抗人肺炎支原體p30蛋白抗體及應(yīng)用該抗體的免疫層析試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗人肺炎支原體P30蛋白抗體及應(yīng)用該抗體檢測(cè)人肺炎支原體的免疫層析試劑盒，抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是識(shí)別人肺炎支原體P30蛋白56?69位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體，人肺炎支原體P30蛋白在GenBank序列號(hào)是ABR09215.1；人肺炎支原體P30蛋白56?69位的氨基酸序列為AEEDTVQIQGKPIT。本發(fā)明所提供的兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體具有特異性好、純度高、效價(jià)高、制備成本低廉的特點(diǎn)。
【專利說明】
抗人肺炎支原體P30蛋白抗體及應(yīng)用該抗體的免疫層析試 劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗人肺炎支原體P30蛋白抗體及應(yīng)用該抗體 檢測(cè)人肺炎支原體的免疫層析試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎支原體(M. Pneumonia)是人類支原體肺炎的病原體。支原體肺炎的病理改變 以間質(zhì)性肺炎為主，有時(shí)并發(fā)支氣管肺炎，稱為原發(fā)性非典型性肺炎。主要經(jīng)飛沫傳染，潛 伏期2~3周，發(fā)病率以青少年最高。臨床癥狀為頭痛、咽痛、發(fā)熱、咳嗽等一般的呼吸道癥 狀，一年四季均可發(fā)生，但多在秋冬時(shí)節(jié)。Mp感染在小兒肺炎病原的發(fā)生率高達(dá)10-30%，近 年來逐漸成為小兒感染呼吸道疾病的主要病原體之一。該病極易引發(fā)咽炎、扁桃體炎等呼 吸道感染，甚至可能同時(shí)繼發(fā)腦膜炎、肝炎、心肌炎等多臟器損傷，嚴(yán)重時(shí)也可導(dǎo)致患兒死 亡。
[0003] 由于Mp感染與其它病原體引起的呼吸道感染癥狀類似，不做病原學(xué)檢查，很難將 Mp與其它病原體引起的呼吸道感染相區(qū)別。Mp無細(xì)胞壁，常用的β-內(nèi)酰胺類藥物對(duì)其無效， 故其引起的感染的治療與其它細(xì)菌和病毒感染的治療方案完全不同，因此建立簡(jiǎn)便、快速、 可行、能早期診斷肺炎支原體感染的方法非常必要。
[0004] 目前Mp的檢測(cè)方法主要有3類:一是分離培養(yǎng)法，其是證實(shí)感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但由 于Mp的生長(zhǎng)周期極為緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，導(dǎo)致該法在臨床上不能進(jìn)行快速診斷;二是血清學(xué) 方法，即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗(yàn)等，檢測(cè)被檢者 血清中Mp抗體水平，可間接提示Mp感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診 斷，而且有時(shí)需要雙份血清。另外，抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存 在Mp特異性抗體的差異，并且，Mp細(xì)胞膜上的糖脂抗原與其他微生物及機(jī)體組織存在非特 異性交叉反應(yīng)，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制;三是利用分子生物學(xué)技術(shù)檢 測(cè)Mp DNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前 研究Mp感染的重要手段，但由于PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽性，在我 國還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立Mp特異性抗原診斷方法十分必要。目前，已 公開報(bào)道的檢測(cè)Mp抗原的方法主要為雙抗夾心ELISA法，間接免疫熒光法，量子點(diǎn)標(biāo)記免疫 層析法等，但這些方法均不能實(shí)行床旁檢測(cè)，需要到特定的場(chǎng)合利用特定的儀器（如酶標(biāo) 儀、熒光儀等)來檢測(cè)，不僅不夠方便快捷而且時(shí)間較長(zhǎng)，臨床應(yīng)用較為不便。
[0005] 因此，建立人肺炎支原體特異性抗原的快速診斷方法十分必要。由于人流感肺炎 支原體Ρ30蛋白序列上的高度保守性，使其成為了一個(gè)重要的檢測(cè)標(biāo)的。因此獲得高特異性 的抗人肺炎支原體Ρ30蛋白抗體就是一個(gè)十分重要的工作。目前，關(guān)于抗人肺炎支原體Ρ30 蛋白抗體報(bào)道得最多的為相應(yīng)的單克隆抗體及多克隆抗體。單克隆抗體最大的優(yōu)點(diǎn)就是特 異性高，但是制備方法繁瑣，生產(chǎn)成本高，限制了其應(yīng)用。多克隆抗體主要由基因工程表達(dá) 的Ρ30蛋白免疫家兔等動(dòng)物制備而成。其制備方法簡(jiǎn)單，成本低，但是基因工程表達(dá)的Ρ30蛋 白為包涵體結(jié)構(gòu)，不具天然蛋白結(jié)構(gòu)，用其制備的抗體其具有特異性低、效價(jià)低等缺陷。因 此，低成本的制備高特異性、高效價(jià)的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體就顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供識(shí)別人肺炎支原體 P30蛋白56-69位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體及應(yīng)用該抗體的免疫層析試劑盒。
[0007] 抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，其特征在于:所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是 識(shí)別人肺炎支原體P30蛋白56-69位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體，所述人肺炎支原 體P30蛋白在GenBank序列號(hào)是ABR09215.1;所述人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨基 酸序列為AEEDTVQIQGKPIT;將人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨基酸的序列命名為 P30Line;所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是AbP30Line。
[0008] 一種基于如前所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其 特征在于:所述試劑盒是基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒或基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的 免疫層析試劑盒。
[0009] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的試劑盒是基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒時(shí)， 所述試劑盒的制備方法是：
[00?0] 1)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line:
[0011] 向微量離心管中依次加入〇.4nmol羧基水溶性量子點(diǎn)和800nmol碳二亞胺EDC，以 MES緩沖液定容為lml，混合溶液，37°C反應(yīng)5min后，再加入0.34mg的制備得到的抗體 AbP30Line，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為1 % (m/v)，封閉未 反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)Ih;反應(yīng)后的樣品用超濾管離心（截留分子量100k)， 6500g離心5min，至體積200ul，將超濾后樣品轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)，離心除團(tuán)聚，得到上部清 液以及下部沉淀，1000 Og條件下離心3min;將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待 上部清液自然流入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開 始從下部流出時(shí)開始收集，收集Iml后停止收集;將純化后的樣品用超濾管（截留分子量 100k)以6500g離心濃縮至200ul后轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)離心除團(tuán)聚，對(duì)普通EP管進(jìn)行離心的 條件是10000g，3min;獲取上清后以磷酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存?zhèn)溆茫恢链酥频煤?量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液；
[0012] 所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES 緩沖液的pH 7.4;
[0013] 所述磷酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、 〇.2g氯化鈉、Ig牛血清白蛋白BSA以及0. lgNaN3,溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH 調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100mL;
[0014] 2)制備結(jié)合墊
[0015] 將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液中l(wèi)h， 取出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cm X 0 · 6cm/條后，4 °C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊；
[0016] 3)制備樣品塾
[0017] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3h，再置于生 物安全柜內(nèi)37°C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cmX 2.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封保 存；
[0018] 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、 〇. 2g氯化鈉、2g牛血清白蛋白BSA、Iml吐溫-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶 解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100mL;
[0019] 4)制備檢測(cè)層
[0020] 以申請(qǐng)?zhí)枮?01410405275.3發(fā)明名稱為"人肺炎支原體金標(biāo)銀染免疫層析檢測(cè)試 劑盒及其制備方法和應(yīng)用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內(nèi)容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0021] 將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-HiS融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設(shè)置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設(shè)置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢測(cè)線間距為 0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cmX4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存；至 此制得檢測(cè)層；
[0022] 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是：稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉以 及〇. 2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至 100ml；
[0023] 5)組裝檢測(cè)卡
[0024] 5 · 1)將底板裁剪成4cm X 7 · 3cm大小，備用；
[0025] 5 · 2)將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用；
[0026] 5.3)將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護(hù)膜揭掉，將步驟4)所述的檢測(cè)層即 帶有質(zhì)控線和檢測(cè)線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面；
[0027] 5.4)將步驟5.2)準(zhǔn)備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測(cè)層右末端 有0.2cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對(duì)齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結(jié) 合墊按0 · 3cm重疊于檢測(cè)層的左邊緣處，0 · 3cm粘于底板上；
[0028] 5.5)將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.3cm重疊于結(jié)合墊的左邊緣處，另一邊與 底板的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁成4.Omm寬的檢測(cè) 卡，4°C密封干燥避光保存。
[0029] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的試劑盒是基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒時(shí)， 所述試劑盒的制備方法是：
[0030] 1)膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line:
[0031] 1 · 1)制備30nm膠體金溶液：
[0032] 取一個(gè)硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將Iml 1 % (m/v)HAuCl4溶液加入 250ml三角瓶中并與超純水混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰；向250ml三角瓶中快速加入2ml 1 % (m/v)檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼續(xù)沸騰IOmin，待250ml三角瓶中的溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)?紅色時(shí)停止加熱，將250ml三角瓶中的溶液自然冷卻至室溫，然后向250ml三角瓶中加入超 純水補(bǔ)齊至100ml;
[0033] 1 · 2)膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line:
[0034] 1.2.1)取一個(gè)硅化好的50ml三角瓶，加入IOml步驟1.1)所制備的膠體金溶液，向 膠體金液中加入240111 0.2111〇1/11(2〇)3調(diào)節(jié)?!1至8.5;
[0035] 1.2.2)在電磁攪拌器攪拌下，將抗體AbP30Line加入膠體金溶液中，至抗體終濃度 為10ug/ml，加入抗體時(shí)逐滴加入，加完后繼續(xù)攪拌45min~60min;
[0036] 1.2.3)反應(yīng)完成加入5% (m/v)牛血清白蛋白BSA至終濃度為1 % (m/v)，攪拌15~ 30分鐘，4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0037] 1.2.4)將標(biāo)記好的抗體六匕?301^1^取出后裝入5〇1111離心管，250(^，4°(：離心5分鐘， 得到下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉(zhuǎn)移至另一只50ml離心管，12000g，4°C 離心30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用IOml膠體金緩沖液重 懸沉淀，然后再12000g，4°C離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最后用 3ml膠體金緩沖液重懸，4 °C保存?zhèn)溆?，得到含有膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液；
[0038] 所述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、l%m/vBSA、l%v/v Tween- 20、5 %m/v蔗糖以及3%〇πι/ν聚乙烯吡咯烷酮PVP-IO，所述膠體金緩沖液的pH為10.5;
[0039] 2)制備結(jié)合墊
[0040]將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液中l(wèi)h， 取出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cm X 0 · 6cm/條后，4 °C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊； [0041] 3)制備樣品塾
[0042]取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少2h，再置于生 物安全柜內(nèi)37°C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cmX 1.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封保 存；
[0043] 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.242g TrisUg牛血清白蛋白BSAUml吐 溫-20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-IO，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH 調(diào)pH至11后用去離子水定容至100mL;
[0044] 4)制備檢測(cè)層
[0045]以申請(qǐng)?zhí)枮?01410405275.3發(fā)明名稱為"人肺炎支原體金標(biāo)銀染免疫層析檢測(cè)試 劑盒及其制備方法和應(yīng)用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內(nèi)容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0046]將硝酸纖維素膜剪成4cmX 2cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-His融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設(shè)置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設(shè)置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢測(cè)線間距為 0.5cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥18h，剪裁成4cmX2cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存;至 此制得檢測(cè)層；
[0047] 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是：稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉以 及〇. 2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至 100ml；
[0048] 5)組裝檢測(cè)卡
[0049] 5 · 1)將底板裁剪成4cm X 6cm大小，備用；
[0050] 5 · 2)將吸水濾紙裁剪成4cm X 2 · 5cm大小，作為吸水墊，備用；
[0051] 5.3)將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護(hù)膜揭掉，將步驟4)所述的檢測(cè)層即 帶有質(zhì)控線和檢測(cè)線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面；
[0052] 5.4)將步驟5.2)準(zhǔn)備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測(cè)層右末端 有0.2cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對(duì)齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結(jié) 合墊按0 · 2cm重疊于檢測(cè)層的左邊緣處，0 · 4cm粘于底板上；
[0053] 5.5)將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.2cm重疊于結(jié)合墊的左邊緣處，另一邊與 底板的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁成4.Omm寬的檢測(cè) 卡，4°C密封干燥避光保存。
[0054]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0055] 本發(fā)明提供了抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，該抗人肺炎支原體P30蛋白抗體識(shí)別 人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨基酸所組成的線性抗原表位，人肺炎支原體P30蛋 白在GenBank序列號(hào)是ABR09215.1;人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨基酸的氨基酸 序列為AEEDTVQIQGKPIT;將人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨基酸的序列命名為 P30Line;抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是AbP30Line。基于人肺炎支原體單一線性抗原表位 所制備的上述兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體具有特異性好、純度高、效價(jià)高、制備成本低 廉的特點(diǎn)，可用于生產(chǎn)各種基于抗原-抗體反應(yīng)的原理的高靈敏度檢測(cè)人肺炎支原體的檢 測(cè)試劑盒。同時(shí)，基于該抗人肺炎支原體P30蛋白抗體還制備得到了兩種不同的免疫層析試 劑盒。兩種不同的免疫層析試劑盒能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)生物樣品中的人肺炎支原體，其均包括 本發(fā)明所述的抗體;兩種免疫層析試劑盒均可用于人肺炎支原體感染的輔助診斷，具有更 高的靈敏性與特異性，同時(shí)兼顧了簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定以及制造成本低等優(yōu)勢(shì)，適用于臨床標(biāo) 本的檢查，而且由于可以進(jìn)行大批量的快速檢查，也適合于流行病學(xué)調(diào)查。因此，本發(fā)明所 述的兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，兩種免疫層析試劑盒均具有廣泛的應(yīng)用前景和實(shí)用 價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 為了有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，下文特舉較佳實(shí)施例詳細(xì) 說明本發(fā)明。
[0057] 本申請(qǐng)文件中濃度單位中的"m/v"，當(dāng)m單位為g時(shí)，V單位為mL，屬于本領(lǐng)域的常 識(shí)。
[0058] 本發(fā)明使用或采用的各種材料的來源及相關(guān)試劑的配制
[0059] 1、樣品墊處理液:稱取0.242g Tris，Ig牛血清白蛋白（BSA)，Iml吐溫-20，5g蔗糖， 〇.3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至11后用去 離子水定容至l〇〇ml。
[0060] 2、磷酸鹽保存液:稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、0.2g氯化鈉、Ig牛 血清白蛋白BSA以及0.1gNaN3，溶解于90ml的去離子水中，用lmoI/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去 離子水定容至100ml;
[0061 ] 3、磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取0.29g磷酸氫二鈉，0.0295g磷酸二氫鈉，0.2g氯化鈉， 溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100ml。
[0062] 4、樣品處理液:稱取0.0121g三羥甲基氨基甲烷，0.17g氯化鈉，0.025g溶菌酶溶解 于90ml去離子水中，用鹽酸調(diào)pH至8.0后用去離子水定容至100mL。
[0063] 5、抗體AbP30Line:為本發(fā)明自制，用PBS稀釋，搖勻，使溶液中抗體濃度為3mg/ml。
[0064] 6、兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG:為本發(fā)明自制，用PBS稀釋，搖勻，使 溶液中抗體濃度為3mg/ml。
[0065] 7、羊抗兔IgG:為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，用I3BS稀釋，搖勻，使溶液中 多克隆抗體濃度為lmg/ml。
[0066] 8、量子點(diǎn):本發(fā)明中所用量子點(diǎn)為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子 點(diǎn)，其發(fā)射波長(zhǎng)為565nm，購買自武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限公司，產(chǎn)品名稱為羧基水溶 性量子點(diǎn)_565。
[0067] 9、玻璃纖維素膜:厚度為0 · 4mm，吸水量為42mg/cm2，玻璃纖維直徑為0 · 6-3μπι，具 有良好的親水性，購買于上海金標(biāo)生物科技有限公司（型號(hào)為ΒΤ40)。
[0068] 10、聚酯纖維膜:厚度為0.48mm，吸水速度為18s/4cm，具有極好的親水性，用于結(jié) 合墊的制備，購買于上海金標(biāo)生物科技有限公司（型號(hào)為DL42)。
[0069] 11、硝酸纖維素膜：型號(hào)為Millipore Corp SHF135,有襯板，購買于Millipore公 司。
[0070] 12、吸水濾紙:厚度為0.95mm，吸水速度為60s/4cm，吸水量為700mg/cm2，具有良好 的吸水性，作為制作吸水墊的材料。購買于上海金標(biāo)生物科技有限公司（型號(hào)為CH37K)。
[0071] 13、底板:為高白度PVC材質(zhì)，表面涂布單層高聚合物壓敏膠SM31-40，購買于上海 金標(biāo)生物科技有限公司。
[0072] 14、人肺炎支原體:購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號(hào)為ATCC15531。
[0073] 15、本發(fā)明所用到的微生物樣品均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
[0074]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明：
[0075] 實(shí)施例1兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的制備
[0076] 兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的制備方法如下：
[0077] 1)經(jīng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究后，選定人肺炎支原體P30蛋白（GenBank序 列號(hào)ABR09215.1)56-69位的14個(gè)氨基酸作為制備兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的線性抗 原表位，該段氨基酸序?yàn)锳EEDTVQIQGKPIT，將此序列命名為P30Line;
[0078] 2)將步驟1)所述的氨基酸序列P30Line的C端添加一個(gè)半胱氨酸后，用多肽自動(dòng)合 成儀合成多肽并純化，純化后的多肽與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成P30Line-KLH復(fù)合蛋白；
[0079] 3)將步驟2)所合成的復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三 次，每次間隔7-10天；
[0080] 4)第三次注射10-12天后，收集、分離得到含有兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的 血清，ELISA檢測(cè)血清中兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的效價(jià)，所述的兔抗人肺炎支原體 P30蛋白抗體的效價(jià)均在1:60000以上；
[0081] 5)將步驟2)合成并純化的多肽與溴化氰活化的Sepharose 4B偶聯(lián)，形成多肽親和 層析柱；
[0082] 6)將步驟4)獲得的含有兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的血清加入到步驟5)制備 的親和層析柱中，并在4°C孵育過夜后，洗脫抗體，得到兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體;經(jīng) SDS-PAGE鑒定其純度均在97 %以上，將這種純化的抗體命名為AbP30Line。
[0083] 本實(shí)施例中步驟2)_6)皆是現(xiàn)有成熟技術(shù)，多家生物科技公司都可以提供程序化 的技術(shù)服務(wù)。本實(shí)施例中上述步驟中相關(guān)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的具體實(shí)施，系委托南京金斯瑞生物科 技有限公司完成。
[0084] 本發(fā)明所述"抗體"應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性 結(jié)合因子。因而，這個(gè)術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功 能同等物和同源物?？贵w的實(shí)例是免疫球蛋白亞型（如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亞型亞 類;也可以是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1和雙鏈抗體。
[0085] 實(shí)施例2基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的制備及應(yīng)用
[0086] 1 ·量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line
[0087] 向微量離心管中依次加入0.4nm〇l羧基水溶性量子點(diǎn)和800nmol碳二亞胺(EDC)， 以MES緩沖液（10.66g/L MES，0.74g/L EDTA pH 7.4)定容為lml，不停地混合溶液，37°C反 應(yīng)5min后，再加入0.34mg的實(shí)施例1所制備的抗體AbP30Line，避光反應(yīng)2h，加入單端氨基聚 乙二醇(PEG2000-NH2)至終濃度為l%(m/v)，封閉未反應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng) lh。反應(yīng)后的樣品用超濾管離心（截留分子量100k)，6500g離心5min，至體積200ul，將超濾 后樣品轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)，離心除團(tuán)聚（1000 Og，3min)。將上部清液加到分離柱(Superdex-200)上純化，待其自然流入柱體中，然后用PBS沖洗(液體自然流下），用紫外光照射柱體隨 時(shí)觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流出時(shí)開始收集，收集Iml后停止收集。將純化后的 樣品用超濾管（截留分子量100k)以6500g離心濃縮至200ul后轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)離心 (10000g，3min)除團(tuán)聚。獲取上清后以磷酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存?zhèn)溆谩Ｖ链酥频煤?有量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液。
[0088] 2.結(jié)合墊的制備
[0089] 將聚酯纖維膜浸入步驟1所得到的含有量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液中l(wèi)h，取 出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cmX 0.6cm/條后，4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊。
[0090] 3.樣品墊的制備
[0091]取玻璃纖維素膜一張，將其在樣品墊處理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜內(nèi) 37 °C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cm X 2 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存。
[0092] 4.檢測(cè)層的制備
[0093]以申請(qǐng)?zhí)枮?01410405275.3發(fā)明名稱為"人肺炎支原體金標(biāo)銀染免疫層析檢測(cè)試 劑盒及其制備方法和應(yīng)用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內(nèi)容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0094]將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-His融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設(shè)置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設(shè)置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢測(cè)線間距為 0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cmX4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存；至 此制得檢測(cè)層；
[0095] 5.檢測(cè)卡的組裝
[0096] 將底板裁剪成4cmX 7.3cm大小，備用。
[0097] 將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用。
[0098] 組裝工作于生物安全柜內(nèi)操作，首先將底板上的粘性保護(hù)膜揭掉，將步驟4所述的 檢測(cè)層即帶有質(zhì)控線和檢測(cè)線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并小心抹平膜面。其次，將事 先裁好的吸水墊組裝到底板上，使其左邊與檢測(cè)層右末端有〇. 2cm的重疊，其右邊緣則與底 板的右邊緣對(duì)齊粘好并小心抹平。再將步驟2所述的結(jié)合墊按0.3cm重疊于檢測(cè)層的左邊緣 處，0.3cm粘于底板7上。最后將步驟3所述的樣品墊則按一邊0.3cm重疊于結(jié)合墊的左邊緣 處，另一邊與底板的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并小心抹平。將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁 成4. Omm寬的檢測(cè)卡，4 °C密封干燥避光保存。
[00"] 6.基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的組成
[0100] 基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒由步驟5所述的檢測(cè)卡及樣品處理液所組 成。
[0101] 7.基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的使用方法
[0102] 按常規(guī)方法獲得待檢者的咽拭子，將其插入裝有500μ1樣品處理液的軟質(zhì)塑料管 中，擠壓塑料管壁，使拭子上的樣品充分溶解后取出120yL滴于檢測(cè)卡的樣品墊上，15分鐘 后于紫外分析儀下（型號(hào)為WD-9403A，北京六一儀器廠生產(chǎn)，紫外激發(fā)波長(zhǎng)365nm)觀察檢測(cè) 結(jié)果。若咽拭子中含有人肺炎支原體抗原，則與結(jié)合墊中的量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體AbP30Line結(jié) 合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG結(jié)合后 在紫外線激發(fā)下在檢測(cè)線處會(huì)形成肉眼可見的一條熒光檢測(cè)線，未結(jié)合完的量子點(diǎn)標(biāo)記抗 體繼續(xù)層析與羊抗兔IgG結(jié)合后在紫外線激發(fā)下形成肉眼可見的第二條熒光質(zhì)控線;若待 檢咽拭子中無相關(guān)抗原，則僅出現(xiàn)一條熒光質(zhì)控線。如果熒光質(zhì)控線未出現(xiàn)，則該檢測(cè)卡失 效。
[0103] 8.基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的應(yīng)用效果舉例
[0104] 本實(shí)施例中所指的基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的使用方法參照步驟7 所述的操作步驟。
[0105] 1)特異性試驗(yàn)
[0106] 用呼吸道常見病原體如嗜肺軍團(tuán)菌(ATCC 33152)、人III型副流感病毒病毒(ATCC VR-93)、人流感嗜血桿菌(ATCC 53781)、人肺炎衣原體(AR-39株，ATCC編號(hào)53592)、人腺病 毒3型（GB株，ATCC編號(hào)VR-3)、人腺病毒7型（Gomen株，ATCC編號(hào)VR-7)、人甲型流感病毒 (HlNl，ATCC編號(hào)VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC編號(hào)VR-790)、人呼吸道合胞病毒(ATCC編 號(hào)VR26)、人肺炎鏈球菌(ATCC編號(hào)700670)等代替人肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)含這 些微生物的磷酸鹽緩沖液稀釋液都為陰性。
[0107] 2)臨床測(cè)試?yán)?br>[0108] 以人肺炎支原體檢測(cè)"金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法作為參照，取100例呼吸科呼吸道感染者的 咽拭子標(biāo)本用步驟6所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)法陽性率為13% (13/100)，本試劑盒為 13% (13/100)，2種方法的符合率為98% (98/100)。具體結(jié)果如表1所示。
[0109] 表1臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果
[0111]實(shí)施例3基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的制備及應(yīng)用 [0112] 1 ·膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line
[0113] a.30nm膠體金的制備
[0114] 取一硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將Iml 1 % (m/v)HAuC14溶液加入其 中混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰。向其中快速加入2ml 1 % (m/v)檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼 續(xù)沸騰IOmin(這個(gè)過程中溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色）。停止加熱，讓溶液自然冷卻至室溫，然 后向其中加入超純水補(bǔ)齊至l〇〇ml。
[0115] b.膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line
[0116] 1)取一硅化好的50ml三角瓶，加入IOml步驟a所制備的膠體金金液，向金液中加入 24〇1110.2111〇1/11(2〇)3調(diào)節(jié)?11至8.5 ;
[0117] 2)在電磁攪拌器攪拌下，將抗體AbP30Line加入膠體金溶液中，至抗體終濃度為 10ug/ml，加入抗體時(shí)應(yīng)逐滴加入，加完后繼續(xù)攪拌45min~60min;
[0118] 3)反應(yīng)完成加入2.5ml 5% (m/v)牛血清白蛋白（BSA)至終濃度為1 % (m/v)，攪拌 15~30分鐘，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0119] 4)將標(biāo)記好的抗體AbP30Line取出后裝入50ml離心管，2500g，4°C離心5分鐘，得到 下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉(zhuǎn)移至另一只50ml離心管，12000g，4°C離心 30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用IOml膠體金緩沖液重懸沉 淀，然后再12000g，4°C離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最后用3ml 膠體金緩沖液重懸，4°C保存?zhèn)溆?，得到含有膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液；
[0120] 上述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、l%(m/V)BSA、l%(V/v) 1'冊(cè)〇11-20、5%(111八)蔗糖以及3%。(111八)聚乙烯吡咯烷酮?￥?-10，所述膠體金緩沖液的？!1為 10.5〇
[0121] 2.結(jié)合墊的制備
[0122] 將聚酯纖維膜浸入步驟1所得到的含有膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液中l(wèi)h，取 出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cmX 0.6cm/條后，4°C密封保存?zhèn)溆茫链酥频媒Y(jié)合墊。
[0123] 3.樣品墊的制備
[0124] 取玻璃纖維素膜一張，將其在樣品墊處理液中浸泡至少2h，再置于生物安全柜內(nèi) 37 °C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cm X 2 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存。
[0125] 4.檢測(cè)層的制備
[0126] 以申請(qǐng)?zhí)枮?01410405275.3發(fā)明名稱為"人肺炎支原體金標(biāo)銀染免疫層析檢測(cè)試 劑盒及其制備方法和應(yīng)用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內(nèi)容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0127] 將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-His融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設(shè)置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設(shè)置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢測(cè)線間距為 0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cmX4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存；至 此制得檢測(cè)層。
[0128] 5.檢測(cè)卡的組裝
[0129] 將底板裁剪成4cm X 6cm大小，備用。
[0130]將吸水濾紙裁剪成4cm X 2 · 5cm大小，作為吸水墊，備用。
[0131] 組裝工作于生物安全柜內(nèi)操作，首先將底板上的粘性保護(hù)膜揭掉，將步驟4所述的 檢測(cè)層即帶有質(zhì)控線和檢測(cè)線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并小心抹平膜面。其次，將事 先裁好的吸水墊組裝到底板上，使其左邊與檢測(cè)層右末端有〇. 2cm的重疊，其右邊緣則與底 板的右邊緣對(duì)齊粘好并小心抹平。再將步驟2所述的結(jié)合墊按0.2cm重疊于檢測(cè)層3的左邊 緣處，0.4cm粘于底板上。最后將步驟3所述的樣品墊則按一邊0.2cm重疊于結(jié)合墊的左邊緣 處，另一邊與底板的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并小心抹平。將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁 成4. Omm寬的檢測(cè)卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0132] 6.基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的組成
[0133] 基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒由步驟5所述的檢測(cè)卡及樣品處理液所組 成。
[0134] 7.基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的使用方法
[0135] 按常規(guī)方法獲得待檢者的咽拭子，將其插入裝有500μ1樣品處理液的軟質(zhì)塑料管 中，擠壓塑料管壁，使拭子上的樣品充分溶解并50°C水浴20min后，后取出120yL滴于檢測(cè)卡 的樣品墊上，15分鐘后肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。若咽拭子中含有人肺炎支原體抗原，則與結(jié)合墊 中的膠體金標(biāo)記的抗體AbP30Line結(jié)合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG結(jié)合后在在檢測(cè)線處會(huì)形成肉眼可見的一條紅色檢測(cè)線，未結(jié) 合完的膠體金標(biāo)記抗體繼續(xù)層析與羊抗兔IgG結(jié)合后形成肉眼可見的第二條紅色質(zhì)控線； 若待檢咽拭子中無相關(guān)抗原，則僅出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控線。如果紅色質(zhì)控線未出現(xiàn)，則該檢測(cè) 卡失效。
[0136] 8.基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的應(yīng)用效果舉例
[0137] 本實(shí)施例中所指的基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒的使用方法參照步驟7 所述的操作步驟。
[0138] 1)特異性試驗(yàn)
[0139] 用呼吸道常見病原體如嗜肺軍團(tuán)菌(ATCC 33152)、I型人副流感病毒(ATCC VR-94)、II型人副流感病毒(ATCC VR-92)、III型人副流感病毒病毒(ATCC VR-93)、人流感嗜血 桿菌(ATCC 53781)、人肺炎衣原體(AR-39株，ATCC編號(hào)53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC編 號(hào)VR-3)、人腺病毒7型（Gomen株，ATCC編號(hào)VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC編號(hào)VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC編號(hào)VR-790)、人呼吸道合胞病毒(ATCC編號(hào)VR26)、人肺炎鏈 球菌(ATCC編號(hào)700670)等代替人肺炎支原體進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒檢測(cè)含這些微生物的磷酸鹽 緩沖液稀釋液都為陰性。
[0140] 2)臨床測(cè)試?yán)?br>[0141] 以人肺炎支原體檢測(cè)"金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法作為參照，取100例呼吸科呼吸道感染者的 咽拭子標(biāo)本用步驟6所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)法陽性率為13% (13/100)，本試劑盒為 12% (12/100)，2種方法的符合率為97% (97/100)。具體結(jié)果如表1所示。
[0142] 表1臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果
[0144]需要指出的是，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡 在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換等均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，其特征在于:所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體 是識(shí)別人肺炎支原體P30蛋白56-69位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體，所述人肺炎支 原體P30蛋白在GenBank序列號(hào)是ABR09215.1;所述人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨 基酸序列為AEEDTVQIQGKPIT;將人肺炎支原體P30蛋白56-69位的14個(gè)氨基酸的序列命名為 P30Line;所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是AbP30Line。2. -種基于如權(quán)利要求1所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑 盒，其特征在于:所述試劑盒是基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒或基于膠體金標(biāo)記 技術(shù)的免疫層析試劑盒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其特 征在于:所述試劑盒是基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒時(shí)，所述試劑盒的制備方法 是： 1) 量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line: 向微量離心管中依次加入0.4 nmol羧基水溶性量子點(diǎn)和800 nmol碳二亞胺EDC，以MES 緩沖液定容為1 ml，混合溶液，37 °C反應(yīng)5 min后，再加入0.34 mg的制備得到的抗體 AbP30Line，避光反應(yīng)2 h，加入單端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為l%m/v，封閉未反 應(yīng)的活化羧基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)1 h;反應(yīng)后的樣品用超濾管離心，6500g離心5min，至體 積200ul，將超濾后樣品轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)，離心除團(tuán)聚，得到上部清液以及下部沉淀， 10000g條件下離心3min;將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待上部清液自然流 入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流出時(shí) 開始收集，收集1 ml后停止收集;將純化后的樣品用超濾管以6500g離心濃縮至200ul后轉(zhuǎn) 移至普通EP管內(nèi)離心除團(tuán)聚，對(duì)普通EP管進(jìn)行離心的條件是10000g，3min;獲取上清后以磷 酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存?zhèn)溆?至此制得含有量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液； 所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA，所述MES緩 沖液的pH 7.4; 所述磷酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉、0.2 g 氯化鈉、1 g牛血清白蛋白BSA以及0.1 gNaN3,溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100 ml; 2) 制備結(jié)合墊 將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液中1 h，取 出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cm X 0 · 6cm/條后，4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊； 3) 制備樣品墊 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3 h，再置于生物安 全柜內(nèi)37 °C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cm X 2 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存； 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉、0.2 g 氯化鈉、2 g牛血清白蛋白BSA、1 ml吐溫-20、2 g蔗糖以及0.5 g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10， 溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100 ml; 4) 制備檢測(cè)層 4.1) 制備兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG; 4.2) 將硝酸纖維素膜剪成4(^\4(^大小;將步驟4.1)制備得到的兔抗重組？1-把8融合 蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2.0 mg/mL及1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設(shè) 置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設(shè)置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢測(cè)線間距為 0.7 cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2 h，剪裁成4cmX4cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存； 至此制得檢測(cè)層； 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是:稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉以及 0.2 g氯化鈉，溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至 100 ml； 5)組裝檢測(cè)卡 5.1) 將底板裁剪成4cm X 7.3cm大小，備用； 5.2 )將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用； 5.3) 將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護(hù)膜揭掉，將步驟4)所述的檢測(cè)層即帶有 質(zhì)控線和檢測(cè)線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面； 5.4) 將步驟5.2)準(zhǔn)備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測(cè)層右末端有 0.2 cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對(duì)齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結(jié) 合墊按0.3 cm重疊于檢測(cè)層的左邊緣處，0.3 cm粘于底板上； 5.5) 將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.3 cm重疊于結(jié)合墊的左邊緣處，另一邊與底板 的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁成4.0 mm寬的檢測(cè)卡， 4 °C密封干燥避光保存。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其特 征在于:所述試劑盒是基于膠體金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒時(shí)，所述試劑盒的制備方法 是： 1)膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line: 1.1) 制備30 nm膠體金溶液： 取一個(gè)硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將1 ml l%(m/v)HAuCl4溶液加入250ml 三角瓶中并與超純水混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰；向250ml三角瓶中快速加入2ml l%m/v 檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼續(xù)沸騰l〇min，待250ml三角瓶中的溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色時(shí)停 止加熱，將250ml三角瓶中的溶液自然冷卻至室溫，然后向250ml三角瓶中加入超純水補(bǔ)齊 至100ml; 1 · 2)膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line: 1.2.1) 取一個(gè)硅化好的50ml三角瓶，加入10 ml步驟1.1)所制備的膠體金溶液，向膠體 金液中加入240111 0.2 111〇1/11(2〇)3調(diào)節(jié)?!1至8.5; 1.2.2) 在電磁攪拌器攪拌下，將抗體AbP30Line加入膠體金溶液中，至抗體終濃度為10 ug/ml，加入抗體時(shí)逐滴加入，加完后繼續(xù)攪拌45 min~60 min; 1.2.3) 反應(yīng)完成加入5%111八牛血清白蛋白85厶至終濃度為1%111八，攪拌15~30分鐘，41€ 保存?zhèn)溆茫? 1.2.4) 將標(biāo)記好的抗體AbP30Line取出后裝入50ml離心管，2500g，4°C離心5分鐘，得到 下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉(zhuǎn)移至另一只50ml離心管，12000g，4°C離心 30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用10 ml膠體金緩沖液重懸 沉淀，然后再12000g，4°C離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最后用 3ml膠體金緩沖液重懸，4 °C保存?zhèn)溆?，得到含有膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液； 所述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、l%m/vBSA、l% v/v Tween-20、5% 111八蔗糖以及3%。111八聚乙烯吡咯烷酮?￥?-10，所述膠體金緩沖液的?!1為10.5; 2) 制備結(jié)合墊 將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有膠體金標(biāo)記抗體AbP30Line的溶液中1 h，取 出，25°C干燥后裁成后規(guī)格為4cm X 0 · 6cm/條后，4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊； 3) 制備樣品墊 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少2 h，再置于生物安 全柜內(nèi)37 °C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cm X 1 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存； 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取〇.242g Tris、lg牛血清白蛋白BSA、1 ml吐溫- 20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10,溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH 調(diào)pH至11后用去離子水定容至100 ml; 4) 制備檢測(cè)層 4.1) 制備兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG; 4.2) 將硝酸纖維素膜剪成4cmX 2cm大小;將步驟4.1)制備得到的兔抗重組Pl-His融合 蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2.0 mg/mL及1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BI0D0T劃膜儀噴頭中，設(shè) 置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BI0D0T劃膜 儀噴頭中，設(shè)置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與檢測(cè)線間距為 0.5cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥18h，剪裁成4cmX2cm的規(guī)格，4°C密封干燥保存;至 此制得檢測(cè)層； 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是:稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉以及 0.2 g氯化鈉，溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至 100 ml； 5) 組裝檢測(cè)卡 5.1)將底板裁剪成4cm X 6cm大小，備用； 5.2 )將吸水濾紙裁剪成4cm X 2.5cm大小，作為吸水墊，備用； 5.3) 將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護(hù)膜揭掉，將步驟4)所述的檢測(cè)層即帶有 質(zhì)控線和檢測(cè)線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面； 5.4) 將步驟5.2)準(zhǔn)備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測(cè)層右末端有 0.2 cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對(duì)齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結(jié) 合墊按0 · 2cm重疊于檢測(cè)層的左邊緣處，0 · 4 cm粘于底板上； 5.5) 將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.2 cm重疊于結(jié)合墊的左邊緣處，另一邊與底板 的左邊緣對(duì)齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測(cè)板于切條機(jī)下裁成4.0 mm寬的檢測(cè)卡， 4 °C密封干燥避光保存。
【文檔編號(hào)】C07K16/12GK105859884SQ201610317213
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】胡征, 董俊, 楊波
【申請(qǐng)人】湖北工業(yè)大學(xué), 湖北華龍生物制藥有限公司