道4: Hi-trap Q;泳道5和6:羥基磷灰石;泳道7、8、 9和 10 :Hi_trap苯基）。
[0051] 圖2是根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的用于表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶蛋白的重 組載體的裂解圖譜。
[0052] 圖3是表示一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性與使用的金屬離子的 種類的曲線圖。
[0053]圖4是表示一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性與溫度的曲線圖。 [0054]圖5是表示一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性與pH(_ :McilVaine 緩沖液;?:甘氨酸-NaOH緩沖液)的曲線圖。
[0055]圖6是表不一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在55 °C和60 °C下的活性與時(shí) 間的曲線圖。
[0056]圖7是一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的雙倒數(shù)(Lineweaver-Burk)圖。
[0057]圖8是表示使用一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶由高濃度D-果糖生產(chǎn)的 阿洛酮糖的產(chǎn)量(轉(zhuǎn)化率)的曲線圖。
[0058]圖9是表示由高濃度果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的一種實(shí)施方式的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu) 酶的活性的HPLC色譜圖。
[0059]圖10為表示由高濃度果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的實(shí)施例1的菌株的活性的HPLC色譜圖。 [0060] 圖11表示菌株KCCM11405P(5 ' -3 '）的16S核糖體RNA的核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0061] 通過(guò)以下給出的用于舉例說(shuō)明本發(fā)明而不解釋為本發(fā)明的限制的實(shí)施例可以獲 得對(duì)本發(fā)明的更好理解。
[0062] 實(shí)施例1:對(duì)具有將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的活性的土壤細(xì)菌粘著劍菌的培養(yǎng) [0063]將粘著劍菌菌株(粘著劍菌SYG29;登記號(hào):KCCM11405P)在含有1%阿洛酮糖的基 本培養(yǎng)基(KH2PO4 2.4g/L、K2HP〇4 5.6g/L、（NH4)2 ? S〇4 2.6g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.1g/L、酵母 提取物lg/L)中在30°C下震蕩培養(yǎng)24小時(shí)。以4000rmp離心20分鐘從培養(yǎng)物中分離細(xì)胞群。
[0064]菌株為按如下方式選擇的生產(chǎn)阿洛酮糖的菌株。
[0065] 使lg根際土壤懸于10mL 0.85%(重量/體積）的NaCl中，從該懸液中吸取100yl(微 升)平鋪在瓊脂平板上，并在30°C下孵育。在瓊脂平板上形成的菌落中，選擇形狀和大小不 同的那些菌落。將所選擇的菌落接種到基本培養(yǎng)基（KH2P〇4 2.4g/L、K2HP〇4 5.6g/L、 (NH4)2 ? S〇4 2.6g/L、MgS〇4 ? 7H20 0.1g/L、酵母提取物lg/L)中，并在30°C下震蕩培養(yǎng)24小 時(shí)。離心分離細(xì)胞群。將該細(xì)胞群懸于l〇〇yL 50mM的PIPES(哌嗪-N，N'_雙(2-乙磺酸））緩沖 液(pH為8.0)中，并使用超聲處理器(ColepParmer)使該細(xì)胞群裂解。在4°C下將裂解物以 12000rmp離心10分鐘后，分離由此形成的上清液，并用作粗酶。將10mM阿洛酮糖作為底物在 30°C下用該粗酶處理8小時(shí)。
[0066] 通過(guò)薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)監(jiān)測(cè)由阿洛酮糖到D-果糖的轉(zhuǎn) 化。TLC分析使用20cmX 5cm硅膠(硅膠60F254(Merck，德國(guó)））固相進(jìn)行，用85:15的乙腈和水 的混合物作為流動(dòng)相展開(kāi)3.5分鐘，進(jìn)行2次。對(duì)于HPLC，使用配備有Aminex HPX-87C柱 (BI0-RAD)的折射率檢測(cè)器（Agilent 1260RID)。將水用作流動(dòng)溶劑，在80°C下流速為 0?6ml/min〇
[0067] 將通過(guò)TLC分析發(fā)現(xiàn)將阿洛酮糖轉(zhuǎn)化為D-果糖的菌株接種到含有1 % (重量/體積） 果糖和0.05% (重量/體積)阿洛酮糖的基本培養(yǎng)基中，并在30°C下培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)離心分 離細(xì)胞群。該細(xì)胞群用0.85% (重量/體積）的NaCl清洗，以40mg-dcW/ml的濃度懸于含有 400g/L果糖和ImM猛離子的50mM的PIPES緩沖液(pH為8.0)中，并使其與D-果糖在70°C下反 應(yīng)6小時(shí)，隨后通過(guò)在100 °C下將反應(yīng)混合物加熱5分鐘使反應(yīng)終止。HPLC分析證實(shí)產(chǎn)生了阿 洛酮糖。對(duì)于HPLC，在如上所述的條件（溶劑:水;溫度:80°C;流速:0.6ml/min)下使用配備 有Aminex HPX-87C柱(BI0-RAD)的折射率檢測(cè)器(Agilent 1260RD)。結(jié)果在圖10中給出。如 通過(guò)HPLC分析所分析的，最終選擇發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)最大量阿洛酮糖的菌株。
[0068] 該菌株于2013年3月29日保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心，登記號(hào)為KCCM11405P。在圖 11中示出了該菌株的16S核糖體RNA的核苷酸序列(5 '->3 '）。
[0069] 實(shí)施例2:源自粘著劍菌的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的純化
[0070]將實(shí)施例1中分離的細(xì)胞群懸于含有ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)的50mM PIPES緩沖 液(pH為7.0)中，并使用超聲處理器(Col e-Parmer)在4°C下使其裂解40分鐘。在4°C下以 13000rmp離心裂解物20分鐘后，將上清液用作粗酶。
[0071] 通過(guò)向該粗酶中添加50~60%的飽和硫酸銨（（NH4)2 ? S〇4)使蛋白沉淀，隨后在4 °C下以13000rmp離心20分鐘以分離蛋白沉淀物。50mM PIPES緩沖液(pH為7.0)透析12小時(shí)， 得到部分純化的酶。
[0072] 將該部分純化的酶在60°C下熱處理10分鐘后，在4°C下以8000rpm離心20分鐘。將 上清液用50mM的Tris-HCl緩沖液(pH為8.0)進(jìn)行平衡，并使其經(jīng)過(guò)Hi-trap Q離子交換色譜 柱(Amersham Biosciences，烏普薩拉，瑞典)處理。將結(jié)合的蛋白用高達(dá)1.0M的NaCl梯度進(jìn) 行洗脫。之后，測(cè)量該部分的活性，并將活性部分匯集并濃縮。
[0073]通過(guò)Hi-trap Q分離的樣品用10mM磷酸鈉(pH為6.8)緩沖液進(jìn)行平衡，然后負(fù)載到 生物凝膠羥基磷灰石柱(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)上，隨后用10~100mM的磷酸鈉(pH為 6.8)的濃度梯度洗脫。測(cè)試活性后，將活性部分匯集并濃縮。
[0074]此外，將通過(guò)生物凝膠羥基磷灰石柱分離的樣品用含有1.5M硫酸銨的50mM磷酸鈉 (pH為7? 0)進(jìn)行平衡，吸附到Hi-trap苯基柱(Amersham Biosciences，烏普薩拉，瑞典）上， 并用1.5~0M的硫酸銨的梯度進(jìn)行洗脫。
[0075]根據(jù)上述的5步法從粘著劍菌菌株中純化出酶，結(jié)果總結(jié)在表1中。
[0076]每步的純化程度通過(guò)SDS-PAGE評(píng)價(jià)。在20mA的電場(chǎng)下，在12%的聚丙烯酰胺凝膠 上進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果在圖1中示出。在圖1中可以看到，讀取分子量為約30kDa的經(jīng)純化的 感興趣的蛋白（圖1)。在使?jié)舛葹椹? 〇〇4mg/ml的經(jīng)純化的蛋白與50mM D-果糖在55°C下反應(yīng) 10分鐘后，將得到的反應(yīng)混合物通過(guò)HPLC以與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行分析。HPLC(條件 與實(shí)施例1中的相同）的數(shù)據(jù)證明了經(jīng)純化的蛋白具有由D-果糖生產(chǎn)阿洛酮糖的活性。因 此，經(jīng)純化的蛋白具有與D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶(起到將D-果糖轉(zhuǎn)化為阿洛酮糖的作用)相 同的活性。
[0077] 實(shí)施例3:對(duì)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的N-端氨基酸序列的確定
[0078]在E-Mass. Co分析經(jīng)純化的蛋白的N-端氨基酸序列。揭示出了前44個(gè)氨基酸殘基 的序列為:MQGFGVHTSMWTMNWDRPGAERAVAAAVKYAVDFIEIPMLNPPA。使用 BLAST 程序?qū)⒃摪被?序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)進(jìn)行比對(duì)。BLAST搜索表明，經(jīng)純化的蛋白與中華根瘤菌屬 (Sinorhizobium sp?)(費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobium fredii)NGR234)的D-塔格糖差向 異構(gòu)酶(登記號(hào):YP002823363.1)共有約80 %的同源性。
[0079] 實(shí)施例4:D_阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的基因分離
[0080] 4-1.用于擴(kuò)增感興趣的基因的合成引物的設(shè)計(jì)
[0081]為了設(shè)計(jì)在擴(kuò)增編碼具有阿洛酮糖轉(zhuǎn)化活性的蛋白的基因中使用的DNA引物，進(jìn) 行了以下試驗(yàn)。在蛋白BLAST搜索(NCBI)的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)現(xiàn)與實(shí)施例3的粘著劍菌的阿洛 酮糖轉(zhuǎn)化酶的N-端氨基酸序列具有至少80%同源性的酶（登記號(hào)：￥?002823363.1、 YP006398480.1、YP005192599.1、NP437010.1)。鑒定出這些酶在鄰近5'和3'端的區(qū)域中共 同具有分別編碼糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖類激酶的核苷酸序列。
[0082]使用覆蓋分別編碼糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖類激酶的共同位于D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu) 酶基因的鄰近5'和3'端的區(qū)域的基因的DNA片段來(lái)建立編碼全部D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶 的基因的完整DNA序列，其中，編碼糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖類激酶的基因僅用作用于獲得完整 DNA序列的標(biāo)記。
[0083] 基于上述基因，合成了下面的SEQ ID N0:4、5、6和7的引物，用于在擴(kuò)增編碼具有 阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶活性的蛋白的DNA中使用。
[0084] SEQ ID N0:4:5，ACA TGA TCG GCT CCA ATC TC 3，
[0085] SEQ ID N0:5:5'TAT TTG ATG AAG TCG CGT GC 3'
[0086] SEQ ID N0:6:5'GCA CGC GAC TTC ATC AAA TA 3'
[0087] SEQ ID N0:7:5，GGC CGA GAT ACC AGC GCG C 3
[0088] 4-2.通過(guò)對(duì)粘著劍菌來(lái)源的染色體DNA進(jìn)行PCR來(lái)獲取部分編碼阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶 的DNA片段
[0089] 在通過(guò)離心從5mL在實(shí)施例1中制備的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離細(xì)胞群后，將該細(xì)胞群使 用基因組DNA提取試劑盒(Bioneer Co.)，根據(jù)制造商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行DNA提取。用來(lái)自 粘著劍菌(粘著劍菌SYG29;登記號(hào):KCCM11405P)的染色體DNA用作模板，使用合成的DNA引 物對(duì)SEQ ID N0:4和5或SEQ ID N0:6和7通過(guò)PCR擴(kuò)增感興趣的基因。在熱循環(huán)儀(Perkin Elmer. Co.)中進(jìn)行PCR，以94°C持續(xù)1分鐘、50°C持續(xù)1分鐘和72°C持續(xù)1分鐘進(jìn)行30次循環(huán)。 在將2iU的PCR產(chǎn)物加樣到1%瓊脂糖凝膠上后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)量，在約lkb處檢測(cè) 到PCR產(chǎn)物。
[0090] 對(duì)每個(gè)DNA片段進(jìn)行堿基序列測(cè)定鑒定出一部分編碼阿洛酮糖轉(zhuǎn)化酶的多核苷 酸。在鑒定的序列的基礎(chǔ)上，將引物設(shè)計(jì)為含有Ndel和XhoI(SEQ ID N0:8:5'AGA TAT ACA TAT GCA GGG TTT TGG CGT CC 3'；SEQ ID N0:9:5'AAG GCT CGA GGA TCA ATC CGT ATT GCC GGG 3'），并用于對(duì)粘著劍菌菌株的染色體DNA進(jìn)行PCR。在將2yl PCR混合物加樣到瓊 脂糖凝膠上后，通過(guò)在1%瓊脂糖凝膠上電泳，在約〇.9kb處讀取到PCR產(chǎn)物。其序列如SEQ ID N0:2所示。
[0091]堿基序列測(cè)定分析還檢測(cè)出推定啟動(dòng)子序列，如SEQ ID NO: 3所示。
[0092] 4-3.D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因的克隆
[0093]在插入到表達(dá)載體pET21a(Nobagen)的相同限制位點(diǎn)以構(gòu)建新的重組表達(dá)載體 (稱為pET21a/阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(pET-EDPE))之前，將通過(guò)PCR得到的多核苷酸（SEQ ID N0:2)用Ndel和XhoI(NEB)消化(參見(jiàn)圖2)。通過(guò)熱激(Sambrook和Russell:分子克?。?該重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) (invitrogen)中。
[0094]將由此獲得的轉(zhuǎn)化體以104個(gè)CFU/ml的密度接種在5ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基 (Difco)中，之后，在37°C下在以200rpm振蕩的情況下孵育至600nm下的O.D.值為1.5。然后， 將該培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中的200ml的LB-氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中按比例擴(kuò)大，該培養(yǎng)箱保持在 37 °C下，并以200rmp進(jìn)行振蕩。培養(yǎng)物在600nm下的0. D.值達(dá)到0.5時(shí)，用0.1 mM IPTG(異丙 基-0-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)感興趣的酶的過(guò)量表達(dá)。從誘導(dǎo)的時(shí)間開(kāi)始，在以150rpm振蕩 的情況下，將細(xì)胞在16°C下孵育16個(gè)小時(shí)。
[0095]以4000rpm離心20分鐘分離細(xì)胞群。在酶純化中使用之前，將該細(xì)胞群用0.85% (重量/體積)NaCl清洗兩次。
[0096] 實(shí)施例5:D_阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的純化與表征 [0097] 5-1 .D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的純化
[0098] 將實(shí)施例4-3中分離的細(xì)胞群懸于裂解緩沖液(50mM Tris-HCl、300mM NaCl，pH 7.0，10mM咪唑）中，并使用超聲處理器（ColepParmer)在4°C下裂解20分鐘。將裂解物以 13000rpm離心20分鐘，將上清液負(fù)載到用裂解緩沖液預(yù)平衡的Ni-NTA柱（Ni-NTA Superflow，Qiagen)中，隨后按順序用含有20mM咪唑和250mM咪唑的50mM Tris-HCl/300mM NaCl(pH為7.0)進(jìn)行洗脫。將通過(guò)用50mM Tris-HCl/含有250mM的咪唑的300mM NaCl(pH為 7.0)分級(jí)分離獲得的最終洗脫液中存在的蛋白轉(zhuǎn)移到緩沖液中，用于測(cè)量酶活性（50mM PIPES，pH為7.0)。
[0099] 5-2.D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶對(duì)金屬離子的依賴性
[0100] 為了考察實(shí)施例5-1中獲得的D-阿洛酮糖差向異構(gòu)酶對(duì)金屬離子的依賴性，在ImM MgSCk或MnCl2存在的情況下，測(cè)量其活性。
[0101] 關(guān)于酶活性，1單位定義為，在使其與50mM果糖在50mM PIPES(哌嗪-N，N'_雙(2-乙 磺酸））緩沖液(pH為7.0)中在金屬離子的存在下于55°C反應(yīng)時(shí)，催化由D-果糖產(chǎn)生1微摩爾 阿洛酮糖(每分鐘）的酶的量。對(duì)于對(duì)照(無(wú)），未使用金屬離子。
[0102] 通過(guò)使產(chǎn)生的阿洛酮糖的量(mM)除以使用的酶的量和反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算酶活性。通 過(guò)HPLC確定阿洛酮糖的量。HPLC分析使用87C (BI0-RAD)柱進(jìn)行，用水（100 %體積/體積)作 為流動(dòng)相，在80°C下流速為0.6ml/min進(jìn)行展開(kāi)。通過(guò)折射率檢測(cè)器(Agilent 1260TID)檢 測(cè)阿洛酮糖。
[0103]比較在每種金屬離子存在的情況下測(cè)得的酶活性與對(duì)照的酶活性，結(jié)果在圖3中 給出。由圖3的數(shù)據(jù)顯而易見(jiàn)的是，使用錳離子或鎂離子時(shí)，實(shí)施例5-1的酶的活性增加，因 此是依賴于金屬離子的。
[0104] 5-3.溫度和pH對(duì)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的影響
[0105]考察了 pH和溫度對(duì)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的活性的影響。在這方面，使酶與底物 果糖在不同pH值和溫度下進(jìn)行反應(yīng)。
[0106]首先，在反應(yīng)溫度從40 °C變化到70 °C的情況下，測(cè)量pH為7.0時(shí)的酶活性。關(guān)于酶 活性的測(cè)量，參照實(shí)施例5-2的程序。結(jié)果在圖4中給出。如在圖4中可以看到，酶在50~60°C 的溫度下表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)化活性，在55 °C時(shí)達(dá)到最大值。在圖4中，Y軸上的相對(duì)活性表示為對(duì)照 的最大活性的百分比。
[0107] 此外，為了考察pH的影響，在pH為5.0~9.0的Mcilvaine緩沖液或pH為9.0~10.0 的50mM甘氨酸-NaOH緩沖液中反應(yīng)后，測(cè)量55°C時(shí)的酶的活性。結(jié)果在圖5中給出。如在圖5 中可以看到，酶在堿性更強(qiáng)的條件下變得活性更強(qiáng)，在pH為7.5~10.0時(shí)保留有90%或更高 的活性。在這方面，在使0.5單位/ml的酶與50mM D-果糖在上面給出的各個(gè)pH和溫度條件下 反應(yīng)10分鐘，隨后在100°C下加熱5分鐘終止反應(yīng)后，測(cè)量活性。
[0108] 由結(jié)果知道，根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶在很大范圍的溫度和pH下的活 性沒(méi)有太大波動(dòng)，這對(duì)于工業(yè)適用性有利。因此，預(yù)期本發(fā)明的酶在阿洛酮糖的工業(yè)化方面 具有有利的應(yīng)用。
[0109] 5-4.針對(duì)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性的測(cè)定
[0110] 為了考察阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶隨溫度變化的穩(wěn)定性，將在實(shí)施例5-1中純化的 酶在55°C和60°C下熱處理預(yù)定的時(shí)間（8小時(shí)），使0.5單位/ml經(jīng)熱處理的酶與50mM D-果糖 在含有ImM MnCl2的50mM PIPES緩沖液中于pH7.0和55°C下反應(yīng)10分鐘。通過(guò)在100°C下加 熱5分鐘終止反應(yīng)。測(cè)量與熱處理的時(shí)間相應(yīng)的酶活性。
[0111]圖6給出了結(jié)果。如在圖6中可以看到，計(jì)算出在實(shí)施例5-1中純化的酶在55°C和60 °C下的半壽期分別為約22小時(shí)和7小時(shí)。這些數(shù)據(jù)遠(yuǎn)高于以前報(bào)道的大部分阿洛酮糖3-差 向異構(gòu)酶的數(shù)據(jù)，表明對(duì)于在工業(yè)上可能促進(jìn)酶反應(yīng)的溫度，本發(fā)明的阿洛酮糖3-差向異 構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)異。
[0112] 5-5.針對(duì)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定
[0113] 考察在實(shí)施例5-1中純化的粘著劍菌來(lái)源的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶的反應(yīng)速率。為 此，測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0114] 將含有濃度為0.5單位/ml的所述酶和ImM MnCl2的50mM PIPES緩沖液與濃度為10 ~50mM不等的底物果糖一起在pH 7.0和55°C下孵育。通過(guò)在100°C下加熱5分鐘來(lái)終止反 應(yīng)。
[0115] 結(jié)果在圖7中給出。在圖7中，根據(jù)米氏方程(Michaelis-Menten Equation)描述酶 反應(yīng)的速率，其中計(jì)算出km和kcat分別為18.6mM和SSllJmirT1。
[0116] 另外，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶關(guān)于D-果糖的催化效率為135,高 于85(源自根癌土壤桿菌的常規(guī)阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的催化效率）。
[0117] 5-6.通過(guò)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶由D-果糖生產(chǎn)高濃度的阿洛酮糖
[0118] 為了生產(chǎn)高濃度的阿洛酮糖，使在實(shí)施例5-1中純化的0.1~0.5mg/ml的D-阿洛酮 糖3-差向異構(gòu)酶與高濃度的D-果糖(400g/L)在含有ImM MnCl2的50mM PIPES緩沖液(pH為 7.0)中于55°C下反應(yīng)。
[0119] 以與實(shí)施例5-2中相同的方式定量分析產(chǎn)生的阿洛酮糖，以確定從D-果糖到阿洛 酮糖的轉(zhuǎn)化率。由于使用的是高濃度的果糖，因此在HPLC分析之前將在每個(gè)計(jì)劃時(shí)間點(diǎn)取 出的樣品稀釋20倍。
[0120] 結(jié)果在圖8中給出。當(dāng)使用濃度為0.5mg/ml的酶時(shí)，如在圖8中可以看到，阿洛酮糖 的產(chǎn)量達(dá)到118.6g/L，阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為約30 %。
[0121 ]同時(shí)，通過(guò)HPLC測(cè)量由高濃度的D-果糖通過(guò)生物轉(zhuǎn)化得到的阿洛酮糖的生產(chǎn)率， 結(jié)果在圖9中給出。
[0122] 【登記號(hào)】
[0123] 保藏單位:韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心
[0124] 登記號(hào):KCCM11405P
[0125] 保藏日期：2013年3月29日。
[0126] 國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物倮存布達(dá)i佩斯條約 國(guó)際表_格 委托單位：株式會(huì)社三養(yǎng)吉尼克斯 由本頁(yè)底部鑒定的國(guó)際保藏單位依椐 韓國(guó)首爾鐘龍路永濟(jì)洞263號(hào)， 細(xì)則第7.1條發(fā)出的原始存單 郵編110 725
1適用細(xì)則6.4(d財(cái)，該日期為國(guó)際保藏單位的資格取得之日；如果將在布達(dá)佩斯條約 之外所作的保藏在取得國(guó)際保藏單位的資格后轉(zhuǎn)化為根據(jù)布達(dá)佩斯條約做出的保藏，該日 期為該國(guó)際保持單位受理該微生物的日期。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種阿洛酮糖差向異構(gòu)酶，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列。2. -種多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的阿洛酮糖差向異構(gòu)酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。4. 一種重組載體，其攜帶根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸。5. -種重組細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體。6. -種用于生產(chǎn)阿洛酮糖的組合物，包含選自由以下組成的組中的至少一種:包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、編碼所述蛋白的多核苷酸、攜帶所述多核苷酸的重組載體、 含有所述重組載體的重組細(xì)胞、所述重組細(xì)胞的培養(yǎng)物和所述重組細(xì)胞的裂解物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其進(jìn)一步包含選自由以下組成的組中的至少一種:銅 離子、錳離子、鎂離子、鋅離子、鎳離子、鈷離子、鐵離子、鋁離子和鈣離子。8. -種用于生產(chǎn)阿洛酮糖的方法，包括:使選自由以下組成的組中的至少一種與D-果 糖反應(yīng):包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、編碼所述蛋白的多核苷酸、攜帶所述多核 苷酸的重組載體、含有所述重組載體的重組細(xì)胞、所述重組細(xì)胞的培養(yǎng)物和所述重組細(xì)胞 的裂解物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，使用濃度為55~75 % (重量/重量)的所述D-果糖。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述反應(yīng)在pH為7~10下進(jìn)行。11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述反應(yīng)在40~70°C的溫度下進(jìn)行。12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括:添加選自由以下組成的 組中的至少一種:銅離子、錳離子、鎂離子、鋅離子、鎳離子、鈷離子、鐵離子、鋁離子和鈣離 子。13. 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的蛋白、編碼所述蛋白的多核苷酸、攜帶所述多核 苷酸的重組載體或含有所述重組載體的重組細(xì)胞，用于在生產(chǎn)阿洛酮糖中使用。
【文檔編號(hào)】C12N9/90GK105849260SQ201480071143
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年7月4日
【發(fā)明人】韓恩珍, 金慧貞, 安信惠, 田歲希, 樸鐘辰, 李康杓
【申請(qǐng)人】株式會(huì)社三養(yǎng)社