核桃青皮中一種新的酚苷化合物的制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及從核桃楸（Juglans mandshurica Maxim）的青果皮中提取分離得到具有體外抗腫瘤活性的一種新的酚苷化合物及其制備方法。本發(fā)明方法以核桃青皮為原料，經過醇提，大孔樹脂富集純化，硅膠柱層析和凝膠柱層析，再結合制備HPLC純化得到了一種新的酚苷化合物4?羥基苯丙酮?4?O?β?D?吡喃葡萄糖基(1→6)?β?D?吡喃葡萄糖苷[4?hydroxypropiophenone?4?O?β?D?glucopyranosyl (1→6)?β?D?glucopyranoside]。本發(fā)明所涉及的原料容易大量獲取，且該新化合物經實驗證實對胃癌、肝癌和乳腺癌等細胞均具有較好的抑制作用。
【專利說明】
核桃青皮中一種新的酚苷化合物的制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種具有癌細胞抑制作用的新化合物的制備 方法和在制備治療腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命的一類疾病，世界衛(wèi)生組織(WHO)專家預測，至2020 年全球人口將達80億癌癥新發(fā)病例將達到2000萬，將有1200萬人死于癌癥。癌癥已成為危 及人類健康的主要殺手。目前為止，腫瘤的常用化療的治療方法就是使用抗腫瘤的化學藥 品對腫瘤患者進行治療，該法對原發(fā)灶，轉移灶和亞臨床轉移灶均有治療作用，但缺點也是 十分明顯的，如對細胞無特異性，有強大的毒副作用，產生抗藥性等。所以從理論上講，化療 不能殺滅體內所有的腫瘤細胞，患者體內總會有殘存腫瘤細胞，是其復發(fā)，轉移的根源。因 此開發(fā)新的優(yōu)效藥物來滿足臨床治療的需要是擺在醫(yī)藥工作者面前一項十分迫切的任務。
[0003] 經大量的臨床報道證實，青龍衣對食道癌胃癌、肝癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤有 非常明顯的抑制作用，能緩解腫瘤病人的臨床癥狀，減輕其痛苦。但目前對其產生抗腫瘤作 用藥效物質基礎的確定意見尚不一致，亟待構建青龍衣活性成分分子庫。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，擴大治療腫瘤藥物的資源、來源，提供一種新 的具有腫瘤細胞抑制作用的化合物。
[0005] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供了4-羥基苯丙酮-4-〇-i3_D-吡喃葡萄糖基（1-6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，其結構式如下：
[0006] 本發(fā)明還提供了 4-羥基苯丙酮-4_(H3-D-吡喃葡萄糖基（1-6)-?Η)-吡喃葡萄糖 苷的制備方法：以核桃青皮為原料，依次通過醇提、柱層析制備得到。
[0007] 上述柱層析依次包括大孔樹脂柱、正相硅膠柱、葡聚糖凝膠柱和制備HPLC。
[0008] 本發(fā)明4-羥基苯丙酮-4-0-?Η)-吡喃葡萄糖基（1-6)-?Η)-吡喃葡萄糖苷具體制 備步驟如下： (1)醇提:將核桃青皮(來源為核桃楸Juglans mandshurica Maxim的青果皮)鮮品低溫 40°C烘干，得到的5kg干燥品為原料，采用乙醇回流提取3次，分別為，第1次用30L 60%乙醇 提取2.5h，第2次25L 60%乙醇提取2h，第3次用20L 60%乙醇提取2h，過濾，合并3次濾液，減 壓回收溶劑，減壓干燥，得干膏狀提取物； (2) 富集純化:將上述步驟（1)中醇提所得干膏狀提取物用水分散至相對密度為1.30土 0.05的溶液，經AB-8型大孔樹脂柱色譜富集純化，分別以水、20%乙醇、30%乙醇依次洗脫，收 集30%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑得30%乙醇洗脫部分； (3) 正相硅膠柱分離:將上述步驟(2)中所得30%乙醇洗脫部分進行正相硅膠柱色譜分 離，分別以體積配比為8:1、3:1、1:1、和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度淋洗，每一個比 例淋洗3.5個柱體積，將其中二氯甲烷-甲醇體積配比為3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶劑洗脫 部分減壓回收溶劑得到分離產物； (4) 葡聚糖凝膠柱分離:取經上述步驟(3)分離后的產物，通過葡聚糖凝膠柱，以甲醇： 水=2:3(V/V)洗脫3個柱體積，棄去第一個柱體積洗脫液。收集后面兩個柱體積洗脫液，回收 溶劑，得粗品； (5) 制備HPLC分離:將上述步驟(4)中所得粗品采用甲醇溶解進入制備型HPLC，流動相 為體積比為32 : 68的甲醇和水混合溶液，洗脫流速為3mL/min，保留時間tR=22.6min~ 22.Smin階段內收集餾分后，回收干燥即得。
[0009] 本發(fā)明還提供了 4-羥基苯丙酮-4_(H3-D-吡喃葡萄糖基（1-6)-?Η)-吡喃葡萄糖 苷在制備預防和治療腫瘤藥物方面的應用。優(yōu)選為在制備預防和治療人胃癌、肝癌和乳腺 癌藥物方面的應用。
[0010] 迄今為止以上研究成果尚未有專利或文獻報道。
[0011] 本發(fā)明的有益效果和意義在于:采用的原料為核桃外殼的青衣，通常被當做廢物 拋棄，以此為原料進行化合物提取，能充分利用該植物資源;此外，本研究對核桃青皮進行 深入成分研究開發(fā)，尋找到具有獨特化學結構且活性較強的化合物，為臨床研究提供了新 型抗腫瘤藥物。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明化合物的化學結構式； 圖2為本發(fā)明化合物的正性HR-ESI-MS譜圖； 圖3為本發(fā)明化合物的1H-NMR譜圖； 圖4為本發(fā)明化合物的13C-NMR譜圖； 圖5為本發(fā)明化合物的DEPT譜圖； 圖6為本發(fā)明化合物的HSQC譜圖； 圖7為本發(fā)明化合物的HMBC譜圖。
【具體實施方式】
[0013] 根據本發(fā)明所公開的技術內容，本領域技術人員很清楚本發(fā)明的其他實施方案， 下述實施方案僅作示例。在不違反本發(fā)明主旨及范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種調整 和改進。這些變化應在本發(fā)明的保護范圍內。下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0014] 實施案例一本發(fā)明化合物的制備方法： (1)醇提:將核桃青皮(來源為核桃楸Juglans mandshurica Maxim的青果皮)鮮品低溫 40°C烘干，得到的5kg干燥品為原料，采用乙醇回流提取3次，分別為，第1次用30L 60%乙醇 提取2.5h，第2次25L 60%乙醇提取2h，第3次用20L 60%乙醇提取2h，過濾，合并3次濾液，減 壓回收溶劑，減壓干燥，得干膏狀提取物311g; (2) 富集純化:將上述步驟（1)中醇提所得干膏狀提取物用水分散至相對密度為1.30土 0.05的溶液，經AB-8型大孔樹脂柱色譜富集純化(色譜柱內徑6cm長1.30m，其中樹脂有效高 度0.95m)，分別以水、20%乙醇、30%乙醇依次洗脫，收集30%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑得30% 乙醇洗脫部分22.5g; (3) 正相硅膠柱分離:將上述步驟(2)中所得30%乙醇洗脫部分采用正相硅膠柱(色譜柱 內徑3cm長1.5m，其中硅膠有效高度1.0 m)，依次采用二氯甲烷-甲醇(8:1，V/V，3.5柱體積） -二氯甲烷-甲醇(3:1，V/V，3.5柱體積)-二氯甲烷-甲醇（1:1，V/V，3.5柱體積)-甲醇溶 液(3.5個柱體積)進行系統(tǒng)梯度洗脫，將其中二氯甲烷-甲醇體積配比為3:1的二氯甲烷-甲 醇混合溶劑洗脫部分減壓回收溶劑至干，稱重0.98 g; (4) 葡聚糖凝膠柱分離:取經上述步驟(3)正相硅膠分離后的產物，通過葡聚糖凝膠柱 (內徑1.5cm，柱長1.5m)，以甲醇:水=2:3 (V/V)洗脫3個柱體積，棄去第一個柱體積洗脫液。 收集后面兩個柱體積洗脫液，回收溶劑，得粗品0.22g; (5 )制備HPLC分離:將上述步驟(4 )中所得粗品進一步以制備型HPLC制備(1&七6^515_ 2414,SunFire? Prep C18,250 mmXlO mm i · d ·，5μηι)，以流動相為體積比為 32:68 的甲醇 和水混合溶液，洗脫流速為3mL/min，保留時間tR=22.6min~22.8min階段內收集餾分后，回 收干燥即得純品11.5mg。
[0015]實施案例二本發(fā)明化合物的表征： 本發(fā)明化合物為白色無定形粉末，易溶于甲醇。在UV光譜(MeOH)中256nm處呈現最大吸 收。正性HR-ESI-MS譜中，在m/z 475.1865處可見[M+H]+離子峰，表明本發(fā)明化合物的分子 量為474。結合1H-NMR、 13C-NMR及DEPT譜等波譜數據推測本發(fā)明化合物分子式為C21H3qO 12，計 算其不飽和度為7。其具體波譜數據見表1。
[0016] 效果實施例 MTT(四唑鹽)法測定4-羥基苯丙酮-4-(H3-D-吡喃葡萄糖基（1-6)-?Η)-吡喃葡萄糖苷 對人腫瘤細胞的殺傷作用。
[0017] (1)腫瘤細胞:人胃癌BGC-823細胞、人肝癌HepG-2細胞和人乳腺癌MCF-7細胞。
[0018] (2)實驗具體操作方法:腫瘤細胞在培養(yǎng)于DMEM基質中（含有10% L-谷氨酰胺的胎 牛血清，100 yg ^mIT1盤尼西林，100 yg ^mIT1鏈霉素）。取處于對數生長期的腫瘤細胞，加 入0.25%胰蛋白酶消化，以濃度為10 X IO4個ml/1，取180 yL的細胞懸液置于96孔板中，每組 均設3個平行孔，另設空白孔和對照孔，空白孔未接種細胞，對照孔為不含藥物的培養(yǎng)液。于 37°C、5%C〇2條件下培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中加入待測樣品（樣品溶解于DMSO中，用培養(yǎng)基逐 步稀釋，加入細胞中藥液的DMSO終濃度< 1%)，使藥物終濃度為0、10、30、50、70、90 μΜ。溶液 繼續(xù)在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)48h。每孔加入20 yL MTT溶液（5 mg/mL，溶解于 PBS中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)。小心吸棄上清液，每孔加入150 yL DMSO,搖床上震蕩 lOmin，使結晶物完全充分溶解。用酶標儀在570nm處測每孔的吸光值(A)，計算出細胞存活 抑制率:細胞存活抑制率%=[ 1-(實驗組A-空白組A)八對照組A-空白組A)] X 100%。數據使用 SPSS軟件分析系統(tǒng)進行處理。
[0019] (3)實驗結果:不同濃度該新化合物對腫瘤細胞的存活抑制率實驗數據見表2。結 果表明，新化合物對上述腫瘤細胞均有較好的生長抑制作用，對人胃癌BGC-823細胞、人肝 癌H印G-2細胞和人乳腺癌MCF-7的IC 5Q分別為28.15 μΜ和22.64 μΜ及35.62 μΜ。
[0020] 綜上所述，本發(fā)明所述的從青龍衣中分離得到的酚苷化合物4-羥基苯丙酮-4-0-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-?Η)-吡喃葡萄糖苷具有制備臨床腫瘤治療藥物的前景。
【主權項】
1. 一種酚苷化合物，其特征在于，其結構式如式(I)所示：2. 權利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 醇提:將核桃青皮(來源為核桃楸Juglans mandshurica Maxim的青果皮)鮮品低溫 40°C烘干，得到的5kg干燥品為原料，采用乙醇回流提取3次，分別為，第1次用30L 60%乙醇 提取2.5h，第2次25L 60%乙醇提取2h，第3次用20L 60%乙醇提取2h，過濾，合并3次濾液，減 壓回收溶劑，減壓干燥，得干膏狀提取物； (2) 富集純化:將上述步驟（1)中醇提所得干膏狀提取物用水分散至相對密度為1.30土 0.05的溶液，經AB-8型大孔樹脂柱色譜富集純化，分別以水、20%乙醇、30%乙醇依次洗脫，收 集30%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑得30%乙醇洗脫部分； (3) 正相硅膠柱分離：將上述步驟（2)中所得30%乙醇洗脫部分進行正相硅膠柱色譜分 離，分別以體積配比為8:1、3:1、1:1、和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶劑梯度淋洗，每一個比 例淋洗3.5個柱體積，將其中二氯甲烷-甲醇體積配比為3:1的二氯甲烷-甲醇混合溶劑洗脫 部分減壓回收溶劑得到分離產物； (4) 葡聚糖凝膠柱分離:取經上述步驟(3)分離后的產物，通過葡聚糖凝膠柱，以甲醇： 水=2:3(V/V)洗脫3個柱體積，棄去第一個柱體積洗脫液;收集后面兩個柱體積洗脫液，回收 溶劑，得粗品； (5) 制備HPLC分離:將上述步驟(4)中所得粗品采用甲醇溶解進入制備型HPLC，流動相 為體積比為32 : 68的甲醇和水混合溶液，洗脫流速為3mL/min，保留時間tR=22.6min~ 22.8min階段內收集餾分后，回收干燥即得。3. 權利要求1所述酚苷化合物，4-羥基苯丙酮-4-〇-i3-D-吡喃葡萄糖基（l-6)-i3-D-吡 喃葡萄糖苷在制備抗腫瘤藥物方面的應用。4. 根據權利要求3所述的4-羥基苯丙酮-4-(H3-D-吡喃葡萄糖基（1-6)-?Η)-吡喃葡萄 糖苷在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于:所述的腫瘤為人胃癌腫瘤、人肝癌腫瘤或人 乳腺癌腫瘤。
【文檔編號】A61P35/00GK105859805SQ201610296216
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月8日
【發(fā)明人】周媛媛, 武斌, 付起鳳
【申請人】黑龍江中醫(yī)藥大學