對hpv16 e7具有結合親和力的多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種對HPV16 E7具有結合親和力的多肽及其用途。首次揭示了一種對HPV16的E7蛋白具有結合親和力的多肽；本發(fā)明還提供了該多肽作為藥物或分子靶向試劑的診斷或治療用途。
【專利說明】
對HPV16 E7具有結合親和力的多肽及其用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種對HPV16 E7具有結合親和 力的多肽及其用途。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌是一種全球公認的主要與人乳頭瘤病毒（HPV)感染相關的癌癥，死亡率在 全球婦女癌癥中高居第二。現(xiàn)有技術中，盡管基于HPV Ll蛋白的宮頸癌預防性疫苗已經(jīng)商 業(yè)化，但基于HPV及其E7的治療性疫苗，尚處于實驗研究探索階段。而存在的問題是：治療 性疫苗發(fā)揮作用是建立在機體免疫功能基礎之上，用腫瘤特異性抗原或表位激發(fā)更為強烈 的抗腫瘤特異性免疫效應，以達到清除腫瘤細胞的目的；但腫瘤病人往往存在自身免疫功 能低下，或免疫抑制或免疫逃逸等而使治療性疫苗發(fā)揮作用有限，難以達到預期的治療目 的。
[0003] 靶向治療是目前宮頸癌治療中最具希望的方法和策略，主要包括下列幾種類型： (1)表皮生長因子受體（EGFR)為靶點的治療：EGFR與細胞內(nèi)信號轉導有關，發(fā)揮著調(diào)節(jié)正 常細胞的生長和分化，增強腫瘤細胞侵襲力、促進血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡等作用，而 使其成為包括宮頸癌在內(nèi)的多種人類腫瘤診斷和治療的新靶點。目前，靶向EGFR的腫瘤治 療藥物主要分為兩類：EGFR單克隆抗體和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑。其中單克隆抗 體主要為HER2單克隆抗體，包括曲妥珠單抗（赫賽汀，Herceptin)和西妥昔單抗等；而小 分子化合物主要包括吉非替尼、伊馬替尼和埃洛替尼等。（2)以腫瘤血管生成為靶點的治 療：腫瘤細胞的生長和轉移依賴于血管的形成，因而抗血管生成也是腫瘤靶向治療研究的 熱點之一。如①貝伐單抗（rhuMAb-VEGF)，一種人源化單克隆抗體IgGl，通過抑制VEGF生 物活性而抑制血管生成，貝伐單抗單藥治療或與其他化療藥物聯(lián)合應用均可減少腫瘤血管 生成。②舒尼替尼，一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGF R的酪氨酸激酶活性從 而特異性阻斷細胞內(nèi)信號傳導發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0004] 總之，分子靶向治療可最大限度地殺傷腫瘤細胞，有效地降低腫瘤的復發(fā)和遠處 轉移的風險，提高患者的生存率并提高患者的總生存時間。盡管基于單克隆抗體及其小分 子片段的靶向分子治療具有明顯的優(yōu)勢，但是也存在不足，包括：（1)滲透性不夠：限制抗 體穿透體積大的實體瘤；（2)靶位點外滲：由于血管透性降低而致抗體在靶位點的外滲； (3)毒副作用：抗體對正常組織的非特異性結合而產(chǎn)生交叉反應，降低了靶向效果；(4)體 內(nèi)清除：注入的抗體代謝提高，降低了治療效果；（5)抗體的免疫原性：抗體誘導機體產(chǎn)生 抗人抗體，使治療性抗體失活。由于交叉反應及免疫復合物的形成，使毒副作用產(chǎn)生的毒性 效應已經(jīng)成為發(fā)展針對癌癥治療性抗體的主要障礙，產(chǎn)生肝、腎及神經(jīng)系統(tǒng)毒性而使其功 能降低。如與HER2革El向抗體trastuzumab(Herceptin)相關的心臟毒性效應。用同位素標 記抗體進行放射性免疫治療也會導致骨髓抑制。
[0005] 因此，本領域仍然亟待研究靶向性治療HPV相關腫瘤疾病的新藥物或新方法，以 改善目前臨床現(xiàn)狀。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種對HPV16 E7具有結合親和力的多肽及其用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種對人乳頭瘤病毒16型（HPV16)的E7蛋白具有結 合親和力的多肽，該多肽是以葡萄球菌A蛋白（SPA)Z段（Z結構域）的氨基酸序列作為骨 架，進行12-20個（較佳地為13-16個，如14個、15個）氨基酸變異后獲得的多肽。
[0008] 在一個優(yōu)選例中，相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID NO: 5)，所述 的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽在第9-11，13-14,17-18, 24-25， 27-28, 32, 35,43位上發(fā)生氨基酸突變。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，所述的對人乳頭瘤病 毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽的：
[0010] 第9位氨基酸突變?yōu)镾或W ;
[0011] 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V ;
[0012] 第11位氨基酸突變?yōu)镋、L或W ;
[0013] 第13位氨基酸突變?yōu)镽、I或S ;
[0014] 第14位氨基酸突變?yōu)镾、L、M或A;
[0015] 第17位氨基酸突變?yōu)槲富虺撸?br>[0016] 第18位氨基酸突變?yōu)锳、W、T或Q;
[0017] 第24位氨基酸突變?yōu)镚、R、D或P ;
[0018] 第25位氨基酸突變?yōu)镈、L、HSG;
[0019] 第27位氨基酸突變?yōu)镚、V、ASQ;
[0020] 第28位氨基酸突變?yōu)镽、E或L ;
[0021 ] 第32位氨基酸突變?yōu)長、V或E ;
[0022] 第35位氨基酸突變?yōu)镚、H、Q或D ;
[0023] 第43位氨基酸突變?yōu)镋或K。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽 的氨基酸序列如SEQ ID N0:2-5任一所示。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽 與人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白相互作用的K d值為1X10 6M至1X10 7M。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，所述的靶 向性分子包括前面任一所述的多肽，以及與該多肽相連接（或偶聯(lián)）的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián) 物包括（但不限于）：半胱氨酸殘基，多肽標簽，抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物，或可檢測 標記物（如熒光標記，酶，生物素或放射性同位素）。
[0027] 在一個優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)物是肽，所述的偶聯(lián)物與所述的對人乳頭瘤病毒16 型的E7蛋白具有結合親和力的多肽構成融合多肽。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的多肽標簽包括但不限于：His標簽（如6XHis)，Myc標 簽，GST標簽，F(xiàn)lag標簽。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述酶包括但不限于：堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物包括（但不限于）：毒素； 較佳地，所述毒素是具有抑制人乳頭瘤病毒16型病毒感染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉 毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素或所述毒素的功能性片段；且，所述的腫瘤是人乳頭瘤病 毒16型陽性的腫瘤。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的毒素是綠膿桿菌外毒素 A，或所述毒素的功能性片段是綠 膿桿菌外毒素 A的活性片段PE38KDEL。較佳地，該綠膿桿菌外毒素 A或其功能性片段連接 于所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽的羧基末端（C末端）。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的偶聯(lián)物與所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結 合親和力的多肽以柔性肽連接，所述柔性肽包括（但不限于）：(Gly 4Ser)313
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，其編碼前面任一所述的對人乳 頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽。
[0034] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼所述的靶向人乳頭瘤病毒16型 的靶向性分子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組載體，該載體包含所述的多核苷酸。
[0036] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含所述的重組載體，或其 包含有或基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0037] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備前面任一所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7 蛋白具有結合親和力的多肽的方法，所述方法包括：（1)培養(yǎng)所述的細胞，從而表達所述的 對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽；（2)分離純化（1)獲得的多肽。
[0038] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和 力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子的用途，用于制備治療人乳頭瘤 病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤的藥物；或
[0039] 用于制備檢測人乳頭瘤病毒16型病毒感染的檢測試劑；或
[0040] 用于制備診斷人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤的 診斷試劑。
[0041] 在一個優(yōu)選例中，所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子中，所述的偶聯(lián)物 是抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物或抗腫瘤藥物（如毒素），所述的對人乳頭瘤病毒16型的 E7蛋白具有結合親和力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子用于治療人 乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子中，所述的偶聯(lián)物 是可檢測標記物（如熒光標記或酶），所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和 力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子用于診斷人乳頭瘤病毒16型感染 疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤包括：宮頸癌、頭頸部 腫瘤或外生殖器腫瘤等。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒16型感染疾病包括：宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變 或外生殖器疣等。
[0045] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，其包含：前面所述的對人乳頭瘤病毒 16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子；和 藥學上可接受的載體。
[0046] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒16型感染疾病或 人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤的藥盒，所述的藥盒中包括：所述的對人乳頭瘤病毒16型 的E7蛋白具有結合親和力的多肽，或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，或所述 的藥物組合物。
[0047] 在一個優(yōu)選例中，所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽 或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子是有效量的。
[0048] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種治療人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病 毒16型表達陽性腫瘤，包括將所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多 肽或所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子給予需要治療的對象。
[0049] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種診斷人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病 毒16型表達陽性腫瘤，包括將所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子給予需要治療 的對象；所述的靶向性分子中，所述的偶聯(lián)物是可檢測標記物（如熒光標記或酶）。
[0050] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0051] 圖1、各Zhpv16e7以及Zwt序列的對比。本發(fā)明的多肽Zhpv16e7中被修飾的氨基酸位點 在圖中己用黑體標出（SEQ ID N0:l-4)。
[0052] 圖2、實施例1中產(chǎn)生的一個融合多肽的重組質(zhì)粒構建圖（A)和氨基酸序列示意圖 ⑶。
[0053] Zhpv16e7代表具有選自SEQ ID NO : 1-5任一序列的HPV16E7結合結構域，6xHis代表 六組氨酞標記，HM代表NdeI (CATATG)翻譯的氨基酸，LE代表XhoI (CTCGAG)翻譯的氨基酸。
[0054] 圖3、pET21a(+)/affibody的重組質(zhì)粒電泳圖。
[0055] Ml :DNA marker ; 1-5 分別為 pET21a (+)/ZHPV16E7:127、pET21a (+)/ZHPV16E7:301、 pET21a(+)/ZHPV16E7:3S4、pET21a(+)/ZHPV16E7:745及 pET21a(+)/Z wt的重組質(zhì)粒。
[0056] 圖4、Affibody重組蛋白原核表達（A)及純化⑶的SDS-PAGE電泳分析。
[0057] A中：M :蛋白marker ; 1-2分別為BL21 (DE3)菌株和pET21 (+)空載體轉染 的 BL21(DE3)菌株，3-8 分別為 pET21a(+)/ZHPV16E7:127、pET21a(+)/ZHPV16E7: 3(n、pET21a(+)/ ZHPV16E7:384、pET21a ⑴/ZHPV16E7:745及 pET21a ⑴/Z wt的重組質(zhì)粒轉染的 BL21 (DE3)菌株。
[0058] B 中：M :蛋白 marker ; 1_5 分力U為純化后 Zhpv16 E7:127，Zhpv16 E7:301，Zhpv16 E7:384，Zhpv16 E7:745及Zwt affibody重組融合蛋白。
[0059] 圖 5、HPV16E7 重組蛋白的 SDS-PAGE 電泳及 Western Blot 分析。
[0060] M :marker ;1· E. coli. BL21(DE3)菌株；2.重組質(zhì)粒 pET21a(+)/HPV16E7 蛋白表 達；3.純化后HPV16E7重組融合蛋白。A :SDS-PAGE ;B Western Blot分析，一抗為His單 抗（I: 10000) ;C :Western Blot分析，一抗為宮頸癌患者血清（1:500)。
[0061] 圖6、Zhpv16 E7結合多肽在ProteOn XPR36儀器上的SPR檢測。
[0062] A、B、C、D、E 分力丨」為 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745及 Z wt蛋白與革巴蛋 白HPV16E7的親和力分析。
[0063] 圖7、Zhpv16 E7結合多肽與HPV16 E7天然蛋白親和力的細胞免疫熒光方法鑒定。
[0064] A :ZHPV16 E7:127結合多肽的間接免疫熒光檢測；B :ZHPV16 E7:3M蛋白的間接免疫熒光檢 測；C :ZHPV16 E7:3S4蛋白的間接免疫熒光；D :ZHPV16 E7:745蛋白的間接免疫熒光檢測；E :HPV16E7 兔抗體為一抗的間接免疫熒光檢測。
[0065] 圖8、Dylight755標記的Zhpv16 E7:3S4結合多肽SDS-PAGE電泳及熒光分析。
[0066] A 為 Zhpv16 E7:3S4多肽 SDS-PAGE 電泳分析；B 為標記 Dylight755 的 Z HPV16 E7:3S4多肽 SDS-PAGE電泳的熒光分析。
[0067] 圖9、Dylight755標記的Zhpv16 E7:3S4多肽在荷瘤裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向的成 像分析。A為Dylight755標記的Zhpv16 E7:3S4多肽各時間點分別在負載Siha、Caski、HeLa229 和A375細胞荷瘤裸鼠體內(nèi)的熒光成像；B為各時間點分別在負載Siha、Caski、HeLa229和 A375細胞（按照自上而下的次序）荷瘤裸鼠體內(nèi)的平均熒光信號的強度。
[0068] 圖10、Dylight755標記的Zhpv16 E7:3S4多肽在荷瘤裸鼠各臟器和腫瘤組織中的成像 分析。Al-Dl為在注射Dylight755標記的Z hpv16 E7:3S4多肽24h后，在荷載腫瘤的裸鼠各主 要組織臟器中的熒光分布；A2-D2為相應腫瘤組織及各臟器的平均熒光信號的強度。
[0069] 圖11、四種Zhpv16 E7結合多肽對Siha細胞的IC50分析。A、B、C、D分別為ZHPV16E7:127、 ZhPV16 E7:301' Zhpv16 E7:384^- Z hpv16 ￡7:745 蛋白對Siha細胞的IC50分析。
[0070] 圖12、不同濃度Zhpv16 E7結合多肽對Siha細胞的生長抑制作用。A、B、C、D分別為 不同濃度的 ZhPV16 ￡7:127'' Zhpv16 ￡7:300 Zhpv16 E7 ； 384及 Z HPV16 E7 ;745蛋白對Siha細胞的生長抑制作 用。
[0071] 圖 13、pET21a(+)/ZHPV16 E7affitoxin 重組質(zhì)粒構建圖。
[0072] 圖 14、Zhpv16 E7 affitoxin 蛋白 SDS-PAGE 電泳和 WB 鑒定。
[0073] A :1，BL21(DE3)菌株；2, pET21a(+)載體轉化的 BL21(DE3) ;3-7 分別為 pET21a(+)/HPV16 E7affitoxinl27, 301，384, 745 和 Zwt affitoxin 重組質(zhì)粒轉染的 BL21(DE3)菌株；
[0074] B :ZHPV16 E7 affitoxinl27, 301，384, 745 和 Zwt affitoxin 純化蛋白 SDS-PAGE 電泳 圖；1-5 分別為 Zhpv16 E7affitoxinl27, 301，384, 745 和 Zwt affitoxin ;
[0075] C :為 Zhpv16 E7 affitoxinl27, 301，384, 745 Western blot 分析（一抗為 His 單抗），1為BL21 (DE3)菌株，2為pET21a⑴載體轉化的BL21 (DE3)，3-6分別為Zhpv16 E7affitoxinl27, 301, 384, 745 ；
[0076] D :為 Zwt affitoxin 蛋白 Western blot 分析（一抗為 His 單抗），1 為 BL21 (DE3) 菌株，2 為 pET21a(+)載體轉化的 BL21(DE3)，3 為 Zwt affitoxin 蛋白。
[0077] E :HPV16 E7_afTitoxin 蛋白 Western blot 分析（一抗為兔抗 SPA-Z 多 抗），1為BL21 (DE3)菌株2為pET21a⑴載體轉染的BL21 (DE3)，3-6分別為HPV16 E7affitoxinE127, 301，384, 745。
[0078] F :為 Zwt affitoxin 蛋白 Western blot 分析（一抗為兔抗 SPA-Z 多抗），1 為 BL21(DE3)菌株，2 為 pET21a(+)載體轉化的 BL21(DE3)，3 為 Zwt affitoxin 蛋白。
[0079] 圖15、Zhpv16 E7 affitoxin與HPV16 E7天然蛋白親和力的細胞免疫熒光鑒定。A : Zhpv16 E7 affitoxinl27蛋白；B :ZHPV16 E7 affitoxin301 蛋白；C :ZHPV16 E7 affitoxin384蛋白； D :ZHPV16 E7 affitoxin 745 蛋白。
[0080] 圖 16、Zhpv16 E7 affitoxin 蛋白在 ProteOn XPR36 儀器上的 SPR 檢測。A、B、C、D、 E 分別為 Zhpv16 E7 affitoxinl27、301、384、745及Zwtaf?itoxin蛋白蛋白與靶蛋白HPV16E7 的親和力分析。
[0081] 圖 17、Zhpv16 E7 affitoxin384 對 Caski 細胞⑷和 Siha 細胞⑶的 IC50 分析。
[0082] 圖18、ZHPV16 E7 affitoxin384對四種腫瘤細胞生長的影響。
[0083] 圖19、不同濃度Zhpv16e7 affitoxin384對Siha(A)和Caski⑶細胞的生長抑制作 用。
[0084] 圖 20、血漿中 ZHPV16E7:384⑶與 Zhpv16e7 affitoxin384(A)半衰期檢測。
[0085] 圖21、Zhpv16 E7 affitoxin384對Balb/c荷瘤裸鼠的抑瘤作用效應。
[0086] A :五組小鼠在接種Siha的同時，尾靜脈注射4mg/kg濃度的Zhpv16e7 affitoxin384 或Zhpv16e7:384、PE38KDEL蛋白、Zwt affitoxin蛋白及PBS，每隔3天注射一次，共6次，圖中 箭頭所示。
[0087] B :五組小鼠在接種Siha后，待腫瘤長至100~200mm3大小時，尾靜脈注射4mg/kg 濃度的 Zhpv16e7 Affitoxin384 或 ZHPV16E7:384、PE38KDEL 蛋白、Zwt affitoxin 蛋白及 PBS，每 隔3天注射一次，共6次，圖中箭頭所示。
【具體實施方式】
[0088] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次揭示了一種對人乳頭瘤病毒16型（HPV16)的E7 蛋白具有結合親和力的多肽；本發(fā)明還提供了該多肽作為藥物或分子靶向試劑的診斷或治 療用途。
[0089] 如本文所用，所述的"對HPV16 E7具有結合親和力的多肽"是指以葡萄球菌A蛋 白Z段的氨基酸序列作為骨架，進行10-20個氨基酸變異后獲得的多肽，且該多肽能夠特異 性結合HPV16 E7、具有極少或沒有非特異性結合。
[0090] 如本文所用，所述的"本發(fā)明的多肽"、"對HPV16 E7具有結合親和力的多肽"、 "HPV16 E7 結合多肽"、"ZHPV16E7 affibody 多肽"、"Zhpv16e7 affib〇dy"、"ZHPV16E7"、"affib〇dy 蛋 白"、"affibody重組蛋白"、"Zhpv16 E7重組蛋白"可以互換使用。
[0091] 如本文所用，所述的"靶向性分子"是指將本發(fā)明的對HPV16 E7具有結合親和力 的多肽與其它功能性偶聯(lián)物連接后獲得的、可以靶向HPV16 E7的分子。所述的偶聯(lián)物可以 是半胱氨酸殘基，多肽標簽，抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物，酶或可檢測標記物等。
[0092] 如本文所用，所述的"融合多肽"是所述的"靶向性分子"的下位概念，是指本發(fā)明 的對HPV16 E7具有結合親和力的多肽與其它功能性肽（例如毒素蛋白或功能性蛋白片段） 連接后獲得的、可以靶向HPV16 E7的分子。
[0093] HPV16型感染是致宮頸癌的主要型別。HPV感染宿主細胞后，其病毒基因整合到宿 主染色體，進而使宿主細胞發(fā)生突變并發(fā)展為腫瘤，其致癌的主要關鍵分子之一是HPV基 因早期區(qū)（E)編碼的E7蛋白，E7蛋白主要通過其氨基端的保守序列LXCXE與抑癌蛋白pRb 結合，使正常狀態(tài)下與Rb結合的轉錄因子E2F解離出來，并滅活pRb蛋白，解離的E2F即可 激活基因轉錄，促進了眾多細胞增殖相關基因的轉錄，引起細胞過度增殖惡性轉化。高危型 HPV E7蛋白是HPV所致宮頸癌的腫瘤原性蛋白，持續(xù)并穩(wěn)定地在宮頸癌及其癌前病變組織 中呈高表達，而在正常組織中不存在。綜合考慮上述因素，本發(fā)明人選擇HPV16 E7作為靶 抗原。本發(fā)明人以葡萄球菌A蛋白的Z結構域（Zwt，SEQ ID NO: 1)作為支架，將其表面氨基 酸殘基模擬抗體結合位點進行隨機突變，通過噬菌體展示技術構建突變文庫，以HPV16 E7 作為靶抗原對該文庫進行親和篩選，經(jīng)過大量的篩選工作，最終獲得了對于HPV16 E7具有 高度親和力的多肽。
[0094] 本發(fā)明的多肽是以葡萄球菌A蛋白Z結構域的氨基酸序列作為骨架，進行14-20 個（較佳地為14個）氨基酸變異后獲得的多肽。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明的多肽相 對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列（SEQ ID N0:5)，在第9-11，13-14，17-18,24-25， 27-28, 32, 35,43位上發(fā)生氨基酸突變。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有SEQID NO: 2-5任一所 示的氨基酸序列。
[0095] 本發(fā)明還涵蓋了在所述HPV16 E7結合多肽的氨基酸序列任一末端或兩端加入額 外的氨基酸殘基而形成的多肽。這些額外的氨基酸殘基可以在多肽結合HPV16 E7時起作 用，但是也可同樣用于其它目的，如涉及該多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測的一種或幾 種。這些額外的氨基酸殘基可以包括一或多種為了化學偶聯(lián)目的而添加的氨基酸殘基。如 在多肽鏈的第一位或最后一位添加，即在N或C末端添加一個半胱氨酸殘基等。這種額外 的氨基酸殘基也可以包括用于多肽純化或檢測的一個"標記"，如與標記抗體相互作用的六 組氨酸肽（His 6)標記，或"myc"標記或"flag"標記。此外，其它本領域技術人員熟知的替 代方式也包含在本發(fā)明中。
[0096] 所述"額外的氨基酸殘基"也可構成具有預期功能的一個或多個多肽結構域，如與 第一個、HPV16E7結合結構域相同的結合功能，或者其它結合功能，或是一種酶促功能，或是 一種熒光功能，或是其組合。
[0097] 本發(fā)明也包含在所述的HPV16 E7結合多肽基礎上，經(jīng)修飾進而增加其在堿性條件 下的穩(wěn)定性的多肽。這種穩(wěn)定性包括用對于堿性條件較不敏感的氨基酸殘基定點取代在沒 有修飾的序列中出現(xiàn)的任何天冬酞胺殘基。由于在不同的反應之間親和層析柱要經(jīng)受頻繁 的強堿處理以進行洗脫，這種對堿降低敏感性的特性，有利于使用本發(fā)明的多肽作為親和 層析中的親和配體，能夠延長親和層析基質(zhì)的使用壽命。
[0098] 本發(fā)明也包含在本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽基礎上，進行其它修飾后獲得的多 肽。這些修飾（通常不改變一級結構）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶（如哺乳動 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0099] 本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽可以與偶聯(lián)物連接，從而構成功能性的靶向性分子， 這種連接可通過化學鍵（包括肽鍵）相連或吸附；所述的化學鍵是共價鍵或非共價鍵。作 為一種優(yōu)選方式，通過肽鍵連接，從而形成融合多肽。
[0100] 所述的HPV16 E7結合多肽與偶聯(lián)物之間可以直接相連接，或者通過多肽連接子 (連接肽）連接。所述的連接子例如包括1-30個氨基酸；較佳地為1-20個氨基酸。連接 肽的設置基本上不影響融合蛋白中各多肽的活性。較佳地，可以利用柔性肽（61 745虹)3進 行連接。其它本領域技術人員熟知的連接肽也可應用于本發(fā)明。
[0101] 在"異源"融合多肽中，所述HPV16 E7結合多肽構成了第一個結構域或第一個部 分，第二和其它部分具有除了結合HPV16 E7外的其它功能，這些可預期的結果也在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。該融合多肽的第二和其它部分可能包含對除了 HPV16 E7外的其它靶分子具有 親和力的結合結構域。這種結合結構域也可能與SPA結構域相關，但在1到大約20個位置 具有取代突變。結果是融合多肽有至少一個HPV16 E7結合結構域和至少一個與所述其它 靶分子具有親和力的結構域。這擴展了本發(fā)明的多肽的應用，如作為治療制劑或作為捕獲、 檢測或分離試劑。
[0102] 本發(fā)明融合多肽第二和其它部分的其它選擇包括用于治療性應用的一或多種部 分。在治療性應用中，其它分子也可以通過其它方法共價或非共價偶聯(lián)到本發(fā)明的多肽上。 作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，將改造的銅綠假單胞菌外毒素 PE38KDEL通過柔性肽連接于 HPV16 E7結合多肽的C-末端，構成融合蛋白。非限制性例子包括用本發(fā)明多肽引導效應 酶（例如羧肽酶）而進行"ADEPT〃（抗體介導的酶前藥治療，antibody-directed enzyme prodrug therapy)的酶；包括用以募集免疫系統(tǒng)的效應細胞和其它組分的蛋白質(zhì)；包括細 胞因子，如IL-2、IFNy、IL-12、TNFa、IPlO ;包括促凝血因子，如組織因子、von Willebrand 因子；包括毒素，如蓖麻毒蛋白A、calcheamicin、美登木素生物堿；包括毒性小分子，如 auri statin類似物、阿霉素等。同時，為了更方便摻入放射性核素（如6SGa、76Br、 111 In、"Tc、 124I、125I)用于診斷或放射性核素（如9°Y、 mI、mAt)用于治療，可以考慮上述列舉的額外的 氨基酸（特別是六組胺酸標記和半胱氨酸），其目的是將放射性同位素的鰲合劑偶聯(lián)到多 妝序列。
[0103] 本發(fā)明還涵蓋了在所述的HPV16 E7結合多肽上連接一個可檢測標記物（如熒光 標記，生物素或放射性同位素），從而可基于本發(fā)明的多肽的特異性，實現(xiàn)檢測HPV16感染 或HPV16感染相關疾病的目的。
[0104] "HPV16 E7結合親和力"是指可以例如通過利用表面等離子共振（surfaceplasmon resonance)技術如Biocore*?裝置進行檢測的一種多肽特性。HPV16 E7結合親和力可以通 過一個實驗進行檢測，其中將HPV16 E7固定在該裝置的感應芯片上，然后將含有待測多肽 的樣品通過該芯片。或者，也可以將待檢測的多肽固定在該裝置的感應芯片上，然后將含 有HPV16 E7的樣品通過該芯片。本領域技術人員可以利用所獲得的感應圖像建立多肽的 HPV16 E7結合親和力的至少一種定性測量方法。如果需要定量測量方法，例如為了建立相 互作用間的某個Kd值，也可以使用表面等離子共振方法。例如，結合值可以利用Biocore li 2000裝置（Biocore AB)進行測定。HPV16 E7固定于該裝置的感應芯片上，而親和力待檢 測的多肽樣品通過連續(xù)稀釋制備并以隨機順序進行注射。然后可從結果中計算Kd值。在 本發(fā)明的實施例中，所述的多肽的K d值達到I X 10 6M至I X 10 7M。
[0105] 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽或靶向性分子或融合多肽的分 離的核酸，也可以是其互補鏈。所述核酸可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法分別 獲得。
[0106] 本發(fā)明還提供了包含編碼所述核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸 分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于所述融合蛋白的表達。如本文所用，"操作 性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線 性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制以編碼序列的轉錄，那么它就是可操作 地連于編碼序列。
[0107] 在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于細菌、真菌、酵母和哺乳 動物細胞的克隆和表達的載體，如Pouwels等，克隆載體：實驗室手冊中所描述的。
[0108] 此外，含有所述核酸序列的重組細胞也包括在本發(fā)明中。術語"宿主細胞"包括原 核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細 胞（E. coli)，如大腸桿菌HMS174 (DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、 昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
[0109] 生產(chǎn)本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽或靶向性分子或融合多肽的方法也已包括在本 發(fā)明中。所述方法包括培養(yǎng)含有相應多肽的編碼核酸的重組細胞，獲得產(chǎn)物多肽。可將上 述制備獲得的多肽純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。
[0110] 基于要表達多肽的信息和目前重組表達蛋白質(zhì)的技術水平，結合本發(fā)明揭示的內(nèi) 容，本領域技術人員易于制備本發(fā)明的多肽。例如，表達未被修飾的Z結構域的質(zhì)?？梢杂?作起始材料。使用已知技術，所需的取代突變可以被引入這個質(zhì)粒中以獲得本發(fā)明的表達 載體。
[0111] 當使用化學多肽合成方法制備本發(fā)明的多肽或靶向性分子或融合蛋白時，上述多 肽中的任何天然產(chǎn)生的氨基酸殘基都可以被任何相應的、非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基或其衍 生物所取代，只要產(chǎn)物多肽的功能基本不被損害。
[0112] 本發(fā)明還涉及所述的HPV16 E7結合多肽或靶向性分子或融合多肽在不同方面的 應用，包括應用于治療、診斷和/或檢測。
[0113] 本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽可作為HPV16 E7抗體在不同應用中的一種替代物。 作為非限制性的實例，其可用于治療特征以HPV16 E7表達或HPV16感染為特征的疾病，例 如腫瘤（如宮頸癌，頭頸部腫瘤）等。通過結合胞內(nèi)HPV16 E7以抑制細胞信號傳導，用于 相關疾病的體內(nèi)和體外診斷。本發(fā)明的多肽可作為一種檢測試劑、一種捕獲試劑或者分離 試劑，而且還可直接用作為一種治療制劑或者將其它治療制劑靶向HPV16 E7蛋白的手段。 體外使用本發(fā)明的多肽的方法可以不同方式進行，如微量滴定板、蛋白陣列、生物傳感器表 面和組織切片等等。為了使本發(fā)明多肽適用于特異的用途，在不偏離本發(fā)明的范圍的情況 下，可以對本發(fā)明的多肽進行修飾和/或添加。在下面詳細描述了這些修飾和添加，其可能 包括在同一多肽鏈中包含的額外的氨基酸，或者標記和/或治療制劑，其化學修飾或以其 它方式結合本發(fā)明的多肽。另外，本發(fā)明還涵蓋了保留了結合HPV16 E7能力的該多肽的片 段。
[0114] 本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽可以作為治療制劑，其治療作用基于至少一種以下機 制：（i)加強化療作用，施用本發(fā)明的多肽與目前和將來的化療治療協(xié)同作用。阻斷胞內(nèi)的 HPV16 E7蛋白對抑癌基因 pRb的破壞作用；（ii)抑制腫瘤細胞的增殖?？赡茉诩毎麅?nèi)存在 以下機制：當結合多肽進入細胞內(nèi)部與HPV16 E7蛋白結合時，阻斷了 HPV16 E7與pRb的結 合，從而阻斷了細胞生長增殖信號。
[0115] 本發(fā)明多肽的HPV16 E7結合特性以及用該多肽生產(chǎn)靶向性分子（包括融合蛋白） 和/或標記的結合分子的穩(wěn)定性意味著該多肽也可以用于將其它活性物質(zhì)靶向腫瘤部位， 這些腫瘤包括表達HPV16 E7的細胞。因此，本發(fā)明的另一方面是提供了本文所述的HPV16 E7結合多肽與一種具有抗癌活性的物質(zhì)偶聯(lián)的應用，以將所述物質(zhì)運送到表達HPV16 E7 的細胞，產(chǎn)生靶細胞的損傷或凋亡。
[0116] 這種抗癌活性的物質(zhì)可能是通過融合或通過化學鍵偶聯(lián)到HPV16 E7結合多肽上 的蛋白質(zhì)，如選自用于"ADEPT"（antibody-directed enzyme prodrug therapy)應用的效 應酶；用于募集免疫系統(tǒng)的效應細胞和其它組分的蛋白；細胞因子，如IL-2、IFNy、IL-12、 TNFa a、IP 10等；促凝血因子，如組織因子、von Willebrand因子等；毒素，如蓖麻毒蛋白 A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、美登木素生物堿等?；蛘?，所述活性物質(zhì)也可能是細胞 毒性藥物，如auristatin類似物或阿霉素或放射性同位素（如 9°Y、131I、211At等），這種同位 素可與HPV16 E7結合多肽直接結合，或通過一種鰲合劑，如熟知的鰲合劑DOTA或DTPA而 與HPV16 E7結合多肽結合。
[0117] 在相關方面，本發(fā)明還提供了一種在體內(nèi)將具有抗癌活性的物質(zhì)導向表達 HPV16E7細胞的方法，包括施用給患者本文所述的所述活性物質(zhì)與與HPV16 E7結合多肽的 偶聯(lián)物。這種偶聯(lián)物在前文已被適當描述。
[0118] 本發(fā)明還包括使用所述的與HPV16 E7結合的多肽檢測樣品中的HPV16 E7蛋白。 例如，這種檢測可以用來診斷特征為表達HPV16 E7的疾病情況。檢測HPV16 E7的存在可以 在體內(nèi)也可以在體外進行。體內(nèi)診斷的優(yōu)選選擇是使用正電子放射X線斷層攝影術，PET。 被檢測的樣品可以例如是生物學液體樣品或組織樣品?，F(xiàn)在的普遍方法是用針對與HPV16 E7的抗體，這種方法可以適用于本發(fā)明的與HPV16 E7結合多肽，這種方法是組織化學方法 檢測與HPV16 E7的存在，用來鑒定新鮮、冷凍或福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品中與 HPV16 E7蛋白的表達。為了檢測HPV16 E7,本發(fā)明的多肽也能用作融合蛋白的一部分，其 中其它結構域是報告酶或熒光酶?；蛘撸湟部梢允潜灰粋€或多個熒光制劑和/或放射性 同位素標記的，任選通過鰲合劑標記。合適的放射性同位素包括 68GaJ6 Br、mIn、99TC、124I 和125I等。
[0119] 本發(fā)明還包括將所述的HPV16 E7結合多肽應用于檢測生物學液體樣品中 HPV16E7。這個方法包括以下步驟：（1)提供被檢測患者的生物學液體樣品，（2)將本文所述 的HPV16 E7結合多肽在能使所述多肽與樣品中存在的任何HPV16 E7結合的條件下加入樣 品中，（3)除去非結合的多肽，及（4)檢測結合的多肽。被檢測到的結合的多肽的量與樣品 中存在的HPV16 E7量相關。在步驟（2)中，HPV16 E7結合多肽可以以任何適宜的形式加 入到樣品中，包括例如這樣的情況，當HPV16 E7結合多肽被固定在一種固體支持物上，通過 其使樣品接觸，或HPV16 E7結合多肽存在于溶液中。
[0120] 所述的HPV16 E7結合多肽的其它應用還包括：檢測樣品中HPV16 E7的方法，包括 如下步驟：（1)提供一種懷疑含有HPV16 E7的組織樣品，例如冷凍切片或用福爾馬林包埋 的組織切片，（2)在適宜條件下加入本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽到所述樣品中，所述條件 為益于所述多肽與樣品中存在的任何HPV16 E7結合，（3)除去未結合的多肽，及（4)檢測 結合的多肽。檢測到的結合的多肽的量與樣品中存在的HPV16 E7的量相關。
[0121] 本發(fā)明還提供了一個診斷組織樣品中HPV16 E7表達的試劑盒，包括與報告酶（如 堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶）融合的、本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽、檢測酶活性的試劑、 和陽性和陰性對照組織切片。
[0122] 本發(fā)明還提供了一個診斷組織樣品中HPV16 E7表達的試劑盒，包括通過抗體檢測 的與標記（如flag標記或myc標記）融合的本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽、一個特異于標 記的一抗、特異于一抗并與報告酶偶聯(lián)的二抗、檢測酶活性的試劑，和陽性和陰性對照組織 切片。
[0123] 診斷應用的一個領域就是在體內(nèi)檢測癌細胞或其聚集物。本發(fā)明提供了一個進行 這種診斷的試劑盒，該試劑盒包括標記有一個鰲合物的、本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽、一種 診斷用放射性同位素（非限制性的例子是6SGa、76B r、mIn、MTc、124I和125I等），以及用于分 析摻入效率的試劑。
[0124] 如上所述，本發(fā)明涵蓋了本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽將活性物質(zhì)靶向表達HPV16 E7的細胞如某些類型的癌癥細胞的應用。本發(fā)明還提供了一個用于此目的的試劑盒，該試 劑盒包括用一個鰲合物標記的本發(fā)明的HPV16 E7結合多肽、一個治療性放射性同位素（非 限制性的例子是9°Y、mI、mAt)，以及用于分析摻入效率的試劑。
[0125] 本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含：有效量的本發(fā)明所述的對人乳頭瘤病毒 16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽或靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，和藥學上 可接受的載體。
[0126] 如本文所用，"藥學上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應（如毒性）的，即具有合理的效益/風險比的物質(zhì)。術語"藥學上可接受的載體"指 用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身 并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所 熟知的。在 Remington' s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J· 1991)中可找到 關于藥學上可接受的載體的充分說明。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、 鹽水、甘油和山梨醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤滑劑、助流劑、潤濕 劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，如白蛋白等。
[0127] 可將所述的組合物制成各種適合于哺乳動物給藥的劑型，所述劑型包括但不限 于：注射劑、膠囊劑、片劑、乳劑、栓劑。
[0128] 在使用時，是將安全有效量的本發(fā)明所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有 結合親和力的多肽或靶向性分子施用于哺乳動物（如人），其中該安全有效量通常至少約1 微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約1 微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況 等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0129] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0130] 實施例1、HPV16E7結合多肽的文庫構建及篩選研究
[0131] 構建噬菌體展示HPV16 E7結合多肽的隨機組合文庫，即許多不同的SPA結構域相 關多肽的文庫，從該文庫中篩選HPV16 E7結合多肽，并對其親和性進行了鑒定。
[0132] 1、HPV16 E7結合多肽的隨機組合噬菌體展示文庫的構建和鑒定
[0133] 根據(jù)野生型SPA-Z的氨基酸序列及結構（Nilsson B等，Protein Eng. 1987 ; 1 (2) : 107-113)，針對其三個螺旋結構區(qū)對應的編碼序列設計隨機引物，利用PCR方法擴增 獲得可導致隨機氨基酸突變的SPA編碼序列，命名為SPA-N。
[0134] 2、pCANTAB5E/SPA-N 重組質(zhì)粒的構建
[0135] 選擇以M13噬菌體系統(tǒng)（購自北京寶科維食安生物公司）進行親和體的表達，因 此以PCANTAB5E (購自北京寶科維食安生物公司）為載體，通過Sfi I和Not I將獲得的 SPA-N編碼序列克隆至pCANTAB5E載體的Sf i I/Not I位點內(nèi)，構建pCANTAB5E/SPA-N重組 質(zhì)粒，轉化至感受態(tài)E. coli TGl細胞中，涂布2YT-A平板，37°C培養(yǎng)過夜。即為初級庫，標 記為affibody初級庫備用。結果隨機挑取平板上長出的28個單克隆菌落，將提取質(zhì)粒用 Sfi I和Not I雙酶切鑒定為陽性克隆，經(jīng)測序和分析其隨機性。
[0136] 結果：根據(jù)測序結果，送測序的28個克隆中有測序結果的為26個克隆，其中連接 成功21個克隆，隨機性完全不同，故重組率為21/26 = 88%;多樣性為21/21 = 100%。同 時，取上述轉化后培養(yǎng)的菌液，用2 X YT培養(yǎng)液倍比稀釋（1:10,1: IO2……），涂布SOB-AG平 板，計算平板上的單菌落數(shù)，推算庫容。通過增加連接轉化次數(shù)累計庫容，多次連接轉化后 使克隆數(shù)達到2. 4X IO5個Z蛋白變體（affibody分子），其在第9、10、11、13、14、17、18、24、 25、27、28、32、35和43位具有隨機的氨基酸殘基。
[0137] 3、HPV16 E7結合多肽的篩選和滴度測定
[0138] 將純化的HPV16 E7蛋白包被96孔酶標板，經(jīng)封閉、加噬菌體文庫（初級庫）孵育、 再加入E. coli TG137°C，輕搖溫育；取100 μ 1，用2*YT培養(yǎng)基做梯度倍比稀釋，取稀釋液 100 μ 1涂布SOB-AG平板，30°C過夜，計數(shù)結合噬菌體感染菌落數(shù)，計算HPV16E7結合噬菌體 滴度；結果平板可見菌落，滴度是1〇 2;此時完成第一輪淘洗，另部分菌液加10 w輔助噬菌體 M13K07(購自北京寶科維食安生物公司）和卡那霉素培養(yǎng)過夜，離心后取上清經(jīng)0. 22 μπι濾 膜過濾，獲得HPV16 Ε7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為一級affibody庫。重復上述4輪 富集篩選，分別獲得HPV16 E7分子親和篩選后的噬菌體文庫，為二級，滴度分別為I X IO6; 在二級庫的基礎上再重復上述4輪富集篩選，為三級文庫，滴度為I X 108。同時設置不加噬 菌體的空白對照作同步篩選。
[0139] 4、HPV16 E7結合多肽單克隆噬菌體的制備及ELISA鑒定
[0140] ELISA用于篩選表達HPV16 E7結合affibody分子的噬菌體。將lOμg/ml的 HPV16E7蛋白以200 μ 1/孔包被96孔酶標板，4°C過夜；PBS洗滌，用2%脫脂奶粉封閉2h ; 洗滌，取四輪篩選后獲得的噬菌體與等體積的3 %脫脂奶粉混勻，200 μ 1/孔，37°C，2h。洗 滌，加入 1:10000 稀釋的 HRP/anti-M13 酶標二抗（兔抗 M13, Abcam#ab6188)，200 μ 1/ 孔， 37°C，Ih ;洗滌，加入 OPD 顯色液 200 μ 1/ 孔，37°C，15min ;2M H2S0450 μ 1/ 孔，終止反應；置 酶標儀（ELx800TM，ΒΙ0-ΤΕΚ，Winooski，USA)讀取 0D490 值。
[0141] 在四輪淘選循環(huán)中選擇結合抗原的affibody分子，經(jīng)過這四輪選擇循環(huán)，進一步 用噬菌體ELISA檢測以分析其HPV16 E7結合活性，用高于0. 5的0D490的ELISA值為選擇 標準，鑒定編碼HPV16 E7結合多肽的噬菌體，選擇高于這個ELISA信號值的150個克隆，并 與另外隨機挑選12個無 ELISA值的克隆進行DNA序列分析。
[0142] 5、HPV16 E7親和體分子的序列檢測及篩選
[0143] 共150個單克隆送中國上海生工公司測序，測序引物為CATATGGTTGACAACAAATTCA ACAAAGAA(SEQ ID NO: 12)。測序結果用DNA STAR軟件分析對標準序列SPA-Z與SPA-N進 一步分析其三個螺旋區(qū)的隨機性和多樣性。結果獲78個完全正確克隆序列，有部分序列完 全重復，兼并重復序列后獲得65個序列完全正確的克隆。
[0144] 根據(jù)DNA測序結果進行分析，在上述測序正確的65個克隆中，選擇與HPV16 E7蛋 白結合活性最強的4個單克隆噬菌體（即呈現(xiàn)HPV16 E7親和體分子的單克隆噬菌體）的 DNA序列（分別為 ZhPV16E7 :127、Zhpv16E7 :301、Zhpv16E7 :384、ZhPV16E7 :745 )作為靶目標進行研究，氨基酸序 列為SEQIDN0:1、2、3、4，如圖1，它們的編碼序列如SEQIDN0:6-9)。下一步用于HPV16 E7結合親和體的分子克隆和表達及功能檢測。
[0145] 本發(fā)明利用噬菌體展示技術，將構建的affibody隨機肽庫，展示在噬菌體表面， 以HPV16 E7蛋白為靶標蛋白，進行HPV16 E7親和體的篩選。經(jīng)過四輪淘洗，每輪均經(jīng)過： 親和-洗滌-擴增，且靶蛋白HPV16 E7蛋白的濃度隨著淘洗次數(shù)的增加而降低，50 μ g/ ml、30 μ g/ml、15 μ g/ml、10 μ g/ml從而能更好的篩選出親和力高的親和體，而隨著每輪的 大量擴增，親和體每輪均會有IO2的選擇性富集。經(jīng)ELISA進一步篩選出OD值讀數(shù)較高 (A49Q>0. 5)的單克隆測序，將測序完整正確的HPV16 E7 affibody序列通過NTI軟件比對分 析，而后隨機挑取親和力較高的4個單克隆進行下一步的研究，此4個克隆的氨基酸序列分 析與標準的野生型比對，三個螺旋結構可變區(qū)域出現(xiàn)了約13-14個氨基酸的改變。。
[0146] 實施例2、HPV16E7結合多肽重組質(zhì)粒構建和原核蛋白表達及純化
[0147] 如前選擇了具有較高ELISA讀數(shù)的4個克?。▓D1中的affibody Zhpv16 E7:127、 ZhPV16E7:301 ' Zhpv16 E7:384' Zhpv16 e7：745 )，為了對篩選的affibody分子進行功能檢測，對其進行重 組質(zhì)粒構建、原核蛋白的表達及其鑒定，并制備純化蛋白。
[0148] I. pET21a(+)/affibody的重組質(zhì)粒構建和鑒定
[0149] 參照 affibody 基因序列（GenBank :GY324633. 1)設計 PCR 引物，上游引物 5'GGGA ATTCCATATGGTTGACAACAAATTCAACAAAGAA 3'（SEQ ID NO: 13,下劃線表示 Ned I 酶切位點）， 下游引物 5' CCGGAATTCCGTTTCGGAGCCTGAGCGT3' (SEQ ID NO: 14,下劃線表示 Xho I 酶切位 點）；以篩選的測序正確四級庫單克隆affibody ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhpV16 E7: 745 為模板，通過 PCR 擴增 affibody 目的基因 （SEQ ID N0:6-9)，同時將 affibody Zwt(SEQ ID NO: 1)經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后全序列（SEQ ID NO: 10)合成作為陰性對照。將PCR擴增的 目的基因經(jīng)Nde I和Xho I克隆至pET21a⑴載體，構建pET21a(+)/ZHPV16 E7的重組質(zhì)粒， 并經(jīng)測序鑒定（圖2,圖3)。
[0150] 2.原核蛋白生產(chǎn)
[0151] 將重組質(zhì)粒轉化至大腸桿菌（E. coli)BL21(DE3)中，37°C，培養(yǎng)16h;加 0. 8mM異 丙基硫代-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)(默克公司，德國）IPTG誘導培養(yǎng)6h表達帶有 His標簽的Zhpv16e7 affibody及Zwt affibody蛋白。經(jīng)誘導后表達的重組蛋白，用鎳螯合親 和層析膠體（Ni-NTA Agarose) (QIAGEN公司，美國）親和層析法純化并經(jīng)SDS-PAGE分析鑒 定。
[0152] 結果，利用分子生物學技術成功構建了 pET21a(+)/Zhpv16 E7重組質(zhì)粒，并采用原核 表達系統(tǒng)制備了純化的Zhpv16 E7:127、ZHPV16 E7:3Q1、ZHpV16 E7:384、ZHPV16 E7: ?ms及ZWTaf f ibody重組融合 蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析（圖4)證實，出現(xiàn)考馬斯亮藍濃染的條帶分子質(zhì)量約7. 8kDa， 與預期Zhpv16 E7 affibody多肽的分子質(zhì)量大小一致。本發(fā)明選擇pET21a(+)載體，在設計 上利用其多克隆位點的起始酶位點為NdeI (CATATG)，其密碼子ATG即為目的蛋白翻譯的氨 基酸（M)起始密碼子，這樣利用原核表達系統(tǒng)表達的蛋白即為全長的目的蛋白Z hpv16 E7而不 帶載體蛋白片段，避免了載體蛋白對實驗結果的干擾。
[0153] 實施例3、Zhpv16 E7 affibody多肽與HPV16 E7蛋白的結合
[0154] 為鑒定Zhpv16 E7 affibody多肽與HPV16 E7蛋白結合的特異性，利用表面等離子共 振技術（SPR)分析師選的四個 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745分子及其對照 Zwt affibody與靶蛋白HPV16 E7的特異性結合。
[0155] HPV16 E7蛋白的制備：用PCR方法從宮頸癌組織中擴增HPV16 E7基因，克隆至 pET21a(+)載體，構建pET21a(+)/HPV16 E7重組質(zhì)粒，并且測序鑒定；將重組質(zhì)粒轉化至大 腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導后表達重組蛋白，用Ni-NTA親和層析法純化并經(jīng)SDS-PAGE 及Western blot分析鑒定（參見王冰冰等，HPV16型E7重組蛋白的表達及其多克隆抗體 的制備；細胞與分子免疫學雜志，2014(2) :167-170)。結果，成功制備了HPV16 E7純化蛋白 及其多克隆抗體，并進行了特異性驗證（圖5 A-C)。
[0156] Zhpv16 E7 affibody多肽的傳感器分析：在ProteOn XPR36系統(tǒng)儀器（Bio-Rad公司） 進行HPV16 E7蛋白和Zhpv16 E7 affibody多肽之間相互作用的親和力分析，即利用表面等離 子共振技術（SPR)分析上述帶有His標簽的Zhpv 16 E7:127' Zhpv16 E7:301' Zhpv16 ￡7:384' Zhpv16 e7：745 及Zwt affibody分子（作為對照）與HPV16 E7之間的相互作用。根據(jù)操作手冊，在不同的 流動池上通過偶聯(lián)于GLH芯片將HPV16 E7重組蛋白固定，進行與篩選多肽之間的親和力測 定。第6個流動池表面被激活和失活以作為注射時的空白對照。affibody分子分別進行六 個不同梯度濃度稀釋與HPV16 E7重組蛋白結合，即Zhpv16 E7:127濃度為I. 0nM、2. 0nM、4. OnM、 8· 0ηΜ、16· 0ηΜ、32· 0ηΜ、64·0ηΜ，Zhpv16 四:301濃度為 0·7ηΜ、1·4ηΜ、2·8ηΜ、5·6ηΜ、11·2ηΜ、 22·4ηΜ、44·8ηΜ，ΖΗΡν?6 四:384濃度為 0·6ηΜ、1·2ηΜ、2·4ηΜ、4·8ηΜ、9·6ηΜ、19·2ηΜ、38·4ηΜ， Zhpvi6 Ε7:745濃度為 1· !ηΜ、2· 2ηΜ、4· 45ηΜ、9· 1ηΜ、18· 3ηΜ、36· 5ηΜ、73· 2ηΜ 及 Zwt affibody 分 子濃度為 1. 0ηΜ、2. 0ηΜ、4. 0ηΜ、8. 0ηΜ、16. 0ηΜ、32. 0ηΜ、64. ΟηΜ，所有的分析在 25°C進行，流 速為30 μ 1/min，注射標本的容量為200 μ 1，并以流速30 μ 1/min隨機順序注射，隨后用 HCl (BI0-RAD 貨號：#176-2250100mM HC1)洗滌 6min (解離），利用 ProteOn Manager?軟件 (BIO-RAD)的1 :1朗繆爾結合模型分析結合曲線（感應圖）。
[0157] 采用表面等離子共振技術（SPR)檢測，分析重復兩次檢測的結果，親和力平衡解 離常數(shù)KD均值， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: ?ms及Zwt affibody分子分別的為 1. 91X10 6mol/L、l. 18X10 7mol/L、l. 73X 10 6mol/L、5. 02X 10 5mol/L及 4. 63X 10 2mol/L。 結果，純化的 ZhPV16 E7:127、ZHPV16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: 745蛋白分子與HPV16 E7重組蛋白具 有相互作用的能力，如圖6A-E顯示，較Zwt affibody分子解離常數(shù)KD值相差1000至10000 倍。經(jīng)篩選獲得的 ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16E7:384、Zhpv16 E7: 745均能與HPV16E7重組蛋白結 合，結合的親和力均已經(jīng)達到nmo I/L級水平，與此同時野生型的Zwt affibody分子和HPV16 E7重組蛋白幾乎沒有結合力，表明篩選出的4個affibody分子與HPV16 E7重組蛋白具有 較高的特異親和力，同時表明原核誘導表達的Zhpv16 E7 affibody分子與HPV16 E7重組蛋白 均具有生物活性。
[0158] 因此，本發(fā)明的 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745蛋白分子與 HPV16E7 革巴蛋白分子具有相互結合和識別能力。從蛋白水平驗證了Zhpv16 E7:127、ZHPV16 E7:3Q1、ZHPV16 E7:3S4、 Zhpv16 E7:745分子與HPV16E7靶蛋白之間的親和力。
[0159] 實施例4、Zhpv16 E7 affibody多肽與表達HPV16 E7蛋白細胞的結合
[0160] 為進一步驗證篩選的Zhpv16 E7 affibody多肽與HPV16E7靶蛋白的親和力，利 用表達HPV16 E7的宮頸癌細胞作為研究對象，即人宮頸癌細胞系Siha(ATCC:HTB-35， 表達HPV16E7的宮頸癌細胞）、Caski(ATCC:CRL-1550，表達HPV16和18E7的宮頸癌 細胞）和HeLa229 (ATCC :CCL-2 HPV 18陽性的宮頸癌細胞），并利用黑色素瘤細胞系 A375(ATCC:CRL-1619, HPV陰性的黑色素瘤細胞）作為對照，進一步驗證ZHPV16E7:127、Zhpv16 E7:3〇n Zhpv16 E7:384' Zhpv16 E7. 745蛋白分子與HPV16 E7蛋白分子之間的結合。
[0161] 細胞培養(yǎng)：人宮頸癌細胞系Caski、Siha、HeLa229及黑色素瘤細胞系A375細胞培 養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，2. 05mM L-谷氨酞胺和100IU/ml青霉素及IOOyg/ ml鏈霉素）。細胞在37°C含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24h，細胞狀態(tài)良好時進行免疫熒 光檢測。
[0162] 細胞免疫熒光檢測：將滅菌的蓋玻片放入六孔板中，將培養(yǎng)至24h的Caski、Siha、 拖1^229、4375細胞調(diào)整數(shù)目為1\10 6/孔，5%〇)2、37°(：培養(yǎng)2411至單層細胞。加入終濃 度為 50 μ g/ml Zhpv16 E7 affibody 多肽于上述含 10% FBS 培養(yǎng)基中，5% C02、37°C培養(yǎng) 6h， 吸出培養(yǎng)液，用預冷PBS洗滌；采用2%多聚甲醛固定單層細胞10min，PBST洗滌3次，加入 0. 3% Triton X-100打孔lOmin，洗滌后加入10% FBS+1640培養(yǎng)基37°C封閉lh，洗滌；分 別加入鼠抗His單克隆抗體（ABR公司，美國，I :2000)、兔抗SPA血清（1:500)及HPV16E7 兔血清抗體（I :500)，置37°C lh，洗滌后加 FITC-羊抗兔IgG二抗（上海聯(lián)科生物技術公 司，中國）和PI (索萊寶公司，北京）2 μ 1/孔lh，避光，洗滌后加蓋玻片并用緩沖甘油封片， 共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS SP2microscope德國）觀察并拍片（400X)。
[0163] 用純化的 ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7: 745孵育HPV16 E7蛋白表達陽 性宮頸癌Caski、Siha細胞6h后，分別用His單克隆抗體、SPA兔血清分析重組affibody 蛋白與細胞株表達的HPV16 E7重組蛋白的識別和結合能力，同時設置HPV16 E7蛋白表達 陰性的人黑色素瘤A-375細胞株和HPV18 E7陽性的宮頸癌HeLa229細胞株作為對照，與此 同時設置HPV16 E7兔血清抗體作為陽性對照。
[0164] 結果顯示， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7:745 蛋白孵育的Siha、Caski細 胞株的細胞核膜和細胞漿內(nèi)核周可見多個強綠色的點狀或團塊狀熒光蛋白（圖7A-D)，與 HPV16 E7兔血清抗體孵育的結果一致（圖7 E)，而HeLa229細胞和A375細胞株均未見明 顯的熒光團塊（圖7A-E)。表明， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZHpV16 E7: 745重組蛋白能特 異性識別細胞中天然表達HPV16 E7蛋白，本發(fā)明制備的 ZhPV16 E7:127' Zhpv16 ￡7:301' Zhpv16 ￡7:384' Zhpv16 E7:745重組蛋白和活細胞表達的HPV 16 E7蛋白有很強的特異結合能力。
[0165] 上述結果進一步從細胞水平驗證了 ZhPV16 E7:127、ZHPV16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: 745重 組蛋白與HPV16 E7蛋白具有很強的靶向結合特異性和親和力。
[0166] 實施例5、ZHPV16 E7 affibody多肽在宮頸癌細胞荷瘤裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向
[0167] 在本實施例的實驗中，選擇上述affibody分子中的Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽作 為檢測對象，用近紅外熒光染料DyLight755 NHS Ester(Thermo Fisher公司，美國，貨號 62278)標記 ZHPV16E7:3S4 affibody 多肽，并將其注射到攜帶 Siha、Caski、HeLa229 及 A375 移 植腫瘤的小鼠體內(nèi)，進行Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽生物分布研究，并對裸小鼠成像定位以 研究標記多肽的靶向特性。
[0168] 動物腫瘤模型的制備：選擇6-7周齡BALB/c-nu小鼠（購于上海斯萊克實驗動物 有限責任公司，合格證SCXK (滬）2012-0002)，體重為15-18g)。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期，生長 狀態(tài)良好的Siha、Caski、HeLa229及A375用EDTA(胰酶）消化后，用含10%血清細胞培養(yǎng) 液進行吹打、收集，常溫1000轉/min離心3min，將離心細胞用不含血清的培養(yǎng)液重懸并計 數(shù)，配制成IX l〇7ml，取0. 2ml于背部近右前臂或下肢近腹股溝皮下注射接種裸鼠。每隔3 天觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動力、反應、飲食、體重及皮下接種區(qū)域外觀及觸感，并以電子游 標卡尺測量瘤體大小直徑。待腫瘤長至300-500mm 3用于Zhpv16 E7 affibody多肽的生物分 布和成像研究。
[0169] 結果顯示，裸鼠皮下接種上述細胞均可見明顯的腫瘤生長，22只裸鼠全部成瘤。3 周后，腫瘤最大直徑達到300-500mm3時開始實驗。
[0170] Zhpv16 E7:3S4多肽近紅外焚光染料Dylight755標記及鑒定：按照說明書步驟進行 將Dylight755的標記并鑒定。即取91yg DyLight755 NHS-Ester染料溶解入273 μ1 DMF有機溶劑后，加入透析后的Zhpv16 E7:3S4 affibody蛋白（300 μg/ml，共lml)溶液中，避 光，4°C條件下反應lh，將反應后的溶液避光透析，每隔半小時更換透析液（磷酸鹽緩沖 液，pH7. 2-7. 4)，2h后收集Dy755-ZHPV16E7:3S4,光蛋白，取樣測蛋白濃度為100 μ g/ml，采用 SDS-PAGE 電泳進行鑒定。分別取 Dy755 標記的 ZHPV16E7:3S4(Dy755-ZHPV16E7:3S4) 1 μ g、0. 5 μ g 和 0. 1 μ g，用磷酸鹽緩沖液稀釋至10 μ 1，同時取10 μ I Dy755_DMF染料做陰性對照，分別加 入10 μ 1蛋白loading buffer中，于冰上避光條件下電泳，并將凝膠放于活體成像儀（CRi Maesro 2.10，in-vivo fluorescenceimaging system)中，激發(fā)光濾片為 671_705nm，發(fā)射 光濾片為750 longpass，采用8bit和2X2模式，用730-950nm波長間隔IOnm每次曝光 5000ms收集圖像信息，用Maesro軟件進行圖像處理及分析。經(jīng)鑒定的Dy755-Z HPV16E7:3S4分 裝于棕色離心管，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0171] 結果顯示，標記蛋白 Dy755-ZHPV16E7:3S4經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，1. 0 μ g、0. 5 μ g 和 0. 1 μ g的泳道在相對分子質(zhì)量為7. 8 kDa處出現(xiàn)單一的染色條帶，但Dylight755染料無條 帶（圖8A)，經(jīng)小動物活體成像儀掃描，在相應1. 0 μ g和0. 5 μ g位置處均出現(xiàn)單一的熒光 條帶（圖8B)。表明，近紅外熒光染料Dylight755標記Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽成功。
[0172] Zhpv16 E7:3S4 affibody多肽在腫瘤細胞異種移植物的裸鼠中的生物分布和腫瘤靶向 作用：待裸鼠的腫瘤長至300-500mm3時將裸鼠帶出SPF屏障系統(tǒng)，用10%水合氯醛腹腔注 射誘導麻醉，待其進入深度麻醉狀態(tài)后經(jīng)尾靜脈注射10 μ g Dy755-ZHPV16E7:3S4熒光蛋白，置 于小動物活體成像儀（CRi Maesro 2. 10, in-vivo fluorescence imagingsystem)中成像， 并用0. 8-1. 0 μ Ι/g水合氯醛維持麻醉狀態(tài)，以保證小鼠在成像過程中處于深度麻醉，在 5min、10min、15min、30min、45min、lh、I. 5h、2h、4h、6h、8h 和 24h 連續(xù)成像觀察（圖 9A-B)。 并于24h后處死并解剖小鼠，取腫瘤組織、肝臟、脾臟、腎臟、和大腦等組織臟器置于成像系 統(tǒng)。成像的激發(fā)光濾片為671-705nm，發(fā)射光濾片為750 longpass，采用8bit和2 X 2模式， 730-950nm波長間隔IOnm每次曝光5000ms收集圖像信息，并用Maesro軟件進行圖像處理 及分析，分別顯示背景自發(fā)熒光和目標熒光信號，然后測量其熒光值，將背景自發(fā)熒光設置 為黑色，目標熒光信號設置為紅色，最后將兩種色彩相疊加。所得數(shù)據(jù)用GraphPAD軟件進 行處理。
[0173] 結果，Siha和Caski荷瘤裸鼠在尾靜脈注射50yg Dy755_ZHPV16E7:3S4熒光蛋白 IOmin后，腫瘤部位即出現(xiàn)明顯的熒光信號，lh-1. 5h熒光信號最完整，與腫瘤大小對應，8h 時腫瘤的熒光成像明顯變小，24h時仍有熒光成像。除腎臟外，腫瘤組織中的熒光強度于 30min時開始升高，約至6h均顯著高于其他各臟器的熒光強度，盡管至24h熒光強度已經(jīng)減 弱，但仍然高于其他各臟器。HeLa229和A-375對照組觀察期間均未檢測到有明顯區(qū)別于背 景熒光的熒光信號。實驗組和對照組裸鼠肝脾相對應的部位在靜脈注射后Dy755-ZHPV16E7:3S4 熒光蛋白后可見明顯的熒光信號，隨著染料在小鼠體內(nèi)不斷代謝，信號逐漸降低，至24h已 經(jīng)減弱消失；而腎臟在靜脈注射后Dy755-Z HPV16E7:3S4焚光蛋白后IOmin直至24h，可見最強的 熒光信號（圖9)。分析腫瘤組織熒光信號強度發(fā)現(xiàn)，Siha和Caski細胞荷瘤小鼠在30min 左右信號強度最高，之后逐漸降低，分別至6h和8h左右信號強度最為明顯（圖9)。
[0174] 在尾靜脈注射50 μ g Dy755-ZHPV16E7:3S4熒光蛋白24h時解剖小鼠，取實驗組和對 照組的腫瘤、心臟、肺、脾臟、肝臟及腎臟等重要組織器官進行成像，發(fā)現(xiàn)腫瘤、腎臟、心、腦、 腸、肺、肌肉和骨骼等組織中熒光信號分布與強度與活體成像結果基本相一致（圖10A-D)， 且在Siha和Caski荷瘤小鼠中，腫瘤組織的熒光強度與其他各臟器的熒光強度有顯著性差 異（p〈0. 05)，而在HeLa229和A375荷瘤小鼠中腫瘤組織的熒光強度與其他各臟器的熒光強 度無顯著性差異（P>〇. 05)。荷瘤小鼠在觀察期間狀態(tài)良好，未見明顯毒性反應。
[0175] 結果表明，標記Dylight755-ZHPV16E7:3S4多肽具有靶向結合HPV16E7表達陽性腫瘤的 特性，且沒有嚴重的毒副作用。
[0176] 實施例6、Zhpv16 E7 affibody多肽的生物學功能研究
[0177] 為研究Zhpv16 E7 affibody多肽體外細胞生長是否具有抑制作用，本發(fā)明選擇Siha 腫瘤細胞株作為實驗對象。利用CCK-8試劑檢測細胞生長過程中各時間點的細胞生存率進 行檢測，并利用Grahpad primer5. 0軟件計算Zhpv16e7 affibody多肽的IC50〇
[0178] 制備Siha腫瘤細胞懸液并接種于96孔細胞培養(yǎng)板，0. 5X IO4/孔。培養(yǎng)24h后， 加入1 μ g/ml放線菌酮、5%胎牛血清，然后分別加入4個affibody蛋白即Zhpv16 E7:127、ZHPV16 E7:3〇i、Zjjpvie E7:384、Zfjpvie E7:745,分力lJ設置 100 l·*· g/ml、50 y g/rnl、25 y g/rnl、10 y g/rnl、I y g/rnl 五個濃度組，并以Zwt affibody為對照組，同時設培養(yǎng)基對照，采用CCK-8試劑盒（Cell Counting Kit-8, GC-0030, CN)檢測細胞的生存率，即在加入結合多肽后0、1、3、6、12、24、 36、48和72h，加入CCK-8試劑，10 μ 1/孔，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30min后置于酶標儀 A450處讀數(shù)。每組均設3個復孔，并進行3次重復實驗。細胞存活（Cell viability)計 算方法為：Cell viability (%) = (affitoxin384 組的 OD 值-培養(yǎng)基組 OD 值）/(SPA-Zwt 對照組OD值-培養(yǎng)基組OD值）X 100% ;同時用GraphPad primer5. 0軟件來計算細胞生 長存活的IC50值。
[0179] 結果， ZhPV16 E7:127、 Zhpv16 E7:301、 Zhpv16 E7:384、 Zhpv16 E7:745 多肽對Siha腫瘤細胞的 生長均有抑制作用（圖 12A-D)，其 IC50 分別是 2. 882±0. 661μΜ、3. 876±0. 125μΜ、 2.725±0.358 以]\1和 1.835±0.233 4]\1(圖11厶-0)。顯不，2("16￡7:127、2隱 6￡7:3。1、2隱6四:384、 Zhpv16 Ε7:745對表達HPV16 Ε7陽性的宮頸癌細胞Siha均具有抑制作用，并于6h其抑制細胞 生長作用表現(xiàn)為最強，至72h，與Zwt和培養(yǎng)基對照仍然有顯著性差異（p〈0. 001);同時顯示， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhpV16 E7: 745多肽對Siha細胞的抑制作用具有濃度依賴性， 100 μ g/ml、50 μ g/ml和10 μ g/ml組之間的細胞生存率具有顯著性差異（p〈0. 001)，同時三 組劑量組與Zwt和培養(yǎng)基對照組的細胞生存率比較也具有顯著性差異（p〈0. 001)。
[0180] 以上結果表明， ZhPV16 E7:127、Zhpv16 E7:301、Zhpv16 E7:384、ZhPV16 E7: 745多肽具有抑制Siha細 胞生長的特性，進一步驗證了 Zhpv16 E7:127、Zhpv16 E7:3Q1、Zhpv16 E7:384、Zhpv16 E7:745具有體外 HPV16 E7靶向結合特異性。
[0181] 實施例7、Zhpv16 E7 affitoxin蛋白對宮頸癌細胞荷瘤裸鼠的保護作用
[0182] 在本實施例中，利用Zhpv16 E7的靶向作用，攜帶經(jīng)改構具有細胞毒作用的綠膿桿菌 外毒素 A (pseudomonas exotoxinA，PEA)的活性片段PE38KDEL作為細胞毒分子（Gao J，et al. Mol Cancer Ther，2008, 7 (10) : 3399-3407)。構建 Zhpv16 E7/PE38KDEL 原核表達載體，并 利用原核表達系統(tǒng)制備并純化了 ZHPV16E7/PE38KDEL蛋白，即affitoxin，對affitoxin與革巴蛋 白HPV16 E7的特異性結合，及靶向作用進行和驗證，并將其進一步注射到攜帶Siha(ATCC : HTB-35,表達HPV16的宮頸癌細胞）、Caski (ATCC :CRL-1550,表達HPV16和18的宮頸癌細 胞）、HeLa229(ATCC :CCL-2 HPV 18 陽性的宮頸癌細胞）和 A-375(ATCC:CRL-1619，HPV16 陰 性的黑色素瘤）移植腫瘤的小鼠體內(nèi)，進行腫瘤保護和治療實驗。同時用Zwt affitoxin作 對照。
[0183] Zhpv16 E7 affitoxin 蛋白的制備和鑒定：選擇 Zhpv16 E7 affibody 作為 HPV16 E7 的 靶向分子，利用柔性肽（Gly4Ser) 3在其C末端連接PE38 (KDEL)，將柔性肽C端連接經(jīng)原核 密碼子優(yōu)化的PE38 (KDEL)的全序列（SEQ ID NO: 11)，PE38 (KDEL)的全序列DNA合成并經(jīng) EcoRI和XhoI位點克隆至pET21a(+)載體，構建pET21a(+)/PE38(KDEL)載體，進一步通 過分子克隆方法將 ZhPV16 E7:127、 Zhpv16 E7:301、 Zhpv16 E7:384、 Zhpv16 E7: 745及Zwt編碼序列經(jīng)NedI和 EcoRI克隆至pET21a(+)/PE38 (KDEL)載體構建重組質(zhì)粒并測序鑒定，進一步將其轉化至大 腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導后表達重組蛋白，用Ni-NTA親和層析法純化并經(jīng)SDS-PAGE 及Western Blot分析鑒定。
[0184] 結果，成功構建了 pET21a(+)/ZHPV16 E7affitoxinl27、301、384、745 及 pET21a(+)/ ZwtafTit〇xin重組質(zhì)粒（圖13);該重組質(zhì)粒在原核表達系統(tǒng)表達并獲得純化的 ZHPV16E7affitoxinl27、Zhpv16e7 affitoxin301、Zhpv16e7 affitoxin384、Zhpv16e7 affitoxin745 及Zwtaffitoxin重組蛋白，SDS-PAGE電泳提示該蛋白的分子質(zhì)量約為45 kDa(圖14A、 B) ;Western blot結果（圖14C、D)顯示，His單抗和兔SPA-Z多抗作為一抗，在分子質(zhì)量 約為 45kDa 均處出現(xiàn)單一條帶，提示 Zhpv16e7 affitoxinl27、Zhpv16e7 affitoxin301、Zhpv16e7 affitoxin384、Zhpv16e7 affitoxin745 及 Zwt affitoxin 重組蛋白能特異性識別兔 SPA-Z 多克 隆血清抗體。結果表明，Zhpv16e7 afTitoxinl27、ZHPV16E7 afTitoxin301、ZHPV16E7afTitoxin384、 Zhpv16e7 affitoxin745及Zlrt affitoxin重組純化蛋白制備成功。
[0185] Zhpv16e7 affitoxin蛋白與革巴蛋白結合特性研究：為驗證Zhpv16e7 affitoxin蛋白與 HPV16 E7結合的特性，采用SPR和細胞免疫熒光方法進一步驗證。選擇Siha(HPV16+)、 Caski(HPV16+、HPV18+)、HeLa229(HPV16-、HPV18+)及黑色素瘤細胞 A375 作為陰性對照， 方法同實施例4。即將培養(yǎng)至24h的Caski、Siha、HeLa229、A375細胞，調(diào)整細胞數(shù)目為 I X IO6/孔，培養(yǎng)24h至單層細胞，加入終濃度為50 μ g/ml的Zhpv16 E7aff itoxinl27、Zhpv16 E7affitoxin30U Zhpv16 E7affitoxin384、Zhpv16 E7affitoxin745 及 Zwt affitoxin 蛋白，5 % C02, 37°C培養(yǎng)6h，經(jīng)固定、洗滌后，0· 3% Tritonx-100打孔，加入10% FBS+1640培養(yǎng)基37°C 封閉lh，用PBS洗滌3次；分別加入鼠抗His單克隆抗體（ABR公司，美國，I :2000)、兔抗 SPA血清（1:500)及兔抗PE38KDEL血清（I :5000)，置37°C lh，洗滌后加 FITC-羊抗兔IgG 二抗（上海聯(lián)科生物技術公司，中國）和PI (索萊寶公司，北京）2 μ 1/孔lh，避光，洗滌 后加蓋玻片并用緩沖甘油封片，共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS SP2 microscope德國）觀 察并拍片（40X)。同時，采用不加 Zhpv16 E7 affitoxinl27、Zhpv16 E7 affitoxin301、Zhpv16 E7 affitoxin384、ZHPV16 E7 affitoxin745 蛋白，以兔 HPV16 E7 血清抗體為一抗（I :5000)作為 陽性對照。
[0186] 結果，經(jīng)細胞免疫熒光檢測，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察顯示，Zhpv16 E7affitoxinl27、Zhpv16 E7affitoxin301、Zhpv16 E7affitoxin384、Zhpv16 E7 affitoxin745 蛋白 孵育的Siha、Caski細胞株的細胞核膜和細胞漿內(nèi)核周可見多個綠色的點狀或團塊狀熒 光蛋白，與HPV16 E7兔血清抗體孵育的結果相一致，而HeLa229細胞和A375細胞株均未 見明顯的熒光團塊（圖15 A-D)，同時Zwt affitoxin蛋白孵育的Siha、Caski、HeLa229及 A375 細胞株均未出現(xiàn)焚光團塊。表明，Zhpv16 E7affitoxinl27、ZHPV16 E7affitoxin301、ZHPV16 E7 affitoxin384、ZHPV16 E7 affitoxin745 重組蛋白識別 HPV16 E7,而不識別 HPV18 E7,即特異 性識別活細胞中天然表達HPV16 E7蛋白的能力保持不變，且與活細胞表達的天然HPV16 E7 蛋白有很強的結合能力。本實施例進一步從細胞水平驗證了 Zhpv16 E7 affitoxinl27、Zhpv16 E7 affitoxin301、ZHPV16 E7 affitoxin384、ZHPV16E7 affitoxin745重組蛋白具有與活細胞表達 的HPV16 E7蛋白具有很強的親和力。
[0187] 進一步在 ProteOn XPR36 系統(tǒng)儀器（Bio-Rad 公司）進行 Zhpv16 E7affitoxin 蛋 白和HPV16E7之間相互作用的親和力分析，即利用表面等離子共振技術（SPR)分析上述 His 標簽的 Zhpv16e7 affitoxinl27、Zhpv16 E7 affitoxin30U Zhpv16 E7 affitoxin384、Zhpv16 E7affitoxin745及Zwt affitoxin分子（作為陰性對照）與HPV16 E7之間的相互作用。實 驗步驟同實施例3。
[0188] 結果，采用表面等離子共振技術（SPR)分析測得親和力解離常數(shù)KD值分別的為 1. 36X 10 6mol/L、l. 76X 10 6mol/L、l. 45X 10 6mol/L、3. 90X 10 6mol/L。重復兩次檢測。結 果表明，純化的 Zhpv16e7 affitoxin 127、affitoxin 301、affitoxin 384、affitoxin 745 蛋 白（帶有His6標簽）與HPV16E7重組蛋白具有相互作用的能力，如圖16A-D和表2所示， 4個affitoxin蛋白均能與HPV16 E7重組蛋白結合，結合的親和力均已達到nmol/L級水 平，而野生型的Zwt affitoxin和HPV16 E7重組蛋白幾乎沒有結合力，表明篩選出的四個 affibody蛋白與HPV16E7重組蛋白具有較高的特異親和力。
[0189] 結果表明，本發(fā)明的 Zhpv16e7 affitoxin 127、affitoxin 301、affitoxin 384、 affitoxin 745蛋白分子（帶有His6標簽）與HPV16E7靶蛋白分子具有相互結合和識別 能力。進一步從蛋白水平驗證了 Zhpv16e7 affitoxin 127、Zhpv16e7 affitoxin 301、Zhpv16e7 affitoxin 384、Zhpv16e7 affitoxin 745 與 HPV16E7 革巴蛋白之間的親和力。
[0190] Zhpv16e7 affitoxin體外細胞生長抑制作用：為研究Zhpv16e7 affitoxin體外細胞生 長抑制作用，選擇Zhpv16e7 affitoxin384蛋白作為研究對象。同樣選擇Caski、Siha、HeLa229 和A375四種腫瘤細胞株作為靶細胞。制備上述四種細胞懸液并計數(shù)接種于96孔細胞培 養(yǎng)板，0. 5 X IO4/孔。培養(yǎng)24h后，加入1 μ g/ml放線菌酮及5 %胎牛血清，然后加入Zhpvi卿 affitoxin384 蛋白，設置 100 μ g/ml、50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、1 μ g/ml 五個濃度組， 以SPA-ZwtS對照組（PE38KDEL)，設置五個同樣濃度組，同時設培養(yǎng)基對照，采用CCK-8試 劑盒檢測細胞的生存率，在加樣后lh、3h、6h、12h、24h、48h和72h，加入CCK-8試劑10 μ 1/ 孔，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育30min后置于酶標儀Α450處讀數(shù)。每組均設置3個復孔， 并進行3次重復實驗。細胞存活（Cellviability)計算方法為：Cell viability(% )= (Zhpv16e7 affitoxin384組的OD值-培養(yǎng)基組OD值）ASPA-Zwt對照組OD值-培養(yǎng)基組OD 值）X 100% ;同時用GraphPad primer 5· O軟件來計算細胞生長存活的IC50值。
[0191] 結果如圖17,經(jīng)GraphPad primer 5. 0軟件來計算Siha和Caski細胞生長存活 的 IC50 值，分別為(λ 28 μ M 和(λ 24 μ M。圖 18 顯示，Zhpv16e7 aff itoxin 384 對表達 HPV16 E7陽性的宮頸癌細胞Siha和Caski具有較強的殺傷作用，而對表達HPV18E7陽性的宮頸 癌HeLa229細胞及表達HPV陰性的黑色素瘤細胞A375均無明顯的殺傷作用。圖19顯示， Zhpv16e7 affitoxin 384作用于Siha和Caski 72h后，其細胞生存率與對照細胞之間比較， Siha與Caski細胞生存率之間比較無差異（p>0. 05)，Siha和Caski細胞與HeLa229細胞 生存率之間比較均有顯著性差異（p〈〇. 05)，而Siha和Caski細胞與A375細胞生存率之間 比較也具有顯著性差異（P〈〇. 05)，而HeLa229與A375細胞生存率之間比較無顯著性差異 (ρ>0· 05)。Zhpv16e7 affitoxin 384 的三個劑量組（100 μg/ml，10 μg/ml 及 lμg/ml)之間 對Siha和Caski細胞生長率均有顯著性差異（p〈0. 05)，而1 μ g/ml與PE38KDEL與培養(yǎng)基 對照組之間均無顯著性差異（Ρ〈〇· 05)。Zhpv16e7 affitoxin 384與對照蛋白PE38KDEL作用 于Siha，其細胞生存率的比較有顯著性差異（ρ〈0·05);而Zhpv16e7 affitoxin384及PE38KDEL 與培養(yǎng)基對照之間均無差異（P>〇. 05)。ZHPV16E7affitoxin 384與對照蛋白PE38KDEL作用于 Caski，其細胞生存率的比較有顯著性差異（ρ〈0· 05);而Zhpv16e7 affitoxin384及PE38KDEL 與培養(yǎng)基對照之間均無差異（P>〇. 05)。以上結果進一步表明，Zhpv16e7 affitoxin 384具有 體外HPV16E7靶向結合和殺傷細胞的特異性。
[0192] Zhpv16e7 affitoxin384蛋白的藥代動力學：選擇7周齡BALB/C-nu雌性裸鼠，5只 裸鼠尾靜脈注射 5mg/kg Zhpv16e7 affitoxin384,分別在 lmin、5min、15min、30min、60min、 120min時尾靜脈取血100 μ l，5h后，麻醉小鼠終末取血。另取5只裸鼠尾靜脈注射4mg/ kg Zhpv16 E7:3S4, 3只裸鼠尾靜脈注射PBS 100 μ 1作為對照，方法及取血標本的時間點同上。 將血液放37°C水浴箱20min后，1500r，4°C離心10min，收集血清-80度分裝保存。采用 ELISA方法檢測血清中的affitoxin和affibody濃度。將10 μ g/ml的HPV16E7蛋白包 被96孔酶標板4°(：過夜，加入1:50稀釋血清，37°(：孵育21 1，洗滌后加3%脫脂奶粉，37°(：封 閉2h后，加入本室制備的SPA-Z兔血清作為二抗，100 μ 1/孔，37°C lh，洗滌后加入羊抗兔 IgG-HRP (1:5000) 100 μ 1/ 孔，37 °C Ih ;洗滌，加入 TMB 顯色液，100 μ 1/ 孔，37 °C 避光顯色 30min ;置酶標儀450nm波長讀取吸光度值。重復3個復孔。同時設置以包被HPV16E7蛋 白后不加 affibody，并分別以抗16E7的兔血清（1:1000)和SPA-Z兔血清（1:2000)為一 抗作為陽性和陰性對照。取 〇、〇. I μ g/ml、l μ g/ml、10 μ g/ml、100 μ g/ml 的 affibody 及 affitoxin蛋白，經(jīng)ELISA檢測作標準曲線。
[0193] 結果，以純化的HPV16E7蛋白為包被抗原，采用ELISA法檢測血清中Zhpv16 E7affibody和Zhpv16 E7 affitoxin濃度，繪制標準曲線。Zhpv16e7 affibody和Zhpv16e7 affitoxin 的計算公式分別為 y = 〇· 1295χ-0· 11065, R2= 0· 9942 ;y = 0· 2378χ-0· 141，R2= 0· 9782。 在裸鼠尾靜脈注射后的lmin、5min、15min、30min、60min、120min及300min血液中的含量 分別為 122. 59 μ g/ml、82. 82 μ g/ml、54. 25 μ g/ml、48. 07 μ g/ml、45. 37 μ g/ml、34. 17 μ g/ ml、28. 49 μ g/ml、20. 66 μ g/ml 及 112. 28 μ g/ml、91. 36 μ g/ml、67. 28 μ g/ml、51. 09 μ g/ ml、42. 05 μ g/ml、32. 49 μ g/ml、29. 54 μ g/ml、24. 14 μ g/ml，根據(jù) Graphpad prisimer5. 0 繪制曲線（圖20A，B)計算，Zhpv16 E7 affibody和Zhpv16 E7 affitoxin的半衰期分別為 6.231 ±0.717min 和 8. 95±0.389min，Zhpv16 E7 affitoxin 比 Zhpv16 E7 affibody 的半衰期約 多2分鐘。
[0194] Zhpv16e7 affitoxin 蛋白的半數(shù)致:死量分析 LD50 :為研究 Zhpv16 E7 affitoxin384 蛋 白急性毒性作用，選擇BALB/c雌鼠作為實驗對象，并計算其半數(shù)致死量。選擇4w齡BALB/ c雌鼠，18-20g，分為9個劑量組，每組5-7只，見表3。每只小鼠尾靜脈僅一次給藥，注射 200 μ 1相應劑量的Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白。給藥后觀察指標：外觀，體征、體重及各劑 量組小鼠死亡時間，持續(xù)觀察至14天，并用Graphpad Primer5. 0法計算LD50,重復三次檢 測。結果 Zhpv16 E7 affitoxin384 蛋白致小鼠半數(shù)死亡的 LD50 為：15. 577±3. 738mg/kg。
[0195] 表3、Zhpv16e7 affitoxin384蛋白的急性毒性作用
[0197] Zhpv16 E7 affitoxin蛋白的保護作用：為檢測Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對腫瘤細 胞致瘤作用的保護作用，本實施例采用HPV16 E7陽性的Siha細胞制備BALB/c裸鼠的腫 瘤模型，具體方法同實施例5,即選擇4-5周齡BALB/c-nu小鼠，體重為12-15g，飼養(yǎng)于溫 州醫(yī)科大學實驗動物中心屏障系統(tǒng)（SPF級）內(nèi)，共分成5組，即Z HPV16E7affitoxin384蛋白 組，同時設置Zhpv16e7: 384、PE38KDEL、Zwt affitoxin及PBS作為對照組。每組10~12只。 affitoxin384. Omg/kg，同時設置PE38KDEL(mg/kg)作為對照組。將培養(yǎng)48h至對數(shù)生長期 Siha細胞，配制成所需的細胞數(shù)即IxlOVml，取0.2ml于裸鼠的背部近左前臂皮下注射，同 時將各組蛋白（均為4mg/kg)稀釋于0. 2ml的PBS中，在進行腫瘤細胞接種的同時按組別 經(jīng)尾靜脈注射0. 2ml對應蛋白，PBS組僅注射0. 2ml的PBS。每3天注射1次，共6次。每 3天觀察小鼠生活和精神狀態(tài)等，測量腫瘤大小并拍照記錄，觀察至60天。處死小鼠，同時 檢測小鼠血清測肝功能。
[0198] 同時，為檢測Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對Siha荷瘤小鼠的治療作用，另選擇4-5 周齡BALB/c-nu小鼠，接種IxioVml Siha細胞，待腫瘤生長100~200mm3大小時，分成上 述同樣5個組別，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈注射4mg/kg蛋白共0. 2ml對應樣品。每3天注射1次， 共6次。同時每3天觀察小鼠生活和精神狀態(tài)等，測量腫瘤大小并拍照記錄，觀察至60天。 處死小鼠，同時檢測小鼠血清測肝功能。
[0199] 結果見圖21A所示，Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對腫瘤細胞致瘤作用具有一定的保 護作用，Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白劑量組腫瘤的體積大小與對照組Zhpv16e7:384、PE38KDEL、 Zwt affitoxin蛋白及PBS組分別在第36天始出現(xiàn)有顯著性差異（p〈0. 01)，而Zhpv16e7:384與 PE38KDEL、Zwt affitoxin蛋白及PBS組分別在第42天始也開始出現(xiàn)顯著性差異（p〈0. 01)， 但PE38KDEL、Zwt affitoxin蛋白及PBS組之間無差異（p>0. 05)。隨著時間的延長，腫瘤體 積大小在各組別之間，差異明顯變大，直至60天。肝臟功能檢測轉氨酶指標均正常。
[0200] Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白對Siha荷瘤小鼠的治療作用結果見圖21B。Zhpv16 E7affitoxin384 蛋白組與 Zhpv16e7: 384、PE38KDEL、Zwt affitoxin 蛋白及 PBS 對照組比較，對 腫瘤生長的抑制作用分別在第30或36天始出現(xiàn)有顯著性差異（p〈0. 01)，而ZHPV16E7:384與 Zwt affitoxin蛋白、PE38KDEL蛋白及PBS組比較也于36天始出現(xiàn)顯著性差異（p〈0. 01)， Zwt affitoxin蛋白、PE38KDEL蛋白及PBS組之間比較無顯著性差異（p>0. 05)。隨著時間 的延長，腫瘤體積大小在各組別之間，差異明顯變大，直至60天。肝臟功能檢測轉氨酶指標 均正常。
[0201] 上述結果表明，Zhpv16 E7 affitoxin384及Zhpv16e7:384蛋白均具有保護或抑制腫瘤 細胞的生長作用，但以Z hpv16 E7 affitoxin384作用為強。即Zhpv16 E7 affitoxin384蛋白及 ZHPV16E7:384具有HPV16 E7靶向抑瘤作用。且毒副作用不明顯。
[0202] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特征在于，該多肽是 以葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列作為骨架，進行12-20個氨基酸變異后獲得的多肽。2. 如權利要求1所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特 征在于，相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽在第9-11，13-14,17-18, 24-25， 27-28, 32, 35,43位上發(fā)生氨基酸突變。3. 如權利要求2所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特 征在于，相對于葡萄球菌A蛋白Z段的氨基酸序列，該多肽的 第9位氨基酸突變?yōu)镾或W ; 第10位氨基酸突變?yōu)镕、L或V ; 第11位氨基酸突變?yōu)镋、L或W ; 第13位氨基酸突變?yōu)镽、I或S ; 第14位氨基酸突變?yōu)镾、L、Μ或A ; 第17位氨基酸突變?yōu)閃或R ; 第18位氨基酸突變?yōu)锳、W、T或Q ; 第24位氨基酸突變?yōu)镚、R、D或P ; 第25位氨基酸突變?yōu)镈、L、Η或G ; 第27位氨基酸突變?yōu)镚、V、Α或Q ; 第28位氨基酸突變?yōu)镽、E或L ; 第32位氨基酸突變?yōu)長、V或E ; 第35位氨基酸突變?yōu)镚、H、Q或D ; 第43位氨基酸突變?yōu)镋或K。4. 如權利要求1所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，其特 征在于，該多肽與人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白相互作用的K D值為1 X 10 6M至1 X 10 7M。5. -種靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，其特征在于，所述的靶向性分子包括權 利要求1-4任一所述的多肽，以及與該多肽相連接（或偶聯(lián)）的偶聯(lián)物，所述的偶聯(lián)物包 括：半胱氨酸殘基，多肽標簽，抑制人乳頭瘤病毒16型的藥物，或可檢測標記物。6. 如權利要求5所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子，其特征在于，所述的抑 制人乳頭瘤病毒16型的藥物包括：毒素；較佳地，所述毒素是具有抑制人乳頭瘤病毒16型 病毒感染或抑制腫瘤作用的毒素，如白喉毒素、蓖麻毒素、綠膿桿菌外毒素或所述毒素的功 能性片段；且，所述的腫瘤是人乳頭瘤病毒16型陽性的腫瘤。7. -種分離的多核苷酸，其編碼權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7 蛋白具有結合親和力的多肽。8. -種多核苷酸，其編碼權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分 子，且其中所述的偶聯(lián)物是肽。9. 一種重組載體，其特征在于，該載體包含權利要求7或8所述的多核苷酸。10. -種宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞包含權利要求9所述的重組載體，或其包 含有或基因組中整合有權利要求7或8所述的多核苷酸。11. 一種制備權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和 力的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)權利要求10所述的細胞，從而表達權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒 16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽； (2) 分離純化（1)獲得的多肽。12. 權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽 或權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的靶向性分子的用途，用于制備治療人乳 頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤的藥物；或 用于制備檢測人乳頭瘤病毒16型病毒感染的檢測試劑；或 用于制備診斷人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性腫瘤的診斷 試劑。13. -種藥物組合物，其特征在于，其包含： 權利要求1-4所述的對人乳頭瘤病毒16型的E7蛋白具有結合親和力的多肽或權利要 求5或6所述的革E1向人乳頭瘤病毒16型的革E1向性分子；和 藥學上可接受的載體。14. 一種用于診斷或治療人乳頭瘤病毒16型感染疾病或人乳頭瘤病毒16型表達陽性 腫瘤的藥盒，其特征在于，所述的藥盒中包括：權利要求1-4任一所述的對人乳頭瘤病毒16 型的E7蛋白具有結合親和力的多肽，或權利要求5或6所述的靶向人乳頭瘤病毒16型的 靶向性分子，或權利要求13所述的藥物組合物。
【文檔編號】C07K14/31GK105859846SQ201510028505
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月20日
【發(fā)明人】張麗芳, 薛向陽, 朱珊麗, 王樂丹, 朱冠保, 李文姝
【申請人】溫州醫(yī)科大學