一類螺甾類化合物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一類螺甾類化合物及其應(yīng)用。所述螺甾類化合物從開(kāi)口箭根莖中提取分離得到，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明獲得的9種螺甾皂苷類化合物在防治癌癥、抗炎方面具有很好的作用，對(duì)咽鱗癌、咽頭癌、鼻咽鱗癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌等都具有一定的抑制作用。說(shuō)明本發(fā)明螺甾類化合物具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)為新的抗癌藥物及保健食品。
【專利說(shuō)明】
一類螺甾類化合物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及螺留類化合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是人體器官組織的細(xì)胞在外來(lái)和內(nèi)在有害因素的長(zhǎng)期作用下所產(chǎn)生的一種 以細(xì)胞過(guò)度增殖為主要特點(diǎn)的新生物，在醫(yī)學(xué)上可分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類。良性 腫瘤對(duì)人體健康影響較小，而惡性腫瘤(又稱癌癥)則嚴(yán)重威脅著人類的健康。根據(jù)世界衛(wèi) 生組織和美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，癌癥已成為人類死亡的首要病因，2008年全世界 約有1270萬(wàn)新診斷癌癥病例和760萬(wàn)癌癥死亡病例（約占所有死亡人數(shù)的13%)，且大約有 70%的癌癥死亡病例發(fā)生在中低收入國(guó)家。預(yù)計(jì)到2030年，癌癥年診斷和死亡病例將分別 尚達(dá)2140萬(wàn)和1320萬(wàn)。
[0003] 天然藥物尤其是來(lái)源于植物的藥物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性多樣性，一直 是人類預(yù)防和治療疾病的主要來(lái)源。臨床上應(yīng)用的許多藥物都直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn) 物，天然產(chǎn)物不僅可以作為藥物半合成的前體物，而且可以作為藥物化學(xué)合成的的模板，為 新藥設(shè)計(jì)提供新思路。天然產(chǎn)物已成為發(fā)現(xiàn)新藥物或先導(dǎo)化合物的主要源泉之一。
[0004] 開(kāi)口箭（Tupistra Chinensis)為百合科（Liliaceae)鈴蘭族（Convallarieae)開(kāi) 口箭屬(Tupistra)植物。主要分布于我國(guó)中部和西南部，主產(chǎn)于湖北三峽庫(kù)區(qū)及神龍架林 區(qū)。開(kāi)口箭在土家族醫(yī)藥中享有極高聲譽(yù)，為神農(nóng)架四大名藥之一藥用部位為其根狀莖。開(kāi) 口箭味甘微苦，性寒，具有清熱解毒、益氣活血、散瘀止痛等多種功效，民間用于咽喉腫痛、 勞熱咳嗽、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)等癥。使用方便，療效顯著，已有數(shù)百年的應(yīng)用歷 史。臨床上，開(kāi)口箭飲片治療慢性咽炎效果良好。
[0005] 開(kāi)口箭根莖的主要活性成分為留體皂苷類成分?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明開(kāi)口箭具 有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗炎、抑菌等活性?，F(xiàn)有研究對(duì)開(kāi)口箭化學(xué)成分研究仍不夠徹底，因而開(kāi) 口箭中留體類化學(xué)成分值得進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一類螺留類化合物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供螺留類化合物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0009] 螺留類化合物，其結(jié)構(gòu)式分別為：
[0010] 化合物1:
[001^
[001 ? [001 d
[0017] 上述螺留類化合物在制備防治癌癥藥物中的應(yīng)用。
[0018] 進(jìn)一步的，上述癌癥為咽鱗癌、咽頭癌、鼻咽鱗癌、肝癌、慢性骨髓性白血病、肺腺 癌。
[0019] 上述螺留類化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：
[0021] 本發(fā)明通過(guò)長(zhǎng)期研究，從開(kāi)口箭根莖中分離鑒定了一類新型螺留類化合物1~9。 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)該化合物1~9在防治癌癥、抗炎方面具有很好的作用。該類化合物從植物中 提取獲得，具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)為新的抗癌藥物及保健食品。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明化合物(50μΜ)對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用；
[0023]圖2為本發(fā)明化合物（50μΜ)對(duì)Raw 264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO的抑制作用；ctl-: 空白對(duì)照;ct 1+:模型組;*p〈0.05。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0025] 實(shí)施例1螺留類化合物的提取及鑒定
[0026] -、螺甾類化合物的提取
[0027]取開(kāi)口箭根莖17kg，用60%乙醇加熱回流提取4次，每次4小時(shí)，合并提取液減壓回 收溶劑，得總浸膏，將總浸膏用水混懸，用乙酸乙酯等體積萃取4次，除去脂溶性雜質(zhì)，水層 經(jīng)DlOl大孔樹(shù)脂柱層析分離，分別以水、20%乙醇，60%乙醇，80%乙醇、95%乙醇進(jìn)行洗 脫，得到5個(gè)餾分TA、TB、TC、TD、TE(J取餾分TC(60%乙醇洗脫部分）200g，采用硅膠柱色譜、 ODS中低壓柱色譜、反相高效液相色譜等分離方法，分離得到本發(fā)明化合物1和2。采用同樣 的分離手段從餾分TD(80%乙醇洗脫部分）中分離得到本發(fā)明化合物3-9。通過(guò)理化常數(shù)和 現(xiàn)代波譜學(xué)手段（HRESIMS，1D-匪R，2D-NMR)鑒定以上9個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，化合物1為 8卩;11'〇8卜25(27)-611-10，3€[，50-奸;!_01，化合物2為8卩;!_1'08卜25(27)-611-10，3€[，40，50，60-pentol，化合物3為50-spirost-25(27)-en-30-0l-3-0-0-D-glucopyranosyl-( l-4)-0-D-&111。0卩7^1081(16，化合物4為50-8卩;!_1'08七-25(27)-611-10，30-(1;!_01-3-0-0-0-呂111。0卩7從110871-(144)-0-0-8111。0卩7『&11081(16，化合物5為（2510-50-8卩;!_1'08七&11-10，30-diol-3-0-0-D-glucopyranosyl_( l-6)-0-D-glucopyranoside，化合物6為（25Ι0-5β-sp iros tan-1β, 3β-?? 0 l-3-0-0-D-f rue tofuranosy 1-(2^6)-β-D-glucopyranos ide 物7 為 8卩;!_1'08卜25(27)-611-10，20，30，50-七6奸&01-5-0-0-0-8111。0卩7『&11081(16，化合物8為 spirost-25(27)-en-10，20，30，4P，50-pentol-2-0-0-D-xylopyranoside，化合物 9為 spirost-25(27)-en-10，20，30，4P，50-pentol-2-0-a-L-arabinopyranoside D 所獲得的化 合物1~9的結(jié)構(gòu)以表1所示的結(jié)構(gòu)式為準(zhǔn)。
[0028] 表1本發(fā)明9個(gè)螺甾類化合物的結(jié)構(gòu)


[0032]二、螺留類化合物的鑒定 [0033]化合物1-9的結(jié)構(gòu)鑒定過(guò)程如下：
[0034]化合物1的鑒定
[0035] spirost-25(27)-en-10，3a，50-triol(化合物 1):白色無(wú)定形粉末， [α]"'-19: φ 0.2Q，'MeOH)，在I R ( KBr )中顯示出強(qiáng)的多羥基的吸收峰3 3 0 0 cm-1，對(duì) Anisaldehyde (A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)Ehrl ish(E試劑)不顯色，提示該化合物為螺留類化合 物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 447.3112(calcd.for C27H43O5 447.3110)，提示其分子量為446，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C 27H42O5。
[0036] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)譜中，高場(chǎng)區(qū)給出三個(gè)特征的甲基信號(hào)δ〇·87(3Η， 8，]^-18)、1.50(3!1，8，]^-19)及1.12(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低場(chǎng)區(qū)給出兩個(gè)末端雙鍵 上的質(zhì)子信號(hào) S4.83(lH，brs)和 4.80(lH，brs)。
[0037] 13C-NMRd 26MHz，pyridine-d5)給出27個(gè)碳信號(hào)，提示該化合物為螺留皂苷元。其 中δ 109.8為螺留皂苷C-22特征信號(hào)，δ 144.8和109.1為25和27位末端雙鍵的特征信號(hào)，在糖 端基碳區(qū)未見(jiàn)糖端基碳信號(hào)，說(shuō)明該化合物為留體皂苷元。比較該化合物與化合物（25R， S)-spirostan_10，3a，50-triol的碳譜數(shù)據(jù)，A、B、C、D、E環(huán)數(shù)據(jù)基本一致，僅F環(huán)數(shù)據(jù)有差 異，推測(cè)可能是該化合物的25位與27位碳形成末端雙鍵的緣故。在HMBC譜中，兩個(gè)末端雙鍵 上的質(zhì)子信號(hào) S4.83(lH，brs)和 4.80(lH，brs)與 024(δ29.3)和(：-26(δ65.4)相關(guān)，也證明 25(27)位雙鍵的存在。綜合以上信息，化合物1鑒定為叩化 〇8卜25(27)-的-10，3€[，50-triol。通過(guò)HSQC、HMBC和1H- 1H⑶SY譜可對(duì)化合物1的核磁信號(hào)進(jìn)行完全歸屬，化合物1的 1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0038]化合物2的鑒定
[0039] spirost-25 (27 )_θη_1β，3α，4β，5β，60-pentol (化合物2):白色無(wú)定形粉末， [ajit -34,9 (c' 0.25, MeOH),紅外譜圖中顯不強(qiáng)的多羥基吸收峰3398cm-S對(duì)Anisaldehyde (A試劑）反應(yīng)顯黃色，對(duì)EhrI ish(E試劑）不顯色，提示該化合物為螺甾類化合物。HRESMS (positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 479.3018(calcd.for C27H43O7 479.3009)，提不 其分子量為478,結(jié)合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C2 7H42〇7。
[0040]通過(guò)對(duì)化合物2的1H-NMR、13C-NMR(DEPT)、HSQC、HMBC和 1H-1H COSY和NOESY譜的分 析可以對(duì)其分子中的碳及氫信號(hào)進(jìn)行全面歸屬。其1H-匪R譜給出三個(gè)特征的甲基信號(hào)δ 0.87(3H，s，Me-18)、1.86(3H，s，Me-19)和1.10(3!1，(1，了 = 7.0抱，]^-21);在低場(chǎng)區(qū)給出兩個(gè) 末端雙鍵上的質(zhì)子信號(hào)δ4.81 (lH，s)和4.78(lH，s) ,3C-NMR(WeMHzdyridine-Cl5)顯示出 27個(gè)碳信號(hào)，在糖端基碳信號(hào)區(qū)沒(méi)有出現(xiàn)糖端基碳信號(hào)，說(shuō)明化合物2是一個(gè)留體皂苷元。 其中δ1〇9.8為螺留皂苷C-22特征信號(hào)，δ144.8和109.1為25和27位末端雙鍵的特征信號(hào)。 [0041 ] 在1H-1H COSY譜中，兩個(gè)亞甲基質(zhì)子δ2.23(Η-2α)和2.62(H-2f〇與連氧次甲基質(zhì)子 δ4.19(Η-1)和4.85(H-3)相關(guān)，而連氧次甲基質(zhì)子δ4.85(Η-3)與另一個(gè)連氧次甲基質(zhì)子δ 4.34(Η-4)相關(guān)，連氧次甲基質(zhì)子δ4.95(Η-6)與兩個(gè)亞甲基質(zhì)子δ1.55(Η-7α)和2.07(H-7f〇 相關(guān)。此外，在 1H-NMR譜低場(chǎng)區(qū)存在一個(gè)尖銳單峰質(zhì)子信號(hào)δ6.00,由于該質(zhì)子與C-4、C-5、 C-6和C-IO分別具有HMBC相關(guān)，可以將該質(zhì)子歸屬為C-5上連接的羥基質(zhì)子。通過(guò)以上分析， 可以確定該化合物含有5個(gè)羥基基團(tuán)，分別連接在C-I、C-3、C-4、C-5和C-6位。
[0042] 化合物2的相對(duì)構(gòu)型可以通過(guò)NOESY譜得以確定。在NOESY譜中，Η-4α與Η-7α和Η-9 α 相關(guān)，Η_2α與Η_9α相關(guān)，說(shuō)明Α、Β環(huán)是順式相連，因而C-4和C-5羥基為β構(gòu)型。另外，Η_1α與Me-19和H-11相關(guān)，H-3fs與H-2fs相關(guān)，Η-6α與Η-7α相關(guān)，表明C-I和C-6羥基為β構(gòu)型，C-3羥基為α 構(gòu)型。綜合以上信息，化合物2鑒定為spirost-25(27)-en-10，3a，40，50，60-pentol。化合物 2的 1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，化合物2的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0043]化合物3的鑒定
[0044] 50-spirost-25(27) -θη_3β-。l-3-〇-0-D-glucopyranosy 1- (1 - 4) -β-D-glucopyranoside(化合物3):白色無(wú)定形粉末，[a]it-30.6 (r 0.15, McOH) JtAnisaldehyde (A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)EhrlisME試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖，提示該化合物為螺 留阜苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 739.4254(calcd.for C39H63O13 739.4269)，提示其分子量為738，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為 C39H62〇13o
[0045] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)譜中，高場(chǎng)區(qū)給出三個(gè)特征的甲基信號(hào)δ〇·82(3Η， 8，]^-18)、0.84(3!1，8，]^-19)和1.10(3!1，(1，1 = 6.9抱，]^-21);在低場(chǎng)區(qū)給出兩個(gè)末端雙鍵 上的質(zhì)子信號(hào)M.83(1H，s)和4.79(lH，s);在糖端基信號(hào)區(qū)給出兩個(gè)糖端基氫信號(hào)δ4.91 (1!1，(1，1 = 7.8抱)和5.23(1!1，(1，1 = 7.9抱），提示該化合物為雙糖螺甾皂苷。
[0046] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)顯示出39個(gè)碳信號(hào)，其中δ1〇9·8為螺甾皂苷C-22特 征信號(hào)，δ144.8和109.1為25和27位末端雙鍵的特征信號(hào)。該化合物的碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道 白勺 50_spirost_25(27)_en_30_ol_3_O_0_D_glucopyranosyl_(l - 2)_0_D_ galactopyranoside基本一致，僅糖鏈部分?jǐn)?shù)據(jù)存在差異。在糖端基碳區(qū)給出兩個(gè)糖端基碳 信號(hào)δ1〇3.2和105.3，結(jié)合酸水解結(jié)果，確定為兩分子葡萄糖。通過(guò)與化合物3對(duì)照，它們糖 區(qū)碳譜數(shù)據(jù)基本一致，故可推測(cè)該化合物糖鏈連接為-GIc 4-GIc,其二維圖譜也證明了上述 推測(cè)。結(jié)合HSQC、HMBC和1H-1H COSY譜可對(duì)化合物3的核磁信號(hào)進(jìn)行完全歸屬。綜合以上信 息，化合物 3 鑒定為 50-spirost-25(27)-en-30-〇l-3-〇-0-D-glucopyranosyl-( l-4)-0-D-glucopyranoside。化合物3的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表3,化合物3的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0047]化合物4的鑒定
[0048] 50-spirost-25(27)-en-10，30-diol-3-〇-0-D-glucopyranosyl_( l-4)-0-D- glucopyranoside(化合物4):白色無(wú)定形粉末，[ot]?-52,9 (c 0,25, MeOH}，對(duì)Anisaldehyde (A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)EhrlisME試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖，提示該化合物為螺 留阜苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 755 · 4807(calcd · for C39H63Ow 755.4218)，提示其分子量為754，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為 C39H62〇14o
[0049] 1H-匪R譜中，高場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)三個(gè)特征的甲基信號(hào)，其中兩個(gè)為單峰，分別位于δ〇 . 84 (3!1，8，]^-18)和1.26(3!1，8，]^-19)，另一個(gè)為雙峰，位于31.10(3!1，(1，了 = 7.0抱，]^-21)。較 低場(chǎng)區(qū)顯示兩個(gè)末端雙鍵上的質(zhì)子信號(hào)S4.82(lH，s)和4.79(lH，s)。在糖端基信號(hào)區(qū)給出 兩個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)阽.21 (1H，d，J = 7.9Hz)和4.97 (1H，d，J = 7.8Hz)，提示化合物4為雙糖 螺甾皂苷。
[0050] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39個(gè)碳信號(hào)。其中δ109·8為螺留類皂苷骨架 上22位碳的特征信號(hào)，δ144.8和109.1為一對(duì)末端雙鍵的特征信號(hào)，δ1〇5.3與101.3為糖端 基碳信號(hào)。將該化合物苷元部分碳信號(hào)與已知化合物isorhodeasapogenin比較，發(fā)現(xiàn)除了 F 環(huán)及3位碳信號(hào)有較大差別外，其余碳信號(hào)基本一致，因此可以推測(cè)該化合物苷元為25(27) 位雙鍵結(jié)構(gòu)的isorhodeasapogenin。此外化合物4的3位碳信號(hào)較isorhodeasapogenin向低 場(chǎng)發(fā)生了較大位移，因此可以推斷該化合物的3位羥基成苷。通過(guò)與已知化合物 isorhodeasapogenin3_O_0_D_glucopy;ranosyl_( 1-4)_0_D_glucopy;ranoside 對(duì) Rf、，它"(門(mén) 糖區(qū)碳譜數(shù)據(jù)基本一致，故推測(cè)化合物4的糖鏈連接順序?yàn)?-0-i3-D-GlC-(l44)-i3-D-Gl C。 在HMBC譜中糖端基質(zhì)子δ5.21與內(nèi)側(cè)糖的04(δ81.5)相關(guān)，內(nèi)偵_端基質(zhì)子δ4.97與苷元C-3(δ75 · 2)相關(guān)，進(jìn)一步確定該化合物的糖鏈與化合物18〇1"11〇(16383?〇8611；[113-0-0-0-區(qū)111(3<^5^3110871-(144)-0-0-8111(3(^5^31108丨(16完全相同。綜上所述，化合物4鑒定為50-spirost_25(27)_en_10，30_diol_3_O_0_D_glucopyranosyl_(l-4)_0_D_ glucopyranoside。化合物4的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表3,化合物4的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1
[0051] 化合物5的鑒定
[0052] (25R)-50-spirostan-10，30-diol-3-〇-0-D_glucopyranosy 1_( 1-6 )-0_D-glucopyranoside(化合物5):白色無(wú)定形粉末，[a]f-27.〇 (c 'CU2, MeQH),對(duì)Anisaldehyde (A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)EhrlisME試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖，提示該化合物為螺 留阜苷類化合物。HRESIMS(positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 757 · 4403(calcd · for C39H65Ow 757.4374)，提示其分子量為756，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為 C39H64〇14〇
[0053] 在IR(KBr)中，3411cm-1為多羥基的吸收峰，在lOOO-SOOcm-1之間，919cm-帶）小 于899〇1^((：帶），說(shuō)明化合物25位為R構(gòu)型 [97]。
[0054]在1H-匪R譜中，高場(chǎng)區(qū)給出甾體皂苷元上四個(gè)特征的甲基信號(hào)，其中兩個(gè)為單峰， 分別位于 60.81(3!1，8，]^-18)和1.24(3!1，8，]^-19)，另外兩個(gè)為雙峰，位于50.68(3!1，(1，了 = 5.6Hz，Me-27)和1.14(3H，d，J = 6.9Hz，Me-21)。在糖端基信號(hào)區(qū)給出兩個(gè)糖端基質(zhì)子信號(hào)δ 5.02(1!1，(1，1 = 7.7抱）和4.93(1!1，(1，1 = 7.8抱），提示化合物5為雙糖螺甾皂苷。由糖端基氫 信號(hào)的J值可知兩個(gè)葡萄糖均為β構(gòu)型。
[0055] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39個(gè)碳信號(hào)。其中δ1〇9·6為螺留類皂苷骨架 上22位碳的特征信號(hào)，δ1〇5.3與102.4為兩個(gè)糖端基碳信號(hào)。該化合物的碳譜數(shù)據(jù)與已知化 合物isorhodeasapogenin 3_O_0_D_glucopy;ranosyl_( 1-4)_0_D_glucopy;ranoside十分 相似，僅糖區(qū)的碳信號(hào)有所差別，因此可以推測(cè)二者擁有相同的苷元及糖組成，只是糖的連 接方式不相同。分析化合物5葡萄糖的碳譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)葡萄糖的6位碳(δ70.7)向低場(chǎng)位 移了7.7ppm，因此推測(cè)兩個(gè)葡萄糖連接方式為-Gl C-(6-l)-Glc。在HMBC譜中糖端基質(zhì)子δ 5.〇2與內(nèi)側(cè)糖的〇607〇.7)相關(guān)，內(nèi)側(cè)糖端基質(zhì)子54.93與苷元(：-3076.〇)相關(guān)，進(jìn)一步證 明了兩個(gè)葡萄糖鏈接位點(diǎn)的正確性。綜合以上信息，化合物5鑒定為(25R)-50-spirostan-l β，30-diol-3-〇-0-D-glucopyranosyl_( 1-6)-0-〇-區(qū)111(3〇卩5^已11〇81(16〇化合物5的1!1-匪1? 和 13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，化合物5的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0056] 化合物6的鑒定
[0057] (25R)-50-spirostan-lP, 3P-diol-3-〇-0-D-fructofuranosyl-(2^6)-0-D-glucopyranoside(化合物6):化合物6為白色無(wú)定形粉末，[0^-66,8 (r 0.50, Me()H)，對(duì) Ani saldehyde( A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)Ehr Iish (E試劑)不顯色，酸水解檢出D-葡萄糖和D-果 糖，提示該化合物為螺留皂苷類化合物。HRESMS (posi ti ve)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+m/z 757 · 4401 (calcd · for C39H65Om 757 · 4374)，提示其分子量為756，結(jié)合1H-NMR和 13C-匪R (DEPT)可確定其分子式為C39H64〇i4。
[0058] 在IR(KBr)中，3391cm-1為多羥基的吸收峰，在lOOO-SOOcm-1之間，918cm-帶）小 于899〇1^((：帶），說(shuō)明化合物25位為R構(gòu)型。
[0059]在1H-匪R譜中，高場(chǎng)區(qū)給出甾體皂苷元上四個(gè)特征的甲基信號(hào)，其中兩個(gè)為單峰， 分別位于 30.81(3!1，8，]^-18)和1.23(3!1，8，]^-19)，另外兩個(gè)為雙峰，位于30.69(3!1，(1，了 = 5.6抱^-27)和1.14(3!1，(1，1 = 7.0抱^-21)。在糖端基信號(hào)區(qū)只給出一個(gè)糖端基質(zhì)子信 號(hào) S4.89(lH，d，J = 7.8Hz)。
[0060] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)中共有39個(gè)碳信號(hào)。其中δ109.6為螺甾類皂苷骨架 上22位碳的特征信號(hào)。在糖端基信號(hào)區(qū)給出兩個(gè)糖端基碳信號(hào)δ1〇6.2和102.1，提示化合物 6為雙糖螺留皂苷。結(jié)合DEPT譜可知106.2處為季碳，提示該化合物含有一分子酮糖，與酸水 解檢出D-果糖(六碳酮糖)一致。化合物6的苷元部分及葡萄糖部分的碳信號(hào)與化合物5基本 一致，提示化合物6也是isorhodeasapogenin的3位成苷的螺留阜苷。在HMBC譜中，葡萄糖6 位質(zhì)子信號(hào)34.85(1!1，(1，1 = 9.1抱）和4.55(1!1，111)與果糖2位碳信號(hào)01〇6.2)相關(guān)，葡萄糖1 位質(zhì)子信號(hào)δ4.89 (IH，d，J = 7.8Hz)與苷元3位碳信號(hào)（δ75.6)相關(guān)，結(jié)合文獻(xiàn)，確定該化合 物的糖鏈鏈接為3-〇-61〇-(64 2)1^1。綜合以上信息，化合物6鑒定為（251〇-50-spirostan-?β，30_diol_3_O_0_D_fructofuranosyl_(2-6)_0_D_glucopyranoside。化合 物6的 1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表4，化合物6的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0061] 化合物7的鑒定
[0062] spirost_25( 27)_θη_1β，2β，3β，50-七61:瓜〇1-5-〇-0-〇-8111(3〇卩5^&11〇81(16(化合物 7):化合物7為白色無(wú)定形粉末，[exp-44.9 (r 0.50, MeOH)，紅外譜圖中顯示強(qiáng)的多羥基吸 收峰34240^1，對(duì)Anisaldehyde (A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)Ehr lish(E試劑)不顯色，酸水解檢出 D-葡萄糖，提示該化合物為螺留皂苷類化合物。HRESMS(Positive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+ H]+m/z 625.3630(calcd.for C33H53Oii 625.3588)，提示其分子量為624,結(jié)合1H-NMR和 13C-NMR(DEPT)可確定其分子式為C33H52O1U
[0063] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)譜中，高場(chǎng)區(qū)給出三個(gè)特征的甲基信號(hào)δ〇·83(3Η， 8，]^-18)、1.62(3!1，8，]^-19)和1.08(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低場(chǎng)區(qū)給出兩個(gè)末端雙鍵 上的質(zhì)子信號(hào)M.83(1H，s)和4.79(lH，s);在糖端基信號(hào)區(qū)給出一個(gè)糖端基氫信號(hào)δ5.29 (lH，d，J = 7.7Hz)，結(jié)合糖端基氫信號(hào)的J值與酸水解分析結(jié)果，提示該化合物為含有一個(gè) β-D-葡萄糖單糖螺留皂苷。
[0064] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)顯示出33個(gè)碳信號(hào)，其中δ1〇9·8為螺甾皂苷C-22特 征信號(hào)，δ 144.8和109.1為25和27位末端雙鍵的特征信號(hào)，δ97.7為糖端基碳信號(hào)。經(jīng)與文獻(xiàn) 對(duì)照[1Q2]，該化合物與spirost-SS^Tpen-lPJPJPJP-tetraoim-D-galactopyranoside 苷元部分的碳譜數(shù)據(jù)基本一致 ，僅糖區(qū)信號(hào)不同 ，提示化合物 7 的苷元 為8口;[1'081：-25(27)-611-10，20，30，50-七61^301。在服13(]譜中，葡萄糖端基質(zhì)子信號(hào) 35.29 (1!1，(1，1 = 7.7他）與苷元(：-5(683.4)相關(guān)，從而確定葡萄糖連接在化合物7的(：-5位。通過(guò) 1H-Nmi^ 13C-Nmr(DEPT)Ahsqc^hmbcJh-1H⑶SY和NOESY譜并結(jié)合文獻(xiàn)可以對(duì)該化合物的碳 及氫信號(hào)進(jìn)行全面歸屬。綜合以上信息，化合物7鑒定為spirost-25 (27 )-θη-1β，2β，3β，5β-tetraol_5-〇-0-D-glucopyranoside?；衔?7 的1Η-ΝΜ 和 13C-NMR 數(shù)據(jù)見(jiàn)表 5，化合物 7 的結(jié)構(gòu) 見(jiàn)表1。
[0065]化合物8的鑒定
[0066] sp iro st_25 (27)-en-?β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-0-D_xy lopyranos ide(化合物 8):白色無(wú)定形粉末，[α]?:-43.3 ?'0.25, MeOH),紅外譜圖中顯示強(qiáng)的多羥基吸收峰3364cm 一1，對(duì)Ani saldehyde( A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)Ehr Iish (E試劑)不顯色，酸水解檢出D-木糖，提 示該化合物為螺甾皂苷類化合物。!11^303(?〇81^代）給出準(zhǔn)分子離子峰[1+!1] +111八 611 · 3437(calcd · for C32H51O11 611 · 3431)，提示其分子量為610，結(jié)合1H-NMR和 13C-NMR (DEPT)可確定其分子式為C32H5qO11。
[0067] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)譜中，高場(chǎng)區(qū)給出三個(gè)特征的甲基信號(hào)δ〇·84(3Η， 8，]^-18)、1.59(3!1，8，]^-19)和1.09(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低場(chǎng)區(qū)給出兩個(gè)末端雙鍵 上的質(zhì)子信號(hào)M.82(1H，s)和4.79(lH，s);在糖端基信號(hào)區(qū)給出一個(gè)糖端基氫信號(hào)δ5.15 (lH，d，J = 7.5Hz)，結(jié)合糖端基氫信號(hào)的J值與酸水解分析結(jié)果，提示該化合物為含有一個(gè) β-D-木糖的單糖螺留皂苷。
[0068] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)顯示出32個(gè)碳信號(hào)，其中δ1〇9·8為螺甾皂苷C-22特 征信號(hào)，δ144.7和109.1為25和27位末端雙鍵的特征信號(hào)，δ1〇3.5為糖端基碳信號(hào)。另將該 化合物苷元部分碳譜數(shù)據(jù)與已知化合物△ 25(27)_pentrogenin比較，發(fā)現(xiàn)除了2位碳信號(hào)向 低場(chǎng)位移6.6ppm外，其余信號(hào)基本一致，因此推測(cè)該化合物為△ 25(27)-pentrogenin的2位苷 化后形成的留體皂苷。在HMBC譜中，木糖端基質(zhì)子信號(hào)δ5.15(IH，d，J = 7.5Hz)與苷元C-2(δ 74.4)相關(guān)，從而確定木糖連接在化合物T38的C-2位。通過(guò)1H-匪R、13C-匪R(DEPT)、HSQC、 HMBC和1H-1H COSY譜可以對(duì)該化合物的碳及氫信號(hào)進(jìn)行全面歸屬。綜合以上信息，化合物8 鑒定為spiro s t_25 (27 )_θη_1β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-0-D_xy Iopyranoside。化合物8 的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，化合物8的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0069]化合物9的鑒定
[0070] spirost-25(27)_θη_1β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-a-L_arabinopyranoside(化 合物9):白色無(wú)定形粉末，[?jiN49.2 (c 0.25, MC0H)，紅外譜圖中顯示強(qiáng)的多羥基吸收峰 3422cm-S對(duì)Anisaldehyde (A試劑)反應(yīng)顯黃色，對(duì)Ehrl ish(E試劑)不顯色，酸水解檢出L-阿 拉伯糖，提示該化合物為螺留皂苷類化合物。HRESMS(p0sitive)給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H] + m/z 611.3412(calcd.for C32H51O11 611.3431)，提示其分子量為610,結(jié)合1H-NMR和 13C-NMR (DEPT)可確定其分子式為C32H5qO11。
[0071] 在1H-NMR(500MHz，pyridine-d5)譜中，高場(chǎng)區(qū)給出三個(gè)特征的甲基信號(hào)δ〇·83(3Η， 8，]^-18)、1.58(3!1，8，]^-19)和1.09(3!1，(1，1 = 7.0抱，]^-21);在低場(chǎng)區(qū)給出兩個(gè)末端雙鍵 上的質(zhì)子信號(hào)M.81(1H，s)和4.78(lH，s);在糖端基信號(hào)區(qū)給出一個(gè)糖端基氫信號(hào)δ5.13 (lH，d，J = 7.OHz)，結(jié)合糖端基氫信號(hào)的J值與酸水解分析結(jié)果，提示該化合物為含有一個(gè) α-L-阿拉伯糖的單糖螺甾皂苷。
[0072] 13C-NMR(126MHz，pyridine-d5)顯示出32個(gè)碳信號(hào)，其中δ1〇9·8為螺甾皂苷C-22特 征信號(hào)，δ144.7和109.1為25和27位末端雙鍵的特征信號(hào)，δ1〇3.4為糖端基碳信號(hào)。另將該 化合物的碳譜數(shù)據(jù)與化合物8比較，二者苷元部分?jǐn)?shù)據(jù)基本一致，僅糖區(qū)信號(hào)有差異，推測(cè) 該化合物同樣也為A 25(27)-pentr〇genin的2位苷化后形成的留體皂苷，只是2位連接的是阿 拉伯糖而不是木糖。在HMBC譜中，阿拉伯糖端基質(zhì)子信號(hào)35.13(1!1，(1，1 = 7.0抱）與苷元(：-2 (δ74.0)相關(guān)，從而確定阿拉伯糖連接在化合物9的C-2位。通過(guò)1H-匪R、 13C-匪R(DEPT)、 HSQC、HMBC和1H-1H COSY譜可以對(duì)該化合物的碳及氫信號(hào)進(jìn)行全面歸屬。綜合以上信息，化 合物 9 鑒定為 spirost-25 (27 )_θη_1β，2β，3β，4β，50-pentol-2-〇-a-L_arabinopyranoside 〇 化合物9的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，化合物9的結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1。
[0073] 表2本發(fā)明化合物1和化合物2的1H-NMR和13C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d 5)
[0075] 表3本發(fā)明化合物3和化合物4的iH-NMR和i3C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d 5)
[0077] 表4本發(fā)明化合物5和化合物6的1H-NMR和13C-NMR譜數(shù)據(jù)(pyridine-d 5)

L〇〇84」買(mǎi)施例2抑瘤試驗(yàn)：
[0085] 本發(fā)明化合物對(duì)人體7個(gè)瘤株的體外抑瘤活性實(shí)驗(yàn)，這7個(gè)瘤株包括FaDu(人咽鱗 癌細(xì)胞）、Detroit 562(人咽頭癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞），CNE-1 (高分化人鼻咽鱗癌細(xì)胞），CNE-2 (低分化人鼻咽鱗癌細(xì)胞），HepG2(人肝癌細(xì)胞），K562(人慢性骨髓性白血病細(xì)胞），SPC-A-I (人肺腺癌細(xì)胞)七種人體腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性以及對(duì)正常細(xì)胞L-929(小鼠成纖維細(xì)胞） 的毒性。抗癌藥(^8-(1；[(311101'0(1丨3111；[116。131：；[1111111(11)(順鉬)作為陽(yáng)性對(duì)照 。
[0086] 抑制腫瘤細(xì)胞增殖(MTIti)
[0087] 將腫瘤細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入待測(cè)試樣品，再培養(yǎng)48h后用MTT法測(cè) 定樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率按下述公式計(jì)算，并用CalcuSyn軟件計(jì) 算被測(cè)試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC 50)。
[0088] 細(xì)胞增殖抑制率=(陰性對(duì)照組OD值平均值-樣品組OD值平均值）+ (陰性對(duì)照組 OD值平均值-空白對(duì)照組OD值平均值）X 100%
[0089] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7和圖1。
[0090]表7:本發(fā)明化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0092]從表7和圖1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，化合物1~9對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞均具有較好的抑制作 用，尤其是化合物1、3~6對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出很好的抑制作用(見(jiàn)表7)，而其余化合物 在濃度為50μΜ時(shí)對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞也有不同程度的抑制作用(見(jiàn)圖1)。
[0093]實(shí)施例3抗炎試驗(yàn)：
[0094]本發(fā)明化合物對(duì)體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)，采用LPS(脂多糖)誘導(dǎo)的Raw 264.7(小鼠巨 噬細(xì)胞)細(xì)胞，建立體外炎癥模型。采用MTT和Griess實(shí)驗(yàn)，考察本發(fā)明化合物對(duì)經(jīng)脂多糖誘 導(dǎo)后的Raw 264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO的影響?？寡姿嶪ndomethacin(吲噪美辛）作為陽(yáng)性 對(duì)照。
[0095] 1)MTT 實(shí)驗(yàn)
[0096] Raw 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入待測(cè)供試品，再培養(yǎng)24h后用 MTT法測(cè)定樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞增殖抑制率按下述公式計(jì)算，并用Ca I cu Sy η 軟件計(jì)算被測(cè)試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
[0097] 細(xì)胞增殖抑制率=(陰性對(duì)照組OD值平均值-樣品組OD值平均值）+ (陰性對(duì)照組 OD值平均值-空白對(duì)照組OD值平均值）X 100%
[0098] 2)Griess 實(shí)驗(yàn)
[0099] Raw 264.7細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入待測(cè)供試品，再培養(yǎng)24h后， 吸取各孔培養(yǎng)液50yL，加入50yL Griess A試劑和50yL Griess B試劑混勻，用酶標(biāo)儀于 546nm處測(cè)定OD值，按如下公式計(jì)算對(duì)NO產(chǎn)生的抑制率，并用CalcuSyn軟件計(jì)算被測(cè)試樣品 的半數(shù)抑制濃度(IC 50)。
[0100] NO抑制率=(模型對(duì)照組OD值平均值-樣品組OD值平均值）+ (模型對(duì)照組OD值平 均值-陰性對(duì)照組OD值平均值）X 100%
[0101] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8和圖2。
[0102]表8:本發(fā)明化合物對(duì)Raw 264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO的抑制作用
[0104] 從表8和圖2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明化合物1~9具有較好體外抗炎活性，尤其是 化合物2~8表現(xiàn)出更佳的抗炎活性（見(jiàn)表8)，化合物1和9在濃度為50μΜ時(shí)對(duì)LPS誘導(dǎo)的 Raw264.7細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)NO也有不同程度的抑制作用(見(jiàn)圖2)。
[0105] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.螺留類化合物，其結(jié)構(gòu)式分別為：2. 權(quán)利要求1所述螺留類化合物在制備防治癌癥藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述癌癥為咽鱗癌、咽頭癌、鼻咽鱗癌、肝 癌、慢性骨髓性白血病、肺腺癌。4. 權(quán)利要求1所述螺留類化合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK105859825SQ201610301627
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】何祥久, 向麗敏, 王宜海, 易曉敏
【申請(qǐng)人】廣東藥學(xué)院