一種含OmpU抗體的免疫磁珠及其制備與捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含OmpU抗體的免疫磁珠及其制備與捕獲?多重PCR檢測病原弧菌的方法，用弧菌的基因組作為模板PCR擴增OmpU基因，獲得較純的OmpU重組蛋白作為抗原制備抗體，經(jīng)過偶聯(lián)?洗滌的過程制備出含OmpU抗體的免疫磁珠；免疫磁珠能夠捕獲多種弧菌，然后用基于danJ基因設計的多重PCR特異性引物進行鑒定。最多同時檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌，可廣泛應用于環(huán)境及進出口食品檢驗中。本發(fā)明結(jié)合了免疫分離的特異性和PCR擴增的高效性，具有分離、濃縮、富集的能力，能夠?qū)悠分械蜐舛鹊牟≡M行高效的分離和富集，降低或消除了樣品對PCR的抑制、影響，提高檢測的極限，具有很好的應用前景。
【專利說明】
一種含OmpU抗體的免疫磁珠及其制備與捕獲-多重PCR檢測病 原弧菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種含OmpU抗體的免疫磁珠及其制備與捕 獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 弧菌病能給人和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害，而且傳播范圍廣泛。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng) 殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖密度的增大，以及海洋養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，使以弧菌為主的各類致病菌 一旦在海水養(yǎng)殖動物中暴發(fā)，將難于控制，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，因此在養(yǎng)殖 過程中有必要對養(yǎng)殖環(huán)境中弧菌病害進行監(jiān)測，一旦發(fā)現(xiàn)細菌性病害前兆，應及時診斷，并 采取相應防治措施，將病害消滅在萌芽狀態(tài)，從而有效降低經(jīng)濟損失。同時水產(chǎn)品在全球范 圍內(nèi)的消費不斷增加，水產(chǎn)品又容易受到不同程度的污染，其中受到弧菌的污染較為嚴重， 這些使食品安全問題不斷受到威脅。養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌的存在和數(shù)量的增加導致水產(chǎn)品污 染增加，通過食用受污染的水產(chǎn)品可以使人類患病引發(fā)食物中毒威脅人類健康，因此對養(yǎng) 殖環(huán)境的微生物檢測改善養(yǎng)殖環(huán)境及對水產(chǎn)品安全的監(jiān)測是十分必要的?？梢姡焖贉蚀_ 的診斷方法是把握最佳防御和治療時機的關(guān)鍵，也是減少食品安全事故的有效手段。
[0003] 近年，國內(nèi)外報道了一些快速檢測弧菌病的方法，主要分為改良的培養(yǎng)檢測分析 法、免疫學方法、分子生物學檢測方法、生物傳感器技術(shù)等。同時也出現(xiàn)了將免疫學方法與 培養(yǎng)法結(jié)合、免疫學方法與分子生物學技術(shù)結(jié)合，分子生物學技術(shù)與傳感器技術(shù)結(jié)合等開 發(fā)的快速的檢測方法。但是目前弧菌病檢測方法的靈敏度不高，檢測方法復雜，且一次只能 檢測一種弧菌，對于復雜的環(huán)境無法實現(xiàn)檢測。
[0004] 免疫磁珠捕獲-多重PCR技術(shù)結(jié)合了免疫分離的特異性和PCR擴增的高效性，具有 分離、濃縮、富集的能力，能夠?qū)悠分械蜐舛鹊牟≡M行高效的分離和富集，再結(jié)合靈 敏的檢測技術(shù)能很好的達到檢測病原菌或疾病的效果，降低或消除了樣品對PCR的抑制、影 響，提高檢測的極限，具有很好的應用前景。因此研究建立對弧菌的免疫磁珠捕獲-多重PCR 快速檢測方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種含OmpU抗體的免疫磁珠及其制 備與捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。
[0006] 為了實現(xiàn)上述的目的，采用如下的技術(shù)方案：
[0007] -種含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，主要包括以下步驟：
[0008] (1)以以一種或者多種弧菌的基因組作為模板PCR擴增OmpU基因；
[0009 ] (2)將步驟（1)所得PCR產(chǎn)物連接到pET_32a (原核表達載體)構(gòu)建異源表達載體，轉(zhuǎn) 化到E.coli BL21(DE3即大腸桿菌）；每個克隆至少重復測序2次；
[0010] (3)將步驟(2)所得OmpU重組菌接種到LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期， 加入終濃度為lmmol/L的IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導6h;
[0011] (4)離心收集步驟(3)所得菌體，利用親和層析進行純化，獲得純的OmpU重組蛋白； [0012 ] (5)將步驟(4)所得純的OmpU重組蛋白作為抗原制備OmpU重組蛋白抗體；
[0013] (6)將磁珠混勻后加入離心管中，再加入洗滌緩沖液roST(PBS+0.05%(V/V)吐溫 20)混勻，置于裝有強力磁鐵的磁架靜置，棄液體;重復操作多次后加入重懸液重懸磁珠；
[0014] (7)往步驟(6)的磁珠中加入步驟(5)所得OmpU重組蛋白抗體，4°C輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩孵 育18~24h;制備成一種或者多種弧菌OmpU抗體的免疫磁珠；
[0015] (8)再用洗滌緩沖液清洗和重懸緩沖液重懸，4°C保存。
[0016] 對OmpU基因的克隆和生物信息學分析顯示，OmpU基因在弧菌中普遍存在，且在弧 菌種內(nèi)（intra-species)和種間（inter-species)均具有較高的相似性。制備OmpU重組蛋白 抗血清，并進一步通過Western blotting、Whole_cell ELISA技術(shù)對弧菌OmpU免疫交叉反 應譜、抗原表位的細胞定位等免疫交叉反應特性進行分析，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白OmpU是弧菌中一 種保守的共同抗原，具有免疫交叉反應性，是一種良好的免疫捕獲靶標。利用OmpU重組蛋白 抗血清制備的含OmpU抗體的免疫磁珠，能有效地對副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷 弧菌和擬態(tài)弧菌等多種病原弧菌進行捕獲。
[0017] 進一步的，所述弧菌包括副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌。
[0018] 進一步的，步驟(5)所述OmpU重組蛋白抗體的制備主要包括:取純的OmpU重組蛋白 作為抗原（免疫劑量約為250yg蛋白/kg兔），與等體積的弗氏完全佐劑混合、乳化、皮下注 射，免疫大白兔;每隔兩周加強免疫一次，加強免疫時，免疫劑量減半且與弗氏不完全佐劑 乳化。第二次加強免疫后第七天采血測定血清效價。待確定產(chǎn)生抗體后采血，收集血清。免 疫前取兔血清，以作陰性對照。
[00?9]進一步的，所述LB培養(yǎng)基中包含氨節(jié)青霉素(Amp) 100yg/mL;所述親和層析為鎳瓊 脂糖凝膠;所述洗滌緩沖液為PBS和0.05 % (V/V)吐溫-20的混合液;所述重懸液含1 %牛血 清白蛋白（BSA);所述重懸緩沖液包含0.5 %牛血清白蛋白；所述OmpU重組蛋白抗體的添加 量為500yL/20〇yg磁珠。重組OmpU帶有組氨酸標簽(6XHis-Tag)，可利用鎳瓊脂糖凝膠進行 親和層析，再利用咪唑進行洗脫。重懸緩沖液可以起到穩(wěn)定和防止非特異性吸附的作用。 [0020] -種上述制備方法制備的含OmpU抗體的免疫磁珠。
[0021 ] -種含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法，主要包括以下步 驟：
[0022] (SI)制備待測樣品；
[0023] (S2)將含待測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠加入待測樣品中，37°C振蕩反應2~3h， 使含OmpU抗體的免疫磁珠上的OmpU抗體與待測樣品中弧菌表面抗原充分結(jié)合;所述含OmpU 抗體的免疫磁珠添加量30μg/ml;
[0024] (S3)用磁鐵將所述含OmpU抗體的免疫磁珠與待測樣品基質(zhì)分開，去除待測樣品基 質(zhì)，得到含OmpU抗體的免疫磁珠-弧菌免疫復合體；
[0025] (S4)將(S3)中得到的含OmpU抗體的免疫磁珠-弧菌免疫復合體用I3BST洗滌干凈， 再加入裂解液，80°C中煮15min釋放DNA，然后離心，取上清作為PCR擴增模板進行PCR擴增； [0026] (S5)將步驟（S4)所得PCR擴增引物采用基于dnaj基因設計制備單重或多重PCR反 應體系；
[0027] (S6)將單重或多重PCR反應體系置于離心機中瞬時離心，然后放到PCR儀上進行 PCR反應；
[0028] (S7)最后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。
[0029]采用基于dnaj基因設計的特異性引物，包括1條通用正向引物和5條反向引物。該 引物能在一個PCR反應體系中，最多同時檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和 擬態(tài)弧菌5種致病弧菌。
[0030] 含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測技術(shù)分為含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲 和多重PCR兩種技術(shù)進行集成，即利用基于重組外膜蛋白OmpU抗血清制備的含OmpU抗體的 免疫磁珠對樣品中的弧菌進行分離、富集，再通過多重PCR對多捕獲后的弧菌進行鑒定，從 而構(gòu)建快速檢測多種病原弧菌的方法，該方法特異性高，檢測迅速，操作簡單，能夠快速準 確高效的檢測病原弧菌。
[0031] 進一步的，步驟(SI)所述制備待檢測的樣品包括:水樣直接用滅菌的離心管取樣 檢測;泥樣加入滅菌的PBS(磷酸緩沖液)混勻后，取上清檢測;魚蝦蟹取可食部位碾成糜，再 加入滅菌的PBS混勻后，取上清檢測。
[0032]對于固態(tài)樣品，非冷凍樣品采集后立即保存在4°C，并盡快處理;冷凍品應在45°C 以下不超過15min，或2°C~5°C不超過18h。魚類和頭足類動物取表面組織、腸或腮。貝類取 全部內(nèi)容物或中心部分，帶殼貝類或甲殼類應先在自來水刷洗外殼并甩干表面水分，然后 以無菌操作打開外殼，取出相應部分。
[0033]對于液態(tài)樣品，液體食品或是外環(huán)境水樣采集后應馬上進行檢測，不能馬上檢測 的應立即保存在4°C，并盡快處理。
[0034]進一步的，所述單重PCR反應體系的制備為:將2yL步驟S4所得DNA作為PCR模板，加 入0.5yL上游引物VM-F，再加入0.5yL待檢測的弧菌的特異性引物、12.5yL PCRMix和水補齊 25yL;所述多重PCR反應體系的制備為將2yL步驟S4所得DNA作為PCR模板，加入IyL上游引物 VM-F，加入帶檢測幾種弧菌的特異性引物各0.5yL、12.5yL PCRMix，加水補齊25yL。其中VM-F的引物序列為CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA;所述霍亂弧菌Vc-Rmm的引物序列為 AGCAGCTTATGACCAATACGCC;所述畐Ij溶血弧菌Vp-MmR的引物序列為 TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG;所述創(chuàng)傷弧菌 Vv-Rmm 的引物序列為 GTACGAAATTCTGACCGATCAA; 所述擬態(tài)弧菌Vm-Rmm的引物序列為YCTTGAAGAAGCGGTTCGTGCA;所述溶藻弧菌Val-MmR的引 物序列為GATCGAAGTRCCRACACTMGGA 〇
[0035] 進一步的，所述PCR反應的條件為：stepl:95°C預變性5min，step2:94°C變性45s， step3 :62°C變性45s，step4: 72°C變性30s~Imin，step2~step4: 35個循環(huán)，step5: 72°C 10min〇
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR技術(shù)結(jié)合了免疫分 離的特異性和PCR擴增的高效性，可以同時捕獲多種弧菌的含OmpU抗體免疫，結(jié)合多重PCR 技術(shù)，不僅可以提高檢測的靈敏度，而且可以在多種復雜的環(huán)境中實現(xiàn)檢測。具有分離、濃 縮、富集的能力，能夠?qū)悠分械蜐舛鹊牟≡M行高效的分離和富集，再結(jié)合靈敏的檢測 技術(shù)能很好的達到檢測病原菌或疾病的效果，降低或消除了樣品對PCR的抑制、影響，提高 檢測的極限，具有很好的應用前景。而且本發(fā)明檢測不需要增菌培養(yǎng)，所需檢測時間短，并 且能同時檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌中的1~5種，檢測靈敏 度高可以達到I O1CFUAiL，檢測過程方便、迅速，可用于養(yǎng)殖業(yè)和海產(chǎn)品對致病弧菌的檢測。
【附圖說明】
[0037] 圖1為含OmpU抗體的免疫磁珠制備示意圖；
[0038] 圖2為含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR快速檢測弧菌的技術(shù)流程圖；
[0039]圖3為快速檢測弧菌的示意圖；
[0040] 圖4為重組創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白ompU的交叉免疫原性分析；
[0041] 圖5為重組溶藻弧菌外膜蛋白ompU的交叉免疫原性分析；
[0042] 圖6為重組副溶血弧菌外膜蛋白ompU的交叉免疫原性分析；
[0043] 圖7為重組擬態(tài)弧菌外膜蛋白ompU的交叉免疫原性分析；
[0044] 圖8為抗重組蛋白抗體與多種弧菌的全菌ELISA交叉反應；
[0045] 圖9為磁珠抗體添加量的優(yōu)化；
[0046] 圖10為待測樣品中含OmpU抗體的免疫磁珠添加量的優(yōu)化；
[0047] 圖11為創(chuàng)傷弧菌含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測的靈敏度的檢測結(jié)果； [0048]圖12為副溶血弧菌含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測靈敏度的檢測結(jié)果； [0049]圖13為擬態(tài)弧菌和創(chuàng)傷弧菌混合菌的含OmpU抗體的免疫磁珠-多重PCR靈敏度的 檢測結(jié)果；
[0050]圖14為擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌混合菌的含OmpU抗體的免疫磁珠-多重PCR靈敏度的 檢測結(jié)果；
[0051 ]圖15為副溶血弧菌和霍亂弧菌混合菌的含OmpU抗體的免疫磁珠-多重PCR靈敏度 的檢測結(jié)果；
[0052]圖16為霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌混合菌的含OmpU抗體的免疫磁珠-多重 PCR靈敏度的檢測結(jié)果；
[0053]圖17為其他弧菌對含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測效果的影響；其中+ 表不添加相應的菌液，-表不未添加相應的菌液；
[0054]圖18為不同鹽離子濃度對檢測效率的影響；
[0055] 其中APW指的是堿性蛋白胨水;M表示標記物，N表示陰性對照，PBS表示磷酸緩沖液 對照組，Vv27562、VvlA08743、VvATCC27562和VvlH00047均為創(chuàng)傷弧菌的編號； VpATCC17802、Vpl7802、VpL490、Vpl · 1615和Vpl · 1616均為副溶血弧菌的編號；VcVbO為霍亂 弧菌的編號；VmATCC33653、Vm33653 均為擬態(tài)弧菌的編號；ValATCC33787、Val33787、 Vall.ll833VallA08081、VallH00082均為溶藻弧菌的編號;Bsub表示的是枯草芽孢桿菌。
【具體實施方式】
[0056]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一 步地詳細描述。
[0057] 實施例1
[0058]以檢測副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌為例。
[0059] 1、含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，如圖1所示，主要包括以下步驟：
[0060] 1)制備免疫抗原：以副溶血弧菌ATCC17802、創(chuàng)傷弧菌ATCC27562、霍亂弧菌VbO和 擬態(tài)弧菌ATCC33653的基因組作為模板PCR擴增OmpU基因，PCR產(chǎn)物連接到pET-32a構(gòu)建異源 表達載體，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21;將OmpU重組菌接種到LB培養(yǎng)基(含Amp 100yg/mL)中，37°C 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導6h。離心收集菌體，利用親和層 析(鎳瓊脂糖凝膠FF)對重組蛋白進行純化，獲得較純的OmpU重組蛋白作為抗原。
[0061] 2)制備弧菌特異性抗體:取純化的OmpU重組蛋白作為抗原(免疫劑量約為250yg蛋 白/kg兔），與等體積的弗氏完全佐劑混合、乳化、皮下注射，免疫新西蘭大白兔。每隔兩周加 強免疫一次，加強免疫時，免疫劑量減半且與弗氏不完全佐劑乳化。第二次加強免疫后第七 天采血測定血清效價。待確定產(chǎn)生抗體后采血，收集血清。免疫前取兔血清，以作陰性對照。 [0062] 3)制備含OmpU抗體的免疫磁珠:將磁珠混勾，取400yL (400yg)磁珠到2mL的離心 管，加入211^洗滌緩沖液1^+0.05%(￥八)吐溫20(?831')，混勻，置于裝有強力磁鐵的磁架， 靜置3min，棄液體;重復操作3~4次后，加入適量(0.8mL左右）的重懸液重懸磁珠(含1 %牛 血清白蛋白BSA)，分別加入ImL OmpU多克隆兔抗血清，4 °C輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩孵育18~24h，制備 成4種弧菌的OmpU含OmpU抗體的免疫磁珠;用2mL洗滌緩沖液緩沖液清洗3~5次，用400yL重 懸緩沖液重懸含OmpU抗體的免疫磁珠(含0.5%BSA)，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0063] 2、快速檢測弧菌的方法，如圖2和圖3所示，主要包括以下步驟：
[0064] 1)水樣直接用滅菌的15mL的離心管取IOmL樣品檢測，泥樣取5g加入45mL滅菌的 PBS混勻，取IOmL上清檢測；魚蝦蟹取可食部位碾成糜，取IOg加入90mL滅菌的PBS混勻，取 IOmL上清檢測。
[0065] 2)將含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠加到待檢測樣品中，37°C振蕩反應2~ 3h，使含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠上的抗體與弧菌表面抗原充分結(jié)合;其中加入 含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠各30yg到ImL樣品中。
[0066] 3)用磁鐵將含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠與樣品基質(zhì)分開，去除樣品基 質(zhì)，得到含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠-弧菌免疫復合體。
[0067] 4)將3)中得到的含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠-弧菌免疫復合體用PBST洗 滌干凈，加入40yL裂解液，80 °C煮15min釋放DNA，然后3000rpm離心5min，取上清作為PCR擴 增模板進行PCR擴增。
[0068] 5)制備多重PCR反應體系（25yL)，主要包括如表1所示組分及含量：
[0069] 表1多重PCR反應體系

[0072] 6)將PCR反應管置于離心機中瞬時離心，使反應液集于管底，然后將反應管放到基 因擴增儀(PCR儀)上;在PCR儀上輸入如表2所示參數(shù)：
[0073]表2PCR儀上輸入的參數(shù)
[0075] 7)PCR反應結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析；電泳:3%的瓊脂糖凝膠電泳，80~ 100V，電泳 30 ~50min。
[0076] 實施例2
[0077] 以檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌五種病原弧菌為 例。
[0078] 1、含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，如圖1所示，主要包括以下步驟：
[0079 ] 1)抗原的制備:如圖4、圖5、圖6、圖7和圖8所示通過生物信息學分析對弧菌OmpU蛋 白種內(nèi)、種間的保守性及交叉免疫特性進行分析，結(jié)果提示OmpU蛋白是弧菌屬中一種廣泛 存在的共同抗原，同時也是一種良好的免疫磁珠捕獲靶標。利用在線的信號肽分析軟件 Signal 3.0,對ompU基因的氨基酸序列進行信號肽預測，并設計PCR的表達引物以去除編碼 信號肽的核苷酸序列，引物為如表3所示：
[0080] 表3PCR的表達引物
[0082] 分別以副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787、創(chuàng)傷弧菌ATCC27562、霍亂弧 菌VbO和擬態(tài)弧菌ATCC33653的基因組作為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物連接到pET-32a構(gòu)建 異源表達載體，轉(zhuǎn)化到E. Co I i BL21 (DE3 )，每個克隆至少重復測序2次。將OmpU重組菌接種 到LB培養(yǎng)基(含Amp 100yg/mL)中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度為lmmol/L的 IPTG誘導6h。離心收集菌體，利用親和層析(鎳瓊脂糖凝膠FF)對重組蛋白進行純化，獲得較 純的OmpU重組蛋白作為抗原。
[0083] 2)0mpU重組蛋白抗體的制備:取純化的OmpU重組蛋白作為抗原(免疫劑量約為250 yg蛋白/kg兔），與等體積的弗氏完全佐劑混合、乳化、皮下注射，免疫新西蘭大白兔。每隔兩 周加強免疫一次，加強免疫時，免疫劑量減半且與弗氏不完全佐劑乳化。第二次加強免疫后 第七天采血測定血清效價。待確定產(chǎn)生抗體后采血，收集血清。免疫前取兔血清，以作陰性 對照。
[0084] 3)含OmpU抗體的免疫磁珠的制備:將磁珠混勻，取400yL(400yg)磁珠到2mL的離心 管，加入211^洗滌緩沖液1^+0.05%(￥八)吐溫20(?831')，混勻，置于裝有強力磁鐵的磁架， 靜置3min，棄液體;重復操作3~4次后，加入適量(0.8mL左右）的重懸液重懸磁珠(含1 %牛 血清白蛋白BSA)，分別加入ImL OmpU多克隆兔抗血清，4 °C輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩孵育18~24h，制備 成5種弧菌的OmpU含OmpU抗體的免疫磁珠;用2mL洗滌緩沖液緩沖液清洗3~5次，用400yL重 懸緩沖液重懸含OmpU抗體的免疫磁珠(含0.5%BSA)，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0085] 2、快速檢測弧菌的方法，如圖2和圖3所示，主要包括以下步驟：
[0086] 1)樣品的處理。
[0087] (a)固態(tài)樣品：非冷凍樣品采集后立即保存在4°C，并盡快處理。冷凍品應在45°C以 下不超過15min，或2°C~5°C不超過18h。魚類和頭足類動物取表面組織、腸或腮。貝類取全 部內(nèi)容物或中心部分，帶殼貝類或甲殼類應先在自來水刷洗外殼并甩干表面水分，然后以 無菌操作打開外殼，取出相應部分。以無菌操作取樣品IOg加無菌磷酸緩沖液(PBS)90mL，勻 質(zhì)器勻質(zhì)，制成1:10的樣品勻液;沒有勻質(zhì)器的將樣品放入無菌研缽中，自90mL無菌PBS取 少許加入研缽磨碎，磨碎后放入250mL三角瓶中，再用少許無菌I3BS沖洗研缽2~3次，洗液放 入錐形瓶中，最后剩余的無菌PBS全部放入錐形瓶中，充分震蕩制成1:10的樣品勻液。泥樣 則稱取IOg放入250mL三角瓶中加入無菌PBS90mL充分震蕩制成1:10的樣品勻液。
[0088] (b)液態(tài)樣品:液體食品或是外環(huán)境水樣采集后應馬上進行檢測，不能馬上檢測的 應立即保存在4°C，并盡快處理。
[0089] 2)含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲分離及DNA模板的制備(無需增菌處理）：取IOmL固 態(tài)樣品處理成的1:10的樣品勻液或是IOmL液體樣品，加入含待檢測弧菌的OmpU抗體的免疫 磁珠各30yg，37 °C旋轉(zhuǎn)捕獲2~3h，對樣品中待測弧菌進行捕獲分離。捕獲完后將離心管放 到磁架上靜置3min，棄液體，取1~2mL PBST將離心管壁，管蓋上的磁珠輕輕的洗下，并轉(zhuǎn)移 到1.5或是2mL的離心管，PBST洗滌2~3次，小心吸干離心管內(nèi)的水，加入40yL微生物裂解緩 沖液，80 °C煮15min裂解釋放DNA，3000rpm離心5min，上清作為PCR擴增模板進行PCR擴增。
[0090] 3)多重PCR反應樣品的制備:經(jīng)過多種PCR引物的優(yōu)化，最終采用基于dnaj基因設 計的多重PCR特異性引物如表4所示，檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬 態(tài)弧菌五種病原弧菌。
[0091] 表4副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌的PCR擴增引物序列及 參數(shù)
[0093]多重PCR反應樣品的制備：取出PCR管以含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲分離制備的 DNA 2yL作為PCR模板，加入IyL上游引物VM-F，加入表4中要檢測幾種弧菌的特異性引物各 0.5yL，12.5yL PCRMix，加水補齊25yL。以無菌雙蒸水作為陰性對照，以與待檢測弧菌對應 的弧菌標準菌株DNA作為陽性對照，進行多重PCR同步檢測。
[0094] 4)?0?反應程序：8七6口1:預變性95°〇5111；[11，8七6口2:變性94°0458,8七6口3:62°0458， 8七6卩4:72。0308~1111；[11，8七6卩2~8七6卩4:35個循環(huán)，8七6卩5:72。010111；[11。
[0095] 5)DNA凝膠電泳檢測：用TAE或TBE制備2%~3%的瓊脂糖凝膠，80~100V進行DNA 瓊脂糖凝膠，電泳結(jié)束后，進行溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像儀掃描成像。
[0096] 6)結(jié)果判走和報告：
[0097] 在瓊脂糖凝膠中霍亂弧菌的特異性PCR產(chǎn)物大小為375bp，副溶血弧菌的特異性 PCR產(chǎn)物大小為96bp，創(chuàng)傷弧菌特異性PCR產(chǎn)物大小為412bp，擬態(tài)弧菌特異性PCR產(chǎn)物大小 為177bp，溶藻弧菌特異性PCR產(chǎn)物大小為144bp。如果瓊脂糖凝膠檢測中有375bp的條帶且 與陽性對照一致則說明檢測樣品中含有霍亂弧菌，沒有則為陰性；如果瓊脂糖凝膠中有 96bp的條帶且與陽性對照一致則說明檢測樣品中含有副溶血性弧菌，沒有則為陰性;如果 瓊脂糖凝膠中有412bp的條帶且與陽性對照一致則說明檢測樣品中含有創(chuàng)傷弧菌，沒有則 為陰性;如果瓊脂糖凝膠中有177bp的條帶且與陽性對照一致則說明檢測樣品中含有擬態(tài) 弧菌，沒有則為陰性;如果瓊脂糖凝膠中有144bp的條帶且與陽性對照一致則說明檢測樣品 中含有溶藻弧菌，沒有則為陰性。
[0098]對于陽性結(jié)果，應參見規(guī)范性應用文件中的方法或相關(guān)的國際權(quán)威微生物鑒定方 法做進一步的生化鑒定和報告。
[0099] 7)確證：檢驗篩選出的陽性樣本，副溶血弧菌按照GB4789.7，霍亂弧菌按照SN/ T1022進行確證。
[0100] 實施例3
[0101 ]以檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌五種病原弧菌中任 一種弧菌為例。
[0102] 1、含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，如圖1所示，主要包括以下步驟：
[0103] 1)抗原的制備：以待檢測的弧菌如副溶血弧菌ATCC17802、溶藻弧菌ATCC33787、創(chuàng) 傷弧菌ATCC27562、霍亂弧菌VbO和擬態(tài)弧菌ATCC33653之一的基因組作為模板進行PCR擴 增，PCR產(chǎn)物連接到pET-32a構(gòu)建異源表達載體，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21 (DE3)，每個克隆至少重 復測序2次。將OmpU重組菌接種到LB培養(yǎng)基(含Amp 100yg/mL)中，37 °C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長 期，加入終濃度為lmmol/L的IPTG誘導6h。離心收集菌體，利用親和層析(鎳瓊脂糖凝膠FF) 對重組蛋白進行純化，獲得較純的OmpU重組蛋白作為抗原。
[0104] 2)0mpU重組蛋白抗體的制備:取純化的OmpU重組蛋白作為抗原(免疫劑量約為250 yg蛋白/kg兔），與等體積的弗氏完全佐劑混合、乳化、皮下注射，免疫新西蘭大白兔。每隔兩 周加強免疫一次，加強免疫時，免疫劑量減半且與弗氏不完全佐劑乳化。第二次加強免疫后 第七天采血測定血清效價。待確定產(chǎn)生抗體后采血，收集血清。免疫前取兔血清，以作陰性 對照。
[0105] 3)含OmpU抗體的免疫磁珠的制備:將磁珠混勻，取400yL(400yg)磁珠到2mL的離心 管，加入211^洗滌緩沖液1^+0.05%(￥八)吐溫20(?831')，混勻，置于裝有強力磁鐵的磁架， 靜置3min，棄液體;重復操作3~4次后，加入適量(0.8mL左右）的重懸液重懸磁珠(含1 %牛 血清白蛋白BSA)，分別加入ImL OmpU多克隆兔抗血清，4 °C輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩孵育18~24h，制備 成含待檢測的弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠(如要檢測副溶血弧菌就加入副溶血弧菌的OmpU 抗血清制備成副溶血弧菌的含OmpU抗體的免疫磁珠）；用2mL洗滌緩沖液緩沖液清洗3~5 次，用400yL重懸緩沖液重懸含OmpU抗體的免疫磁珠(含0.5%BSA)，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0106] 2、快速檢測弧菌的方法，如圖2和圖3所示，主要包括以下步驟：
[0107] 1)樣品的處理。
[0108] (a)固態(tài)樣品：非冷凍樣品采集后立即保存在4°C，并盡快處理。冷凍品應在45°C以 下不超過15min，或2°C~5°C不超過18h。魚類和頭足類動物取表面組織、腸或腮。貝類取全 部內(nèi)容物或中心部分，帶殼貝類或甲殼類應先在自來水刷洗外殼并甩干表面水分，然后以 無菌操作打開外殼，取出相應部分。以無菌操作取樣品IOg加無菌磷酸緩沖液(PBS)90mL，勻 質(zhì)器勻質(zhì)，制成1:10的樣品勻液;沒有勻質(zhì)器的將樣品放入無菌研缽中，自90mL無菌PBS取 少許加入研缽磨碎，磨碎后放入250mL三角瓶中，再用少許無菌I3BS沖洗研缽2~3次，洗液放 入錐形瓶中，最后剩余的無菌PBS全部放入錐形瓶中，充分震蕩制成1:10的樣品勻液。泥樣 則稱取IOg放入250mL三角瓶中加入無菌PBS90mL充分震蕩制成1:10的樣品勻液。
[0109] (b)液態(tài)樣品:液體食品或是外環(huán)境水樣采集后應馬上進行檢測，不能馬上檢測的 應立即保存在4°c，并盡快處理。
[0110] 2)含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲分離及DNA模板的制備（增菌處理）：將IOmL固態(tài)樣 品處理成的1:10的樣品勻液或是IOmL液體樣品接種到90mL堿性蛋白胨水37°C震蕩過夜增 菌。取IOmL增菌液，加入對應含待測的弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠，（如對霍亂弧菌檢測則 加入含Vc-OmpU抗體的免疫磁珠;對幾種弧菌檢測則加入對應的幾種含弧菌的OmpU抗體的 免疫磁珠，如對霍亂弧菌和副溶血弧菌同步檢測則同時加入Vc-OmpU和Vp-OmpU含OmpU抗體 的免疫磁珠），37°C旋轉(zhuǎn)捕獲2~3h，對樣品中待測弧菌進行捕獲分離。捕獲完后將離心管放 到磁架上靜置3min，棄液體，取1~2mLPBST將離心管壁，管蓋上的磁珠輕輕的洗下，并轉(zhuǎn)移 到1.5或是2mL的離心管，PBST洗滌2~3次，小心吸干離心管內(nèi)的水，加入40yL微生物裂解緩 沖液，80 °C煮15min裂解釋放DNA，3000rpm離心5min，上清作為PCR擴增模板進行PCR擴增。 3)單重PCR反應樣品的制備:取出PCR管以含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲分離制備的 DNA 2yL作為PCR模板，加入0.5yL上游引物VM-F 0.5yL，加入待檢測的弧菌的特異性引物 〇.5yL，加入12.5yL PCRMix(DSBIO)，加水補齊25yL。以無菌雙蒸水作為陰性對照，以與待檢 測弧菌對應的弧菌標準菌株DNA作為陽性對照，進行PCR檢測。
[0112] 4)PCR 反應程序:預變性 95°C5min，變性 951€458,621€458,721€3〇8~1111丨11，35個循 環(huán) 72°C10min。
[0113] 5)DNA凝膠電泳檢測：用TAE或TBE制備2 %~3%的瓊脂糖凝膠，80~100V進行DNA 瓊脂糖凝膠，電泳結(jié)束后，進行溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像儀掃描成像。
[0114] 實施例4
[0115]為了獲得最佳的檢測效果，本實施例進一步對影像檢測效果的參數(shù)做進一步優(yōu) 化。
[0116] 抗體添加量的優(yōu)化實驗：分別以IOOyL~1000yL/200yg的霍亂弧菌來源的兔抗重 組OmpU抗體添加量制備含OmpU抗體的免疫磁珠，分別取30yg對濃度為IO 6CFUAiL的霍亂弧 菌進行捕獲、平板計數(shù)，進而確定最佳的抗體添加量。如圖9可以看出當多克隆抗體添加量 小于500yL/200yg時，含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲的細菌數(shù)量隨著抗體添加量的增加而明 顯的增加；當抗體添加量達到500yL/200yg后，與抗體添加量為700yL/200yg和抗體添加量 為1000yL/200yg比較，捕獲的細菌數(shù)量增加不是很明顯，趨于穩(wěn)定。當抗體添加量為500yL/ 200yg是達到較佳的效果。
[0117] 含OmpU抗體的免疫磁珠添加量的優(yōu)化：分別以10~50yg磁珠添加量，對濃度為 IO6CFUAiL的霍亂弧菌進行捕獲、平板計數(shù)，進而確定最佳的磁珠添加量。如圖10所示，隨著 含OmpU抗體的免疫磁珠加入量增加，磁珠捕獲霍亂弧菌的捕獲數(shù)量逐漸增大；當含OmpU抗 體的免疫磁珠加入量達到30yg后，霍亂弧菌捕獲數(shù)量區(qū)別不大。磁珠是通過抗原抗體特異 性結(jié)合來捕獲菌，當體系中的菌的表面結(jié)合了足夠量的磁珠時，再加入磁珠，菌的捕獲量幾 乎不會有太明顯的提尚，因此選擇3〇yg為最佳添加量。
[0118] 實施例5
[0119] 含OmpU抗體的免疫磁珠多重PCR快速檢測致病弧菌的方法作進一步的效果評估。
[0120] 1、靈敏度分析
[0121] 對不同編號的創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的菌液進行稀釋，分別使其稀釋后的濃度 為=Io5-Io1CFUAiL的菌懸液，以優(yōu)化后的檢測方法做創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌種內(nèi)含OmpU抗 體的免疫磁珠捕獲-單重PCR靈敏度檢測，檢測靈敏度達到Io 1CFUAiL如圖11和圖12所示。
[0122] 將副溶血弧菌、擬態(tài)弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌4種病原弧菌任意2或3種進行組合， 調(diào)整菌懸液濃度使其濃度為Io5-Io 1CFUAiL的稀釋梯度，分別添加對應的抗體制備的磁珠進 行細胞分離后進行DNA模板制備，根據(jù)混合DNA模板，添加對應的兩對或是三對引物，進行二 重PCR擴增以及三重PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物，實現(xiàn)同時檢測兩種或是三種弧菌。如圖13 所示，將結(jié)合有兔抗Vv-OmpU外膜蛋白血清、兔抗Vm-OmpU外膜蛋白的含OmpU抗體的免疫磁 珠等量混合后對Vv、Vm的混合菌懸液樣本進行同時捕獲-PCR檢測，檢測靈敏度都能達到 IO1，如圖13所示，擬態(tài)弧菌Vm的檢測靈敏度能到IO1U. 72 X Io1CFUAiL)，創(chuàng)傷弧菌Vv的檢測 靈敏度為IO1H. 35 X Io1CFUAiL)。同樣的，將結(jié)合有兔抗Vc-OmpU外膜蛋白血清、兔抗Vm-OmpU外膜蛋白的含OmpU抗體的免疫磁珠對Vc、Vm的混合菌懸液樣本進行捕獲-PCR同步檢測 中，檢測靈敏度都能達到IO 1，如圖14所示，擬態(tài)弧菌Vm的檢測靈敏度為2.15 X Io1CFUAiL，霍 亂弧菌Vc的檢測靈敏度為3.08X IO1CFUAiLt3以結(jié)合有兔抗Vc-OmpU外膜蛋白血清、兔抗Vp-OmpU外膜蛋白血清的含OmpU抗體的免疫磁珠等量混合后對Vp、Vc的混合菌懸液樣本進行捕 獲-PCR同步檢測中，檢測靈敏度也都能達到Io 1CFUAiU副溶血弧菌Vp的檢測靈敏度為2.15 X IO1CFlVmL,霍亂弧菌Vc的檢測靈敏度為3. IX Io1CFUAiU如圖15所示。對霍亂弧菌、擬態(tài) 弧菌、副溶血弧菌3種弧菌同時進行的同步檢測，檢測極限都能達到IO 1CFUmU如圖16所示。
[0123] 2、抗干擾性分析
[0124] 以霍亂弧菌的OmpU抗血清制備含OmpU抗體的免疫磁珠，在濃度梯度為IO5-IO1CFU/ mL的霍亂弧菌Vc的菌懸液中加入的創(chuàng)傷弧菌Vv、擬態(tài)弧菌Vm、溶藻弧菌VaU副溶血弧菌Vp 四種弧菌的混合菌懸液，制備成使霍亂弧菌Vc的菌懸液梯度中Io5-Io1CFUAiL含有濃度分別 為IO 5CFUAiL的4種混合弧菌，進一步研究在有混合菌的存在下對霍亂弧菌的檢測靈敏度。 如圖17所示，在加有混合菌的反應體系的檢測條帶從IO 3~IO1與不加混合菌的IO3~IO1的 條帶相比電泳條帶減弱，說明在有較高濃度的其他弧菌的存在的時候，還是會有一點影響 的，雖然這樣，但是對霍亂弧菌Vc的檢測極限還是能達到Io 1CFUAiL
[0125] 3、不同的鹽離子濃度對含OmpU抗體的免疫磁珠-PCR檢測效率的影響
[0126] 采用霍亂弧菌液濃度為105CFU/mL，鹽離子濃度分為roS、3%NaCl、4%NaCl、5% NaCl、6%NaCl，研究離子濃度對檢測效率的影響，如圖18所示，不同鹽離子濃度對含OmpU抗 體的免疫磁珠-PCR檢測效率沒有明顯的影響，可以直接對海水樣品、海產(chǎn)品樣品進行檢測。
[0127] 4、與其他弧菌檢測方法的比較
[0128] 與其他弧菌檢測方法，如國標法:檢測過程繁瑣，隨機性大，檢測時間所需時間長； 多重PCR法對坎氏弧菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌的檢出限為ΙΟ-lOOcell/pcr管;熒光檢測 法經(jīng)過6-8h的增菌培養(yǎng)后，對海產(chǎn)品的最低檢測限為lOcells/g;含OmpU抗體的免疫磁珠-環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)對牡蠣中的副溶血弧菌未增菌檢測檢出限為1.9 X IO3CFlVg等相比 較，本發(fā)明方法具有更好的檢測性能。本發(fā)明檢測不需要增菌培養(yǎng)，所需檢測時間短，并且 能同時檢測副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌中的1~5種，檢測靈敏度 可以達到I O1CFUAiL。
[0129] 綜上所述，本發(fā)明的含OmpU抗體的免疫磁珠-多重PCR檢測方法具有較高的靈敏 度，對主要的致病弧菌的檢測限為Io1CFUAiU檢測過程方便、迅速，可用于養(yǎng)殖業(yè)和海產(chǎn)品 對致病弧菌的檢測。
[0130] 以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利 范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬本發(fā)明所涵蓋的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，其特征在于，主要包括以下步驟： (1) 以一種或者多種弧菌的基因組作為模板進行PCR擴增OmpU基因； (2) 將步驟(1)所得PCR產(chǎn)物連接到pET-32a構(gòu)建異源表達載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌； (3) 將步驟(2)所得OmpU重組菌接種到LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入 終濃度為lmm〇l/L的IPTG誘導6h; (4) 離心收集步驟(3)所得菌體，利用親和層析進行純化，獲得純的OmpU重組蛋白； (5) 將步驟(4)所得純的Omp U重組蛋白作為抗原制備Omp U重組蛋白抗體； (6) 將磁珠混勻后加入離心管中，再加入洗滌緩沖液PBST混勻，置于裝有強力磁鐵的磁 架靜置，棄液體;重復操作多次后加入重懸液重懸磁珠； (7) 往步驟(6)的磁珠中加入步驟(5)所得OmpU重組蛋白抗體;4°C輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩孵育18 ~24h，制備成一種或者多種弧菌OmpU抗體的免疫磁珠； (8) 用洗滌緩沖液PBST清洗和重懸緩沖液重懸，4 °C保存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，其特征在于，所述弧菌包括副溶 血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，其特征在于，步驟(5)所述OmpU 重組蛋白抗體的制備主要包括:取純的OmpU重組蛋白作為抗原，與等體積的弗氏完全佐劑 混合、乳化、皮下注射，免疫大白兔;每隔兩周加強免疫一次，加強免疫時，免疫劑量減半且 與弗氏不完全佐劑乳化。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述含OmpU抗體的免疫磁珠的制備，其特征在于，所述LB培養(yǎng)基中包 含氨芐青霉素 lOOyg/mL;所述親和層析為鎳瓊脂糖凝膠;所述重懸液包含PBST和1 %牛血清 白蛋白；所述重懸緩沖液包含PBST和0.5 %牛血清白蛋白；所述OmpU重組蛋白抗體的添加量 為 500yL/200yg 磁珠。5. -種根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述制備方法制備的含OmpU抗體的免疫磁珠。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法，其 特征在于，主要包括以下步驟： (51) 制備待測樣品； (52) 將一種或多種含待測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠加入待測樣品中，37°C振蕩反應 2~3h;所述含待測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠添加量30μg/ml; (53) 用磁鐵將所述含待測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠與待測樣品基質(zhì)分開，去除待測 樣品基質(zhì)，得到含待測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠-弧菌免疫復合體； (54) 將(S3)中得到的含待測弧菌的OmpU抗體的免疫磁珠-弧菌免疫復合體用洗滌緩沖 液TOST洗滌干凈，再加入裂解液，80 °C中煮15min釋放DNA，然后離心，取上清作為PCR擴增模 板進行PCR擴增； (55) 將步驟(S4)所得PCR擴增引物采用基于dnaj基因設計制備單重或多重PCR反應體 系； (56) 將單重或多重PCR反應體系置于離心機中瞬時離心，然后放到PCR儀上進行PCR反 應； (57) 最后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法，其 特征在于，步驟(S1)所述制備待檢測的樣品包括:水樣直接用滅菌的離心管取樣檢測;泥樣 加入滅菌的PBS混勻后，取上清檢測；魚蝦蟹取可食部位碾成糜，再加入滅菌的PBS混勻后， 取上清檢測。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法，其 特征在于，所述單重PCR反應體系的制備為:將2yL步驟S4所得DNA作為PCR模板，加入0.5yL 上游引物VM-F，再加入0.5yL待檢測的弧菌的特異性引物、12.5yL PCRMix、加水至25yL;所 述多重PCR反應體系的制備為將2yL步驟S4所得DNA作為PCR模板，加入lyL上游引物VM-F，加 入帶檢測的幾種弧菌的特異性引物各0.5yL、12.5yL PCRMix，加水至25yL。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述含OmpU抗體的免疫磁珠捕獲-多重PCR檢測病原弧菌的方法，其 特征在于，所述PCR反應的條件為：stepl :95°C預變性5111；[11;8丨6卩2:94°(^變性458;8丨6卩3:62 °C 變性 45s; step4:72°C 變性 30s ~lmin; step2~step4:35 個循環(huán)；step5:72°C lOmin。
【文檔編號】C07K16/12GK105859883SQ201610237489
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】胡忠, 倫鏡盛, 劉丹, 張設熙, 董亞萍, 袁傳飛
【申請人】汕頭大學