磷酸氯喹的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了磷酸氯喹的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用，本發(fā)明提供的磷酸氯喹的藥物組合物中含有磷酸氯喹和一種從丹參的干燥根莖中分離得到的結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，磷酸氯喹、化合物(Ⅰ)均能提高免疫抑制小鼠的巨噬細胞功能和免疫器官指數(shù)，磷酸氯喹和化合物(Ⅰ)聯(lián)合使用可以進一步提高免疫抑制小鼠的巨噬細胞功能和免疫器官指數(shù)，效果優(yōu)于磷酸氯喹或化合物(Ⅰ)單獨作用效果，可以開發(fā)成提高免疫力的藥物，與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
磷酸氯喹的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及磷酸氯喹的新用途，具體涉及磷酸氯喹的藥物組 合物及其在生物醫(yī)藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 磷酸氯喹為4氨基喹啉類，對瘧原蟲紅細胞內期裂殖體起作用，可能系干擾了瘧原 蟲裂殖體DNA的復制與轉錄過程或阻礙了其內吞作用，從而使蟲體由于缺乏氨基酸而死亡。 用于治療對氯喹敏感的惡性瘧、間日瘧及三日瘧。并可用于瘧疾癥狀的抑制性預防。也可用 于治療腸外阿米巴病、結締組織病、光敏感性疾病(如日曬紅斑)等。
[0003] 迄今為止，尚未見磷酸氯喹及其藥物組合物與增強免疫力的相關性報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸氯喹的藥物組合物，該藥物組合物中含有磷酸氯 喹和一種結構新穎的天然產物，磷酸氯喹和該天然產物可以協(xié)同增強免疫力。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結構式的化合物a)，
[0007]
[0008] -種磷酸氯喹的藥物組合物，包括磷酸氯喹、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0010] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將丹參的干燥根莖粉碎，用85 ~95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的 正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁 醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用8%乙醇洗脫10個柱體積，再用70%乙醇洗脫12個柱體積， 收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用 正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個 組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1、5:1和2:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離， 用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃 縮得到化合物(I)。
[0012] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用90%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0013] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0014]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0015] 上述化合物(I)在制備增強免疫力的藥物中的應用。
[0016] 上述磷酸氯喹的藥物組合物在制備增強免疫力的藥物中的應用。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點：
[0018] 本發(fā)明提供的磷酸氯喹的藥物組合物中含有磷酸氯喹和一種從丹參的干燥根莖 中分離得到的結構新穎的天然產物，磷酸氯喹和該天然產物單獨作用時，具有增強免疫力 作用;二者聯(lián)合作用時，增強免疫力效果進一步提高，可以開發(fā)成增強免疫力的藥物。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。
[0020] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0021] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0022] 分離方法：（a)將丹參的干燥根莖(2kg)粉碎，用90%乙醇熱回流提取(20L X 3次）， 合并提取液，濃縮至無醇味(4L)，依次用石油醚(4LX3次）、乙酸乙酯(4LX3次)和水飽和的 正丁醇(4LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用8%乙醇洗脫10個柱體積，再用70%乙醇 洗脫12個柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70 %乙 醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1 (8個柱體積）、20:1 (8個柱體積）、10:1 (8個柱體積)和5:1(10個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組 分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為8:1(8個柱體積）、5:1(10個柱體積)和2:1(5個 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (208mg，HPLC歸一化純度大于98% )。
[0023] 結構確證:針狀結晶，HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 313.1763,結合核磁特征可得 分子式為C2QH24〇3，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，CDCl 3，500MHz):H-2(2 · 77，m)， H-3a(2.52，m)，H-3b(1.84，dd，J = 7.9,3.5Hz)，H-6(2.37，dd，J=14.7,7.5Hz)，H-7(4.06， d，J = 3.1Hz)，H-8(1.81，dd，J = 5.6,3.1Hz)，H-9(2.07，m)，H-10(2.93，dd，J=ll .4， 2.2Hz)，H-12(6.07，d，J = 10.5Hz)，H-13(6.62，dd，J=10.5,6.6Hz)，H-14(2.84，dd，J = 5.6,6.6Hz)，H-16a(4.78，s)，H-16b(4.74，s)，H-17(1.66，s)，H-18a(4.83，s)H-18b(4.47， 8)，!1-19(1.25，(1，了 = 7.3泡），!1-20(1.22，(1，了 = 7.8抱）；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。（卯111，〇0(：13， 125MHz):210.1(C，1-C)，40.2(CH，2-C)，33.4(CH2,3-C)，84.6(C，4-C)，216.9(C，5-C)，43.2 (CH，6-C)，82.3(CH，7-C)，47.2(CH，8-C)，41.3(CH，9-C)，55.2(CH，10-C)，144.6(C，11-C)， 127.5(CH，12-C)，135.7(CH，13-C)，49.3(CH，14-C)，143.8(C，15-C)，114.8(CH 2，16-C)， 18.3(CH3，17-C)，111.7(CH2，18-C)，14.6(CH3，19-C)，16.2(CH 3,20-C)。紅外波譜表明該化 合物含有羰基（1735cm-1與1675cm-4和烯烴（1632cm-4基團。 13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示 有20個碳信號，包括三個甲基，三個亞甲基(兩個烯烴碳），九個次甲基(一個含氧碳和兩個 烯烴碳），以及五個季碳(兩個羰基碳、一個連氧碳和兩個烯烴碳），以上功能結構再結合不 飽和數(shù)表明該化合物為四環(huán)結構。 1H-NMR譜結合HSQC譜顯示三個甲基質子信號δΗ 1.66 (3H， 8)、1.25(3!1，(1，1 = 7.3!^)、1.22(3!1，(1，1 = 7.8!^)，一組亞甲基質子信號5[1252(1!1，111)與 1.84(1!1，(1(1，1 = 7.9,3.5抱），兩組端烯烴質子信號5114.78(1!1，8)與4.74(1!1，8)、4.83(1!1， s)與4.47(lH，s)，一對烯烴質子信號δΗ 6.07(1!1，(1，1=10.5!^)與6.62(1!1，(1(1，1=10.5， 6.6Hz)，一個連氧次甲基質子信號δ Η 4.06(1Η，d，J = 3. IHz)。1H-1H COSY譜中存在H-12/Η-13/H-14/H-8/H-7/H-6/H3-20、H-8/H-9/H-10 以及 H2-3/H-2/H3-19 相關信號，同時 HMBC 譜中 顯示有 H2-3 與 C-l、C-2、C-5 和 C-10，H-7 與 C-4、C-5、C-9 和 C-20，H2-16 與 C-14，H3-17 與 C-14、 C-15 和 C-16，H2-18 與 C-9、C-11 和 C-12，H3-19 與 C-l、C-2 和 C-3，H3-20 與 C-5、C-6 和 C-7 相關信 號，通過上述NMR譜中的相關信息可以構建該化合物的連接方式，并且可以確定該化合物為 !1^1]111〇;^13116型二砲類化合物。通過!1-12與!1-13的偶合常數(shù)1=10.2以及碳化學位移5(； 129.5與137.2可知C-12和C-13之間為雙鍵。HMBC譜中H-7與C-4、C-5、C-9和C-20的相關信號 與 1H-1H COSY譜中H-9/H-10以及H-8/H-7相關信號可確證C-4和C-7連氧橋環(huán)的存在。ROESY 譜中，H-7 與 Me-20、Me-17 和 H-8，H-8 與 H-10，H-9 與 H-14 的相關性表明 H-7、H-8、H-10 和 Me-20 為β構型，H-9和H-14為α構型。此外，通過查閱文獻(Naengchomnong et al. ,1986)對比碳化 學位移可知Me-19構型應該為β構型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻關于相關 類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值 與實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0024]
[0025] 實施例2:藥理作用 [0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1動物
[0028] 清潔級昆明種小白鼠 120只，體重20±2g，雌雄各半，四川農業(yè)大學實驗動物中心 提供。
[0029] 1.2試劑與樣品
[0030] 磷酸氯喹購自中國食品藥品檢定研究院。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。環(huán) 磷酰胺（cyclophosphamide，CTX)(江蘇恒瑞），黃芪多糖(APS，江蘇華東貝爾生物藥業(yè)），臺 盼藍（Sigma)，RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclon)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma)，脂多糖（LPS，Sigma)， MTT(Sigma)，二甲亞砜(DMSO)，pH7.2roS，5%雞紅細胞(CRBC)，豚鼠血清（廣州蕊特生物）， 小鼠細胞因子IL-2, IL-4和IFN- γ 檢測試劑盒(BOSTER)，CD3+(FITC Hamster anti-mouse) 單克隆抗體，CD4+(PE rat anti-mouse)單克隆抗體，CD8+(PerCP rat anti-mouse)單克隆 抗體（BOSTER)，溶血素 （Versalyse ? Lysing Solution)。
[0031] 1.3儀器
[0032] 紫外可見光分光光度計（上海精密科學儀器），流式細胞儀（BD FACSCcalibur TM)，超凈工作臺（AIRTECH)，倒置顯微鏡(Motic)，離心機(Thermo)，酶聯(lián)免疫檢測儀(BIORAD )， CO2 培養(yǎng)箱 (Thermo) 。
[0033] 1.4動物分組及處理
[0034]將60只健康小鼠隨機分空白組、模型組、陽性組、磷酸氯喹組、化合物（I)組、磷酸 氯喹與化合物（I)組合物組，每組10只。空白組和模型組每天腹腔注射生理鹽水0.2ml、陽性 組每天腹腔注射20g · !/1APS 0.2ml，磷酸氯喹組、化合物（I)組、磷酸氯喹與化合物（I)組合 物組分別每天腹腔注射磷酸氯喹20g · I/1、化合物（I)20g · Γ1、磷酸氯喹與化合物（I)組合 物【磷酸氯喹20g · L-4化合物（I)20g · L-1】0.21111，連續(xù)7(1;給藥后(15~7，除空白對照組外 其余各組每天腹腔注射CTX IOOmg .kg^1。
[0035] 1.5腹腔巨噬細胞功能及免疫器官指數(shù)檢測
[0036] 按"1.4"處理，各組分別于給藥后d7稱重，并腹腔射5 %雞紅細胞0.5ml，8h后處死 小鼠，腹腔注入PBS 2ml，輕揉小鼠腹部Imin，吸取腹腔液體0.5ml于載玻片上在37 °C孵育 30min，1:1丙酮-甲醇液固定5min，Giemsa染色，每張涂片油鏡下計數(shù)200個巨細胞，按以 下公式計算吞噬率和吞噬指數(shù)：
[0037] 吞噬率/% = (吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/200個巨噬細胞數(shù)）X 100% ;
[0038] 吞噬指數(shù)=(被吞噬的雞紅細胞總數(shù)/200個巨噬細胞數(shù)）+2。
[0039] 另取各組小鼠脾和胸腺稱重，按以下公式計算：
[0040] 脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g);
[0041] 胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg) /體重(g)。
[0042] 1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
[0043]采用SPSS 19.0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，方差分析組間差異。
[0044] 2、實驗結果
[0045] 2.1對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞功能和免疫器官指數(shù)的影響
[0046]與空白組比較，模型組的各項指標均明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，陽性組 的黃芪多糖(APS)、磷酸氯喹組、化合物（I)組均能明顯提高吞噬率和吞噬指數(shù)(P<0.05); 與模型組相比，磷酸氯喹與化合物（I)組合物組小鼠的吞噬率、吞噬指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺 指數(shù)均明顯升高(P<〇. 01)。結果見表1。
[0047]表1對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞功能和免疫器官指數(shù)的影響
L0049」上還結采表明，憐酸鼠哩、化合物U)均能提咼免投抑制小鼠的&嚜細胞功能和免 疫器官指數(shù)，磷酸氯喹和化合物（I)聯(lián)合使用可以進一步提高免疫抑制小鼠的巨噬細胞功 能和免疫器官指數(shù)，效果優(yōu)于磷酸氯喹或化合物（I)單獨作用效果，可以開發(fā)成提高免疫力 的藥物，與現(xiàn)有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
[0050]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物α)，〇2. -種磷酸氯喹的藥物組合物，其特征在于:包括磷酸氯喹、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權利要求2所述的磷酸氯喹的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權利要求2所述的磷酸氯喹的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將丹 參的干燥根莖粉碎，用85~95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用8%乙醇洗脫10個柱體積，再用 70%乙醇洗脫12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b) 中70 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為40:1、20:1、10:1和5:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比 為8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基 硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱 體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用90%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備增強免疫力的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的磷酸氯喹的藥物組合物在制備增強免疫力的藥物中的應 用。
【文檔編號】A61K31/4706GK105859740SQ201610292150
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】周飛燕
【申請人】周飛燕