基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于疏水功能性小分子?親水聚氨基酸的生物可降解聚合物及其制備方法和應(yīng)用。首先制備疏水功能性引發(fā)劑，然后引發(fā)NCA單體開環(huán)聚合，得到基于功能性分子和聚多肽的兩親性表面活性劑，其可乳化聚（乳酸?羥基乙酸）（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚（ε?己內(nèi)酯）（PCL）材料，得到聚合物納米粒子，且乳化劑也作為成份構(gòu)建在納米粒子表面，其末端的活性氨基，可進一步與帶羧基的靶向分子通過化學(xué)鍵和，來進一步提高納米粒子的穩(wěn)定性，并引入靶向分子。得到的載藥靶向納米粒子具有很高的穩(wěn)定性，其可以很好地富集到腫瘤部位，并對包括人乳腺癌在內(nèi)的多種固體腫瘤具有很好地治療作用和低的毒副作用。
【專利說明】
基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物 及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種兩親性聚合物，具體涉及一種由疏水功能性小分子和親水聚氨基 酸構(gòu)建的兩親性生物可降解材料及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚(乳酸-羥基乙酸）(PLGA)是一種FDA批準(zhǔn)的生物可降解聚合物，被廣泛地應(yīng)用于 手術(shù)縫合線、組織工程支架、藥物控制釋放載體等生物醫(yī)用領(lǐng)域。基于PLGA的生物可降解納 米粒子和微米粒子已成為實現(xiàn)藥物靶向長效治療的最重要載體之一。例如，多種包載蛋白 藥物和多肽藥物的PLGA微球如Depot?，Decapeptyl?，Somatulline?，Nutropin?，Depot?，已 被臨床用于治療前列腺癌、肢端肥大癥、生長激素缺乏癥。PLGA納米粒子和微米粒子通常是 用乳化-溶劑揮發(fā)法或納米沉淀法制備，這通常要用表面活性劑來穩(wěn)定分散的小液滴，減小 表面張力和防止絮積。聚乙烯醇(PVA)、泊洛沙姆(poloxamer)和聚丙烯吡咯烷酮(PVP))等 表面活性劑因具有在水溶液中粘度高，能很好地吸附在分散小液滴的表面等優(yōu)點而成為制 備PLGA納米粒子和微米粒子最常用的表面活性劑。但這些表面活性劑存在不能生物降解、 體內(nèi)存在潛在的毒性、缺少功能基團等缺點。例如，PVA不僅可能致癌，而且動物實驗發(fā)現(xiàn)皮 下或靜脈注射PVA會導(dǎo)致高血壓、器官損傷、貧血、中樞神經(jīng)抑制等問題（J. Biomed. Mater. Res. Part A: 100A; 1998-2005, 2012)〇
[0003] 最近，聚乙二醇1000維生素 E琥珀酸酯（TPGS)作為一種生物相容性表面活性劑被 廣泛用于納米粒子制備(Biomaterials 33; 4889-4906，2012)。例如，用TPGS制備得到了 一系列包裹紫杉醇等藥物的PLGA、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒子;這 些納米粒子的粒徑可控制在200-800nm之間。與傳統(tǒng)PVA乳化劑相比，TPGS展現(xiàn)出了更好的 乳化效果和包載效率。研究還發(fā)現(xiàn)TPGS乳化劑能通過抑制腫瘤細(xì)胞表面P-糖蛋白功能來阻 止抗癌化療藥物被細(xì)胞栗出，從而大大增強抗癌藥物(阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇等)對耐 藥腫瘤細(xì)胞的毒性。而且，TPGS還被發(fā)現(xiàn)本身就有抗癌活性，能抑制移植在裸鼠身上的人肺 癌細(xì)胞的生長。但用TPGS乳化的PLGA等納米微球通常穩(wěn)定性較低，而且表面很難進行功能 化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物 及其制備方法。該聚合物可用來增溶憎水性藥物和用作功能化生物可降解表面活性劑來制 備多功能性納米藥物。
[0005] 為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種具有以下結(jié)構(gòu)式的基于疏水功 能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物：
[0006]本發(fā)明的聚合物包含疏水功能小分子心作為憎水的頭，水溶的聚（γ -寡聚乙二 醇-L-谷氨酸)和聚(β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸）的聚氨基酸鏈段作為親水的尾巴，其中X為 2~5，η為3~20，波浪線表示的鏈段來自于二胺化合物;R 1分子量大于240 Da，其結(jié)構(gòu)式如 下： 1)來自于疏水性胺基化合物的取代基Ri:

等。
[0007] 本發(fā)明還公開了上述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物 的制備方法，包括如下步驟：以疏水性胺基化合物作為引發(fā)劑，開環(huán)聚合氨基酸-N-羧基 內(nèi)酸酐化合物得到基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物;所述氨 基酸-羧基內(nèi)酸酐化合物為γ -寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EGx-Glu-NCA)或β-寡 聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EG x-ASp-NCA)。疏水性胺基化合物包括二硬脂酰基 磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｒ掖及?、十六烷基胺或者艾日布林等;或者疏水性胺基化合 物由疏水性羥基化合物制備得到;疏水性胺基化合物、羧基內(nèi)酸酐化合物的摩爾比為1: 3~ 25;疏水性胺基化合物的分子量大于240 Da。
[0008] 上述技術(shù)方案中，由疏水性羥基化合物制備疏水性胺基化合物(又稱為末端氨基 的疏水小分子)為以疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯為原料，在無水二氯甲烷和吡 啶中，反應(yīng)得到對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子;然后以對硝基苯基氯甲酸 酯活化的功能性疏水小分子和二胺為反應(yīng)物，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)制備疏水性 胺基化合物。疏水性羥基化合物包括維他命E、膽固醇、香豆素、膽酸、喜樹堿、伊立替康等。
[0009] 二胺化合物結(jié)構(gòu)為，選自以下化合物中的一種：乙二胺、丁二胺、辛 二胺、賴氨酸甲酯、賴氨酸乙酯、鳥氨酸甲酯、鳥氨酸乙酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺 等，其具體結(jié)構(gòu)如下： 其中y為2,4,8。
[0010] 上述技術(shù)方案中，疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯和吡啶的摩爾比為1:2 :5;對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子、二胺和吡啶的摩爾比為1:20:20;將R 1-4-NC滴加到過量的二胺中，確保R1I-NC只與二胺的單端氨基反應(yīng)。
[0011] 上述技術(shù)方案中，以疏水小分子、對硝基苯基氯甲酸酯(4-NC)為原料，在無水二氯 甲烷和吡啶中，反應(yīng)得到對硝基苯基氯甲酸酯活化的疏水小分子;再用上述制備的活化的 疏水小分子和二胺為反應(yīng)物，在無水二氯甲烷和吡啶中反應(yīng)，制備得到末端氨基的疏水小 分子(R 1-NH2);最后以上述制備的R1-NH2或本身含胺基的疏水功能小分子(R 1-NH2)為引發(fā) 劑，開環(huán)聚合γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EGx-Gl u-NCA)或β-寡聚乙二醇-L- 天冬氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EGx-Asp-NCA)制備得到基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的 生物可降解聚合物； 所述末端氨基的疏水小分子(Ri-NH2)的分子式如式111(本身含胺基的疏水功能小分 子)和IV(由疏水性羥基化合物制備疏水性胺基化合物)所示； 1'.卜議％:
式IVo
[0012]上述技術(shù)方案中，制備對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子時，在(TC度 條件下滴加對硝基苯基氯甲酸酯，再在30°C反應(yīng)24小時；制備疏水性胺基化合物時，反應(yīng)溫 度為室溫，時間為24小時；制備基于功能性疏水小分子-聚氨基酸的兩親性生物可降解聚合 物時，反應(yīng)溫度是25-50°C，反應(yīng)時間為12-72小時。
[0013] 上述制備過程可表示如下： (1) 中間體對硝基苯基氯甲酸酯活化的疏水小分子(Ri-4-NC)的制備:在(TC條件下，將 對硝基苯基氯甲酸酯的二氯甲烷溶液滴加到疏水性羥基化合物和吡啶的二氯甲烷溶液中。 滴加完畢后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到30°C油浴中反應(yīng)24小時后過濾將除去吡啶鹽，旋蒸除去二氯 甲烷得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品溶解在石油醚中，然后在_5°C度離心除去不溶物，再旋蒸除去溶 劑得到黃色油狀的中間體Ri-4-NC; (2) 末端氨基的疏水小分子(R1-NH2)的制備:將步驟(1)制備的對硝基苯基氯甲酸酯活 化的疏水小分子(R 1I-NC)溶解在無水二氯甲烷溶液中，用恒壓滴液漏斗10秒每滴滴加到 二胺和吡啶的溶液中，室溫反應(yīng)24小時后，用去離子水洗滌，有機相用無水硫酸鎂干燥過 夜，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，真空干燥24小時，得到產(chǎn)品。干燥后，抽濾除去硫酸鎂，收 集有機相濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，并真空干燥24小時，得到末端氨基的疏水小分子 (R1-NH2)； (3) 基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的制備:將步驟(2)制 備的末端氨基的疏水小分子(R1-NH 2)或本身含胺基的疏水功能小分子溶解在無水二氯甲烷 或二甲基甲酰胺中并置于密閉反應(yīng)器中，再將γ -寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐 (EGx-Glu-NCA)或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EG x-Asp-NCA)的二氯甲烷或二 甲基甲酰胺溶液在氮氣環(huán)境下快速加入到引發(fā)劑溶液中，然后在25~50°C反應(yīng)12~72小 時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液用冰乙醚沉淀，離心，真空干燥，得到基于疏水功能性小分子-親 水聚氨基酸的生物可降解聚合物。
[0014] 上述技術(shù)方案中，末端氨基的疏水小分子或本身含胺基的疏水功能小分子(Ri_ NH2)與γ -寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EGx-Glu-NCA)或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨 酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EG x-Asp-NCA)的摩爾比根據(jù)需要控制在1:3~25。所用有機溶劑可以是 二氯甲烷、三氯甲烷、Ν，Ν-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、N-甲基-2-吡咯烷酮，本發(fā)明優(yōu)選二 氯甲烷。
[0015] 本發(fā)明還公開了一種疏水性胺基化合物，由疏水性羥基化合物制備得到，具體為 以疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯為原料，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)得到對 硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子;然后以對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏 水小分子和二胺為反應(yīng)物，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)制備疏水性胺基化合物。疏水性 羥基化合物包括維他命E、膽固醇、香豆素、膽酸、喜樹堿、伊立替康等;二胺化合物選自以下 化合物中的一種：乙二胺、丁二胺、辛二胺、賴氨酸甲酯、賴氨酸乙酯、鳥氨酸甲酯、鳥氨酸乙 酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺等。
[0016]上述技術(shù)方案中，疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯和吡啶的摩爾比為1:2 :5 ;對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子、二胺化合物和吡啶的摩爾比為1: 20: 20;將心-4-從：滴加到過量的二胺中，確保fo-4-NC只與二胺的單端氨基反應(yīng)。
[0017]上述技術(shù)方案中，制備對硝基苯基氯甲酸酯活化的疏水功能性小分子時，在(TC度 條件下滴加對硝基苯基氯甲酸酯，再在30°C反應(yīng)24小時；制備疏水性胺基化合物時，反應(yīng)溫 度為室溫，時間為24小時。
[0018] 上述制備方法可表示如下：
本發(fā)明公開的由上述末端氨基的疏水小分子(R1-NH2)引發(fā)γ-寡聚乙二醇-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EG x-Glu-NCA)或β-寡聚乙二醇-L-天冬氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐(EGx-Asp-NCA)聚 合制備的基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物，其分子量為0.5~ 6.5 kDa，其中聚氨基酸的重量百分?jǐn)?shù)為20~95%。其末端胺基可用來連接生物活性分子，這 些生物活性分子包括但不僅限于靶向分子:成60、11?0^?、奧曲肽^^?4等短肽分子，抗體 及其片段、鐵轉(zhuǎn)移蛋白等蛋白分子，半乳糖(Gal)和透明質(zhì)酸等單糖或多糖分子，葉酸，生物 素等；和穿膜分子:TAT、Angiopep_2、iRGD、T7、Ci lengi tide 等。
[0019] 本發(fā)明進一步公開了上述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚 合物用作高分子表面活性劑在制備多功能性納米藥物載體中的應(yīng)用。
[0020] 由于上述聚合物由功能性疏水小分子和親水聚氨基酸組成，因此具有良好的生物 相容性和生物降解性。同時憎水功能性疏水小分子頭和親水聚氨基酸尾巴都有大分子結(jié)構(gòu) 和大表面積，具備成為優(yōu)良表面活性劑的基本特征。而且，聚合物親水鏈段長度能通過調(diào)節(jié) 聚氨基酸的聚合度來控制，從而得到不同親疏水比例的聚合物，可方便制備具有不同乳化 性能的聚合物。另外，聚氨基酸親水鏈段的末端含有胺基，可用來引入靶向分子等生物活性 分子，從而制得多功能的納米藥物載體，負(fù)載藥物用于腫瘤的安全高效治療。
[0021] 具體制備方法為： 先在疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的末端胺基連接上靶向分子如短肽、單糖、葉 酸、生物素、抗體等，然后再用含靶向分子的聚合物作為乳化劑，通過乳化-溶劑揮發(fā)法或沉 淀法制備表面含有靶向分子的納米藥物載體;或者先用疏水功能性小分子-親水聚氨基酸 為乳化劑制得表面含有胺基的納米藥物載體，然后再與含多官能基團的生物活性分子如透 明質(zhì)酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白等反應(yīng)，制備得到表面交聯(lián)且含有靶向分子的納米藥物載體。
[0022] 第一種策略是先將基于功能性疏水小分子-聚氨基酸的兩親性生物可降解聚合物 溶解在水等溶劑中，然后在HXVNHS催化條件下，與短肽、單糖、葉酸、生物素、抗體等生物活 性分子反應(yīng)，制得含靶向分子等生物活性分子的表面活性劑;然后向該表面活性劑的水溶 液中逐滴加入PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等生物可降解聚合物的丙酮溶液，再在室溫下攪拌 揮發(fā)除去有機溶劑，離心收集到表面含有靶向分子等生物活性分子的多功能性納米粒子載 體。
[0023] 第二種策略是先將PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等生物可降解聚合物溶于丙酮等有機 溶劑中，然后逐滴滴加到溶解有疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的 水溶液中，再在室溫下攪拌6 h揮發(fā)除去丙酮;離心收集到表面含有胺基的納米粒子。然后， 將用EDC/NHS活化后的含多個羧基的生物活性分子如透明質(zhì)酸(HA)或轉(zhuǎn)鐵蛋白等加入到表 面含有胺基的納米粒子的懸浮溶液中，在PH 8-9條件下反應(yīng)過夜，制備得到表面交聯(lián)且含 革巴向分子的多功能性納米粒子載體。
[0024]上述多功能性納米粒子載體可以負(fù)載多種藥物，用于多種疾病的體內(nèi)治療。
[0025] 本發(fā)明進一步公開了上述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚 合物在憎水藥物的增溶方面的應(yīng)用。上述聚合物具有良好生物相容性、生物降解性和易功 能性等優(yōu)點。同時憎水功能性小分子頭和親水聚氨基酸尾巴都有大分子結(jié)構(gòu)和大表面積， 具備優(yōu)良的乳化性能，在增溶憎水性藥物方面具有較好的應(yīng)用前景。另外，聚合物親水聚氨 基酸鏈段的末端含有胺基，可用于引入靶向分子和穿膜肽等生物活性分子，有利于提高藥 物的生物利用度和在病灶處的富集，從而極大提高藥物的治療效果。具體制備方法： 先配置一系列不同濃度(〇. 5-20 mg/mL)的基于功能性疏水小分子-聚氨基酸的兩親性 生物可降解聚合物的水溶液，然后再將過量的憎水性藥物(紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿、伊 立替康、長春新堿、拓?fù)涮婵?、貝洛替康、長春瑞濱等)加入上述聚合物溶液，接著放置到37 °(：搖床上。48 h后，再離心沉淀除去未溶解的藥物，得到用聚合物增溶后的憎水性藥物溶 液。
[0026] 由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點： 1.本發(fā)明公開的基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物中，功能 性疏水小分子和聚氨基酸都具有很好的生物相容性;聚氨基酸材料具有良好的生物可降解 性，而且其降解產(chǎn)物為無毒副作用的天然氨基酸;本發(fā)明聚合物的親水鏈末端含有胺基官 能基團，能很容易通過偶聯(lián)反應(yīng)引入靶向分子和穿膜肽等生物活性分子，從而制備得到表 面含有靶向分子或表面交聯(lián)且含有靶向分子的多功能納米藥物載體;另外，在制備該聚合 物時，可方便引入含縮酮的二胺、胱氨酸酯或胱胺等二胺小分子，從而制得PH或還原敏感型 納米載體，實現(xiàn)納米粒子在細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)釋放藥物。
[0027] 2.本發(fā)明用疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物作為高分子 表面活性劑制備的多功能納米藥物載體的表面由聚氨基酸鏈段構(gòu)成，很好克服了現(xiàn)有大多 納米粒子表面由聚乙二醇構(gòu)成所帶來的不能生物降解、容易引發(fā)過敏反應(yīng)和很難進行納米 粒子表面修飾等問題;親水聚氨基酸鏈不僅具有很好的生物降解性，而且其末端的胺基能 方便在納米粒子表面引入靶向分子和穿模肽等生物活性分子，從而增強納米藥物在病灶處 的富集量。
[0028] 3.本發(fā)明公開的基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物作為 高分子增溶劑能克服現(xiàn)有大多增溶劑(poloxamer，吐溫80,蓖麻油等）不具有生物可降解 性、生物相容性不好、很難進行官能化修飾等缺點；構(gòu)建本發(fā)明聚合物的功能性疏水小分子 和聚氨基酸都具有很好的生物相容性;聚氨基酸材料具有良好的生物可降解性，而且其降 解產(chǎn)物為無毒副作用的天然氨基酸;該聚合物的親水鏈末端含有胺基官能基團，能很容易 通過偶聯(lián)反應(yīng)引入靶向分子和穿模分子等生物活性分子，能較好地提高藥物生物利用度以 及靶向富集到病灶處，提高藥物的治療效果。
[0029] 4.本發(fā)明公開的基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物作 為高分子表面活性劑能很好克服現(xiàn)有高分子表面活性劑(PVA，p 〇l〇xamer，PVP等)不具有生 物可降解性、生物相容性不好、很難進行官能化修飾等缺點；以其作為表面活性劑制備 PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等生物可降解聚合物納米藥物載體，成功解決了現(xiàn)有載體存在的 表面活性劑不能生物降解、體內(nèi)存在潛在的毒性、缺少功能基團等缺點，取得了意想不到的 技術(shù)效果。
[0030] 因此，本發(fā)明制備的疏水功能性小分子-親水聚氨基酸聚合物具有很好的生物相 容性、生物降解性和含有官能基團，在憎水藥物的增溶和功能性納米藥物的制備方面具有 巨大的應(yīng)用潛力。
【附圖說明】
[0031] 圖1是實施例一中引發(fā)劑維他命E氨基的氫核磁譜圖； 圖2是實施例二中引發(fā)劑膽固醇氨基氫核磁譜圖； 圖3是實施例三中聚合物維他命E-聚（γ -二乙二醇單甲醚-L-谷氨酸酯）的氫核磁譜 圖； 圖4是實施例三中聚合物維他命E-聚（γ -二乙二醇單甲醚-L-谷氨酸酯）的MALDI-T0F 表征圖； 圖5是實施例四中聚合物膽固醇-聚（γ-二乙二醇單甲醚-L-天冬氨酸酯）的氫核磁譜 圖； 圖6是實施例五中維他命E-聚（γ -二乙二醇單甲醚-L-谷氨酸酯)對疏水藥物紫杉醇的 增溶圖； 圖7是實施例七中PLGA，VE-poly(EG2-Glu、納米粒子PLGA NPs及表面鍵和透明質(zhì)酸的 納米粒子HA-PLGA NPs的表面成份分析的X射線光電子能譜圖； 圖8是實施例七中納米粒子(PLGA NPs)表面活性劑含量的氫核磁譜圖； 圖9是實施例十一中納米粒子對疏水藥物紫杉醇(PTX)體外累積釋放量與時間的關(guān)系 圖； 圖10是實施例十二中納米粒子(HA-PLGA NPs)對正常細(xì)胞(L929)和腫瘤細(xì)胞(MCF-7， MG U87)的毒性結(jié)果圖； 圖11是實施例十三中載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)對人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的毒 性結(jié)果圖； 圖12是實施例十四中載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)在荷MCF-7人乳腺癌小鼠中的 抑瘤效果、腫瘤治療圖片、體重變化和存活率圖； 圖13是實施例十四中載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)在荷MCF-7人乳腺癌小鼠治療 結(jié)束21天時的組織形態(tài)學(xué)分析圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖以及實施例對本發(fā)明作進一步描述： 實施例一引發(fā)劑維他命E氨基(VE-NH2)的合成 (1) 中間體VE-4-NC的制備:氮氣環(huán)境下，將對硝基苯基氯甲酸酯(4-NC，1.98 g，9.8 mmo I)的二氯甲烷(30 mL)溶液在0 °C條件下以5秒一滴的速度滴加到維他命E(VE，2.12 g， 4.9 mmol)和吡啶（1.98 mL，24.5 mmol)的二氯甲烷（10 mL)溶液中。滴加完畢后，轉(zhuǎn)移到 30°C油浴中反應(yīng)24小時。反應(yīng)后，過濾除去副產(chǎn)物吡啶鹽，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干濾液，得到 淡黃色粘稠的VE-4-NC粗產(chǎn)品。然后用石油醚(b. p: 60-90 °C )溶解粗產(chǎn)品，離心除去雜質(zhì)， 旋蒸、最后真空干燥得到黃色粘稠油狀產(chǎn)品VE-4-NC，產(chǎn)率93.4%; (2) 引發(fā)劑維他命E氨基(VE-NH2)的制備:氮氣環(huán)境下，將步驟(1)制備的對硝基苯基氯 甲酸酯活化的VE-4-NC(0.6 g，1.0 mmol)的二氯甲烷(14 mL)溶液用恒壓滴液漏斗10秒每 滴滴加到乙二胺（1.35 mL，20.0謹(jǐn)〇1)和吡啶（1.6 mL，20謹(jǐn)〇1)混合的二氯甲烷(4 mL) 溶液中，室溫磁力攪拌反應(yīng)24小時。然后加入一定體積的二氯甲烷，并用去離子水萃取，直 到水相變得沒有顏色。將收集到的二氯甲烷相用無水硫酸鎂在_24°C條件下干燥24小時，抽 濾除去硫酸鎂，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，最后真空干燥24小時，得到黃色粘稠油狀產(chǎn)品VE-NH 2，產(chǎn)率 78.1%。
[0033] VE-NH2核磁表征見附圖U1HNMR (400MHz, CDCl3): δ 3.33 (t, -NHCH2CH2NH2); 2.90 (t, -NHCH2CH2NH2); 2.58 (t, -Ph(CH3)3CH2CH2-); 2.08, 2.02 (s, -Ph(CH3)3-); 1.77 (t, -Ph(CH3)3CH2CH2-); 1.52 (m, CH3(CH(CH3)CH2CH2Ch 2)3-); 1.37-1.07 (m, CH3 (CH(CH3)CH2CH2CH2)3-; s, -C(CH3)O-); 0.87-0.83 (d, CH3(CH(CH3)CH2CH2CH2)3-)。
[0034] 實施例二引發(fā)劑膽固醇氨基(Chol-NH2)的合成 (1)中間體Chol-4-NC的制備:氮氣保護下，將對硝基苯基氯甲酸酯(4-NC，1.61 g，8.0 mmo 1)的二氯甲烷（約30 mL)溶液在冰浴條件下緩慢滴加（約5秒一滴）到膽固醇（Cho 1， 1.55 g，4.0 mmol)和吡啶（1.56 mL，20.0 mmol)的二氯甲烷（10 mL)中。然后，在30°C油浴 中反應(yīng)一天，過濾除去吡啶鹽，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得白色固體粗產(chǎn)品。最后將粗產(chǎn)品用冰丙酮洗滌 純化，得到Chol-4-NC產(chǎn)物。產(chǎn)率為:50.4%; (2)引發(fā)劑膽固醇氨基(Chol-NH2)的制備:將Chol-4-NC(l.05 g，1.9 mmol)溶于二 氯甲烷(30 mL)中，然后在30 °C油浴的條件下緩慢滴加到二十倍過量的乙二胺(2.57 mL， 38.0 mmol)的二氯甲烷(7 mL)溶液中，滴加完后反應(yīng)一天。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用砂芯漏斗 抽濾，然后將清液旋干，加無水乙醚溶解得黃色溶液。黃色溶液用堿水(pH=12)洗滌二次至 無色以除去殘余吡啶和乙二胺，再用二次水洗滌三次，最后用無水硫酸鎂干燥。然后用砂芯 漏斗過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再真空干燥24小時，即得白色產(chǎn)物。產(chǎn)率約為:67.7%。
[0035] Chol-NH2核磁表征見附圖2,1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.37 (t, -CH=C-); 4.49 (m，-(-CH2)2CH0C0NH-); 3.21 (t，-NHCH2CH2NH2); 2.81(t，-NHCH2CH2NH2); 2.34， 2.27(d，-CH=CCH2OK-CH2) 0_)〇
[0036] 實施例三維他命E-聚（γ-二乙二醇單甲醚-L-谷氨酸）（VE-poly(EG2-Glu))的合 成 以η為5為例:將引發(fā)劑維他命E氨基VE-NH2(1.16 g，2.25 mmol)溶于37 mL二氯甲烷 溶劑中并置于密閉反應(yīng)器中。氮氣環(huán)境下，將γ-二乙二醇單甲醚-L-谷氨酸-N-羧基內(nèi)酸酐 (EG2-Glu-NCA)(3.71 g，13.50 mmol)單體的二氯甲烷溶液(37 mL)快速加到引發(fā)劑中，25 °C反應(yīng)12小時。反應(yīng)過程用傅里葉紅外光譜儀監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至 約18毫升，用冰乙醚沉淀，低溫離心（_5°C，5000 rpm)收集沉淀。最后用冰乙醚洗滌三次， 真空干燥48小時，得到淡黃色產(chǎn)品，產(chǎn)率55.8%。
[0037] VE-Poly(EG2-Glu)核磁表征見附圖3，iH NMR (600 MHz, CDCl3): δ 4.24 (m,-NH⑶CH-; t，CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.68-3.54 (m，CH3OCH2CH2OCH2CH2-); 3.40-3.36 (t, -NHCH2CH2NH-; s, CH3OCH2CH2 OCH2CH2-); 2.66-2.34 (t, -Ph(CH3)3CH2CH2-, t,-COCH(NH)CH2Ch2-); 2.07，2.03 (s，-Ph(CH3)3-); 1.99-1.88 (m，-COCH(NH)CH2Ch2-); 1.78 (t, -Ph(CH3)3CH2CH2-); 1.53 (m, CH3(CH(CH3)CH2CH2Ch 2)3-); 1.37-1.07 (m, CH3 (CH(CH3)CH2CH2CH2)3-; s，-C(CH3)(CH2)-); 0.87-0.83 (d，CH3(CH(CH3)CH2CH2CH2)3-)。 VE-poIy (EG2-Glu)的MALDI-TOF表征見附圖4，分子量1695.1，單元數(shù)是5。
[0038] 用相似的方法，通過選用不同單體(EGx-Glu-NCA或EGx-Asp-NCA)和控制單體/引發(fā) 劑的投料比，可以制備得到一系列聚合度不同的VE-po I y (EGx-GIu) !!和VE-po I y (EGx-Asp) n 兩親性聚合物，其表征見表1。
[0039]表 1 聚合物 VE-Poly(EGx-Glu)n 和 VE-Poly(EGx-Asp)n 的制備和表征。
[0040] 實施例四膽固醇-聚（γ_寡聚乙二醇-L-天冬氨酸）（Ch〇l-p〇ly(EGx-Asp))的合 成 以合成Chol-poly(EG2_Asp)19(x=2, n=19)為例:將引發(fā)劑膽固醇氨基Chol-NH2 (0.18 g，0.38 mmol)溶于19.8 mL DMF溶液中并置于密閉反應(yīng)器中。氮氣環(huán)境下，將EG2-Asp-NCA單體（1.98 g，7.6 mmol)的DMF溶液（19.8 ml)快速加到引發(fā)劑中，40 °C反應(yīng)48小時。 反應(yīng)過程用傅里葉紅外光譜儀監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，濃縮溶劑至剩余約4 mL，用冰乙醚沉淀， 低溫離心(_5°C，5000 rpm)收集沉淀。最后用冰乙醚洗滌三次，真空干燥48小時，得到淡黃 色固體，產(chǎn)率62.1%。其表征見表2。
[0041 ] Chol-poly(EG2_Asp)i9 核磁表征見附圖5, 1H (400 MHz, CDCl3): δ 5.35 (t, -CH = C-) ; 4.46 (m , - (-CH2)2CH0C0NH-); 4.24 (m, -NHCOCH-; t , CH3OCH2CH2OCH2CH2-) 3.65-3.54 (m, CH3OCH2CH2OCH2CH2-) ; 3.42-3.34 (t,-NHCH2CH2NH-; s, CH3OCH2CH2〇CH2CH2-)〇
[0042]用相似的方法，選用不同的引發(fā)劑如香豆素胺基化合物(Cou-NH2)、膽酸胺基化合 物(CA-NH2 )、喜樹堿胺基化合物(CPT-NH2 )、伊立替康胺基化合物（INT-NH2 )、含雙硫的膽固 醇胺基化合物（Chol-SS-NH2)、二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)、二油?；字Ｒ掖及?(DOPE)、艾日布林(Eri )和十六烷基胺(THDA)，開環(huán)聚合NCA單體可制得一系列疏水功能性 小分子-親水聚氨基酸聚合物，其表征見表2。
[0043]表2疏水功能性小分子-親水聚氨基酸聚合物的制備和表征。
[0044] 實施例五用VE-Poly(EGx-Glu)n聚合物增溶疏水藥物紫杉醇(PTX) 以用VE-poly (EG2-Glu)5增溶疏水抗癌藥物紫杉醇(PTX)為例，將過量的PTX加入到不 同濃度(0.5、1·0、2·5、5·0、10.0、15·0、20·0 mg/mL)的VE-Poly(EG2-Glu)5水溶液中（2 mL)， 然后密封，放置在37°C的搖床(200 rpm)中。兩天后，離心沉淀除去未溶解的藥物，得到用聚 合物增溶后的PTX溶液。增溶的PTX量可以用HPLC來測量。結(jié)果顯示PTX增溶的量隨著VE-?〇1 7^62-6111)5聚合物濃度的增加而顯著增加，當(dāng)VE-poly(EG 2-Glu)5濃度為20 mg/mL時， PTX的溶解度可高達381.9 yg/mL，其他濃度的增溶效果，詳見附圖6。其增溶效果好于現(xiàn)在 廣泛使用的TPGS對PTX的增溶效果(Eur. J. Pharm. Sci. 25; 445-453，2005)。更重要的 是，增溶后的粒子表面含有氨基官能基團，能用于引入靶向分子和穿模分子等生物活性分 子，提高藥物生物利用度和靶向富集到病灶處。
[0045] 實施例六用含雙硫的Ch〇l-SS-p〇ly(EGx-Asp) n聚合物增溶疏水藥物多西紫杉醇 (DTX) 以用Ch0I-SS-P0Iy(EG3-Asp)6增溶疏水抗癌藥物DTX為例，將過量的DTX加入到不同濃 度（1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 11^/1111〇的〇1〇1-551〇17化63-厶8口）6水溶液中（2 1111〇，然 后密封，放置在37攝氏度的搖床(200 rpm)中。兩天后，離心沉淀除去未溶解的藥物，得到用 聚合物增溶后的DTX溶液。增溶的DTX量可以用HPLC來測量。結(jié)果顯示DTX增溶的量隨著 Chol-SS-poly(EG3~Asp)6聚合物濃度的增加而顯著增加。例如，當(dāng)Chol-SS-poly(EG3~Asp)6 濃度分別為I mg/mL和2 mg/mL時，DTX的溶解度可高達28.0 ug/mL和57.5 ug/mL。而且，聚 合物增溶DTX后自組裝形成了納米粒子，其粒徑約為60 nm，粒徑分布約為0.25。
[0046] 實施例七用VE-Poly(EGx-Glu)n為高分子表面活性劑制備PLGA納米粒子 PLGA納米粒子(PLGA NPs)的制備：以VE-Poly(EG2-Glu)5為高分子表面活性劑為例，將 0.9 mL PLGA的丙酮溶液（10 mg/mL)逐滴滴加到9 mL VE-Poly(EG2-Glu)5水溶液(0.45 mg/ mL)中，室溫攪拌6 h，使丙酮揮發(fā)，然后離心（12000 rpm, 10 min, 4 °C; Sorvall Biofuge Stratos，Thermo Scientific)收集納米粒子，并用二次水洗一次，除去自由的乳 化劑，制備得到表面含VE_poly(EG2_Glu)5的PLGA納米粒子。納米粒子的粒徑和粒徑分布可 用動態(tài)光散射測量分別為135 nm和0.06。納米粒子表面含有VE-Poly(EG2-Glu)5聚氨基酸鏈 段可通過X射線光電子能譜觀察到N峰的出現(xiàn)得到證實（圖7)。而且，納米粒子表面含有表面 活性劑的量可用氫譜核磁具體測得，通過比較表面活性劑上EG 2在d 3.54-3.68(圖8B * 處）的亞甲基和PLGA在d 5.21 (圖8A)處的次甲基的峰面積，可計算出PLGA表面含有7.3 wt. %的VE-poly (EG2-Glu)5t3通過調(diào)節(jié)VE-poly (EG2-Glu)A高分子表面活性劑的濃度為 0.15,030 mg/mL，可以制備得到粒徑在150 nm的納米粒子(表征結(jié)果見表3)。
[0047]實施例八表面含有靶向分子的PLA納米粒子的制備 先將靶向分子連接到高分子表面活性劑的親水聚氨基酸鏈段的末端。以連接ACUPA短 肽靶向分子到VE-poly (EG3-Glu)K4聚合物為例，首先將聚合物末端胺基轉(zhuǎn)化為羧基，具體 方法如下：將VE-Poly(EG 3-Glu)M.4(900 mg，0.20 mmol)，丁二酸酐（24.0 mg，0.24 mmol)，DMAP(24.4 mg, 0.20 mmol)和三乙胺（20.4 mg，0.20 mmol)溶解在9毫升的無水 1， 4-二氧六環(huán)中，室溫攪拌24小時;反應(yīng)結(jié)束，旋蒸除去溶劑，再用少量二氯甲烷溶解，然后過 濾收集濾液，用無水乙醚沉淀，離心，最后真空干燥，得到VE-P 0Iy(EG3-Glu)K4-COOH,產(chǎn)率 78·l%。接著，用EDC/NHS活化VE-poly(EG3-Glu)l4.4-⑶0H末端羧基，將VE-poly(EG3-Glu )i4.4_C00H(680mg，0.15 mmol)，NHS(51.8 mg，0.45 mmol)和EDC(57.5 mg，0.30 mmol)溶解 在二氯甲烷（6.8 mL)中，室溫反應(yīng)24小時后，用無水乙醚沉淀，離心，真空干燥，得到VE-Poly(EG3-Glu)1I 4-NHS,產(chǎn)率 87.1%。最后，將制得的 VE-Poly(EG3-Glu)1I4-NHS 與含氨基的 ACUPA靶向分子反應(yīng)，具體的，先將ACUPA(44 · 7 mg，0 · 14 mmo 1)和VE-po Iy (EG3-GIu) 14.4-NHS (585mg，0.13 mmol)溶解在DMF(6 mL)中，再在30°C反應(yīng)2天。反應(yīng)后，用無水乙醚沉淀，離 心，真空干燥，得到帶靶向分子的VE-P0Iy(EG 3-Glu)H4-ACUPA聚合物，產(chǎn)率77.9%。然后，按 照實施例七類似的方法用VE-P 0Iy(EG3-Glu)1I4-ACUPA為高分子表面活性劑制備得到表面 含有ACUPA靶向分子的PLA納米粒子，該納米粒子表面含有的靶向分子密度可以通過調(diào)節(jié)高 分子表面活性劑的濃度來控制。
[0048] 用相似方法可以將其它靶向分子如cRGD、iRGD、AP、奧曲肽、TAT、Angiopep-2、 iRGD、T7、Ci Iengitide、抗體及其片段、半乳糖(Gal)、葉酸、生物素等連接到納米粒子表面， 從而實現(xiàn)納米粒子的表面功能化和作為藥物載體包載藥物后納米藥物的祀向輸送。
[0049]實施例九表面交聯(lián)且含有透明質(zhì)酸靶向分子的PLGA納米粒子的制備 用實施例七制備的PLGA納米粒子來制備表面交聯(lián)且含有透明質(zhì)酸靶向分子的PLGA納 米粒子。先將透明質(zhì)酸(HA，45.5 mg，1.3 μηιο1，120·0 μπιο?羧基)溶解在4.0 mL醋酸-醋 酸鈉緩沖溶液(0.1 M，pH 5.0)中，再在室溫下加入EDC(6.9 mg，36.0 _〇1)和NHS(2.1 mg，18.0 μπιο?)活化0.5 h。然后，將羧基活化的HA加到實施例七制備的PLGA納米粒子的懸 浮溶液(NaC03/NaHC0 3緩沖介質(zhì)，pH 9.0)中，37 °C反應(yīng)過夜。反應(yīng)后，用截留分子量(MWCO) 為350000 Da透析袋透析除去未反應(yīng)的HA和其他小分子副產(chǎn)物，冷凍干燥得到表面交聯(lián)且 含有透明質(zhì)酸靶向分子的PLGA納米粒子。納米粒子表面含有HA分子的量是通過先將HA用近 紅外染料Cy5標(biāo)記，然后用上述相同方法將Cy5標(biāo)記的HA連接到納米粒子表面，然后再用熒 光光度計測量納米粒子的熒光強度，從而可計算出納米粒子表面含有的HA為5.15 wt. %(表 征結(jié)果見表3)。
[0050] 表3用VE-poly(EG2-Glu)5表面活性劑制備PLGA納米粒子(PLGA NPs)及在其表面 弓丨入透明質(zhì)酸(HA)，制得表面交聯(lián)且含靶向分子的納米粒子(HA-PLGA NPs)表征
實施例十表面可逆交聯(lián)且含有轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf)靶向分子的PCL納米粒子的制備 首先將轉(zhuǎn)鐵蛋白的N-糖苷鏈氧化制備醛基官能化的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf-CHO)，將轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Tf，25 mg)溶解在900 uL的醋酸鈉(0.1 M，pH 5.5)溶液中，再向其加入225 uL高碘酸鈉溶 液(50 mM)，在室溫下反應(yīng)I h后。反應(yīng)后，在4°C條件下用S印hadex G-25色譜柱（1.8 X 25 cm)提純(流動相為醋酸鈉(0.1 M，pH 5.5)溶液），制備得到Tf-CHO。然后，用含雙硫鍵的VE-SS-P0Iy(EG2-Glu) 6聚合物為高分子表面活性劑制備PCL納米粒子，將0.9 mL PCL的丙酮和 四氫咲喃溶液（10 mg/mL)逐滴滴加到9 mL VE-SS_poly(EG2-Glu)6水溶液(0.45 mg/mL)中， 室溫攪拌6 h，使丙酮和四氫呋喃揮發(fā)，然后離心收集納米粒子，并用二次水洗一次，除去自 由的乳化劑，制備得到表面含VE-SS-P0Iy(EG 2-Glu)6的PCL納米粒子。最后，將Tf-CHO加到 PCL納米粒子的懸浮溶液(Na⑶3/NaHC03緩沖介質(zhì)，pH 9.0)中，室溫條件下反應(yīng)過夜。反應(yīng) 后，用截留分子量(MWCO)為350000 Da透析袋透析除去未反應(yīng)的Tf和其他小分子副產(chǎn)物， 冷凍干燥得到表面可逆交聯(lián)且含有Tf靶向分子的PCL納米粒子。由于在高分子表面活性劑 中引入了雙硫鍵，該納米粒子具有還原敏感性。動態(tài)光散色結(jié)果顯示該納米粒子的平均直 徑約為150 nm。
[0051 ]實施例^ 納米粒子對疏水藥物的裝載及體外釋放 用納米粒子包載疏水藥物紫杉醇(PTX)為例，先將PTX和PLGA(理論載藥量8 wt.%)溶 解到丙酮溶液中，再逐滴滴加該溶液到VE-poly (EG2-Glu)5高分子表面活性劑的水溶液 (0.45 mg/mL)中，室溫攪拌6 h，使丙酮揮發(fā)，然后離心收集納米粒子，并用二次水洗滌除去 自由的乳化劑，制備得到包載有PTX的PLGA納米粒子(PTX-PLGA NPs)。然后將靶向分子(如 HA)鍵合在表面，得到靶向納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs )，參考實施例九的方法。
[0052] 納米粒子的粒徑和粒徑分布可用動態(tài)光散射測量分別為164 nm和0.16。納米粒子 的載藥量可用高效液相色譜(HPLC)測定。先取0.2 mL PTX-PLGA NPs的溶液，凍干稱重。再 用水和乙腈(50:50，v/v)重新溶解，經(jīng)0.45 μπι濾膜過濾后，用HPLC測定載藥量(DLC)和載 藥效率(DLE)分別為6.4 wt.%和80.1%。用相似的方法可用VE-poly(EG2-Glu)5高分子表面活 性劑制備納米粒子實現(xiàn)對其它憎水性藥物如多西紫杉醇（DTX)、喜樹堿(CPT)、伊立替康 (INT)、長春新堿(VCR)、拓?fù)涮婵?TPT)、貝洛替康(BLT)、長春瑞濱(NVB)、阿霉素(DOX)等的 包載，其結(jié)果見表4。
[0053] 表4用VE-p0ly(EG2-Glu)5高分子表面活性劑制備的包載疏水藥物的納米粒子
PTX的體外釋放實驗是在37 °C恒溫?fù)u床中震蕩（200 rpm)進行，有三個平行樣。將0.5 mL的PTX-HA-PLGA NPs載藥納米粒子溶液置于透析袋(MW⑶12000-14000 Da, Spectrum Laboratories, USA)中，然后將該透析袋放到含有吐溫80(0.1%, v/v)的PB(10 mM, pH 7.4)緩沖溶液(25 mL)中進行體外釋放實驗。每間隔一定時間，從釋放介質(zhì)中取出5.0 mL溶 液用作測試，同時向試管中補加5.0 mL相應(yīng)介質(zhì)。將取出的釋放介質(zhì)溶液凍干，再加入0.5 mL乙腈/水（1:4，v/v)溶解，然后用HPLC測定溶液中藥物濃度，最終觀察到PTX從PTX-HA-PLGA NPs累計釋放量隨時間變化的行為（附圖9)。結(jié)果表明在ro(10 mM，pH 7.4)介質(zhì)中， 大約有54.0%的PTX在7天后從HA-PLGA NPs中釋放出來。更重要的是，該納米粒子大大減少 了藥物在最初兩天的突釋，實現(xiàn)了藥物從PLGA納米粒子的長效釋放。
[0054] 實施例十二MTT法分析空納米粒子(HA-PLGA NPs)的細(xì)胞毒性 選用正常細(xì)胞（小鼠成纖維L929細(xì)胞）和腫瘤細(xì)胞（人乳腺癌MCF-7，人腦膠質(zhì)瘤MG U87)用MTT法測試HA-PLGA NPs的細(xì)胞毒性。首先將細(xì)胞種在96孔板上（I X IO4個細(xì)胞/孔）， 經(jīng)24小時培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁約70%。然后，加入不同濃度（10-350 yg/mL)的HA-PLGA空納米粒 子樣品。培養(yǎng)48小時后，向每孔加入10 yL的MTT(5.0 mg/mL)溶液，再接著培養(yǎng)4小時。隨 后，向每孔加入150 yL DMSO溶解生成的結(jié)晶子，并用酶標(biāo)儀于492 nm處測吸光度值(A)，計 算細(xì)胞存活率。用細(xì)胞空白對照孔和培養(yǎng)基空白孔為參照。測試結(jié)果表明空納米粒子導(dǎo)致 腫瘤細(xì)胞的存活率明顯降低。例如MCF-7腫瘤細(xì)胞與350 yg/rnL的空納米粒子作用后，其存 活率下降到約60%(圖10)。這說明本發(fā)明的聚合物作為高分子表面活性劑制得的PLGA NPs 對腫瘤細(xì)胞具有一定的殺傷力。相反，L929正常細(xì)胞即使與濃度高達350 yg/rnL的空納米粒 子作用，其存活率仍然大于90%(圖10)。這說明本發(fā)明的聚合物作為高分子表面活性劑制得 的PLGA NPs具有良好的生物相容性，克服了現(xiàn)有乳化劑有毒、生物相容性差的缺陷。
[0055] 實施例十三載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)體外細(xì)胞毒性 用MTT法分析PTX-HA-PLGA NPs對MCF-7 (表面過度表達CD44受體)腫瘤細(xì)胞的毒性。首 先將細(xì)胞種在96孔板上（IX IO4個細(xì)胞/孔），經(jīng)24小時培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁約70%。然后，加入 PTX-HA-PLGA NPs，PTX濃度范圍選定為0·0005、0·005、0.01、0·05、0·1、0·25、0·5、1、2.5、5 和10 yg/mL。培養(yǎng)4小時后，吸出含載藥納米粒子的培養(yǎng)液，然后添加新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育 44 h。再向每孔加入10 yL的MTT(5.0 mg/mL)溶液，接著培養(yǎng)4小時。隨后，向每孔加入150 yL DMSO溶解生成的結(jié)晶子，并用酶標(biāo)儀于492 nm處測吸光度值(A)，計算細(xì)胞存活率。實驗 用PTX臨床制劑Taxol作對照。另外為證實表面含HA的納米粒子具有靶向性，我們添加了一 組細(xì)胞表面受體封閉實驗，具體方法是：首先將MCF-7細(xì)胞與過量的HA大分子(5 mg/mL)孵 育4 h，使HA大分子結(jié)合并占據(jù)了細(xì)胞表面的⑶44受體，然后再加入PTX-HA-PLGA NPs，分析 其細(xì)胞毒性。實驗結(jié)果顯示PTX-HA-PLGA NPs對過量表達⑶44受體的MCF-7腫瘤細(xì)胞有較高 毒性，其半致死濃度（IC50 = 0.37 yg/mL)低于TaxoiaC50 = 0.82 yg/mL)(圖11)，這說明載 藥納米粒子在體外有較高的抗腫瘤活性。另外，載藥納米粒子對表面受體封閉后的MCF-7細(xì) 胞的毒性大大降低，其IC 5q為2.16 yg/mL，這說明PTX-HA-PLGA NPs主要是通過受體介導(dǎo)方 式進入腫瘤細(xì)胞，具有很好的腫瘤靶向性。
[0056] 實施例十四載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)的體內(nèi)抗腫瘤活性 體內(nèi)抗腫瘤活性實驗是用荷MCF-7人乳腺癌Balb/c裸鼠（18~20克，4~6周齡)進行。首 先通過在裸鼠皮下注射MCF-7人乳腺癌細(xì)胞(5X IO6個/只）建立皮下乳腺癌腫瘤模型，等腫 瘤長大到約50-80 mm3時（大約1周）開始進行治療。治療共分兩組，即載藥納米粒子(PTX-HA-PLGA NPs)和PTX臨床制劑(Taxol)，用空納米粒子(HA-PLGA NPs)和生理鹽水(PBS)作為 對照組。將給藥起始日定義第0天，分別在第〇、3、6、9和12天通過小鼠尾靜脈注射給藥(PTX 藥量為5 mg/kg)。在治療期間，觀察荷瘤小鼠的腫瘤體積、體重變化和存活率。小鼠的體重 是每三天稱量一次。小鼠的腫瘤體積用游標(biāo)卡尺測量，計算方法為:V=(LXWXH)/2,（其中L 為腫瘤的長度，W為腫瘤的寬度，H為腫瘤的厚度）。持續(xù)觀察小鼠的生存到38天。實驗過程中 小鼠自然死亡或腫瘤體積大于1000 mm3時，判定為死亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTX-HA-PLGA NPs和 Taxol都能在一定程度上抑制腫瘤的生長，而且PTX-HA-PLGA NPs表現(xiàn)出了明顯更優(yōu)越的抑 制腫瘤生長效果，在靜脈注射載藥納米21天后，腫瘤仍能得到很好地抑制，無明顯增長（圖 12A和B)。體重測試結(jié)果顯示PTX-HA-PLGA NPs不會引起小鼠體重明顯變化，這證實了PTX-HA-PLGA NPs不會產(chǎn)生明顯的毒副作用（圖WOt3Kaplan-Meier生存曲線觀察結(jié)果顯示荷瘤 老鼠經(jīng)靜脈注射PTX-HA-PLGA NPs后，在整個治療周期沒有出現(xiàn)死亡（圖12D);而PBS組和空 白納米粒子組動物在治療38天后全部死亡，Taxol組也有60%的動物在治療觀察結(jié)束后死 亡。H&E染色后的組織學(xué)分析表明PTX-HA-PLGA NPs能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞大面積壞死，而對肝臟、 腎臟等正常組織無明顯毒性;而Taxol雖然能在一定程度上殺死腫瘤細(xì)胞，但同時也會導(dǎo)致 正常組織(肝臟和腎臟)的損傷（圖13)。因此，用本發(fā)明的高分子表面活性劑制備的載藥納 米粒子能將藥物靶向輸送到病灶部位，實現(xiàn)明顯增強的療效；同時還大大減小了小分子憎 水藥物的毒副作用。
[0057]綜上可知，本發(fā)明從胺基疏水小分子(分子量大于240)出發(fā)，與聚氨基酸反應(yīng)制備 得到一系列親水、疏水單元可控的聚合物，具備良好的生物可降解性;其可以作為疏水藥物 的增溶劑，大幅增加了疏水藥物的溶解量，提高了藥物的生物利用度，而且適用多種疏水藥 物，有利于提高疏水藥物的應(yīng)用性能;其還可以作為表面活性劑，制備PLGA、PLA、PCL或PEG-PLA等多種生物可降解納米粒子，增加了聚合物納米載體的生物相容性以及功能性，進一步 的，還可以加入靶向分子，得到靶向納米粒子，用于藥物的載體，增加藥物富集率，提高藥物 治療效果。
【主權(quán)項】
1. 一種基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物，其特征在于:所述 基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為以下化學(xué)結(jié)構(gòu) 式中的一種：其中X為2~5，n為3~20;辦分子量大于240 Da;!?:的結(jié)構(gòu)式如下：2. 權(quán)利要求1所述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的制備 方法，其特征在于，包括如下步驟：以疏水性胺基化合物作為引發(fā)劑，開環(huán)聚合α-氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐化合物得到基于功能性疏水小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物;所述 α_氨基酸-Ν-羧基內(nèi)酸酐化合物為γ -寡聚乙二醇-L-谷氨酸-Ν-羧基內(nèi)酸酐或β-寡聚乙二 醇-L-天冬氨酸-Ν-羧基內(nèi)酸酐。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的 制備方法，其特征在于:疏水性胺基化合物包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油?；字?乙醇胺、十六烷基胺或者艾日布林;或者所述疏水性胺基化合物由疏水性羥基化合物制備 得到;疏水性胺基化合物、氨基酸-Ν-羧基內(nèi)酸酐化合物的摩爾比為1:3~25。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的 制備方法，其特征在于：由疏水性羥基化合物制備疏水性胺基化合物為以疏水性羥基化合 物、對硝基苯基氯甲酸酯為原料，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)得到對硝基苯基氯甲酸酯 活化的功能性疏水小分子;然后以對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺化 合物為反應(yīng)物，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)制備疏水性胺基化合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的 制備方法，其特征在于:疏水性羥基化合物包括維他命Ε、膽固醇、香豆素、膽酸、喜樹堿、伊 立替康;二胺化合物選自以下化合物中的一種：乙二胺、丁二胺、辛二胺、賴氨酸甲酯、賴氨 酸乙酯、鳥氨酸甲酯、鳥氨酸乙酯、胱氨酸甲酯、胱氨酸乙酯、胱胺。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述基于疏水功能性小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物的 制備方法，其特征在于:疏水性羥基化合物、對硝基苯基氯甲酸酯和吡啶的摩爾比為1:2:5; 對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子、乙二胺和吡啶的摩爾比為1:20:20。7. -種疏水性胺基化合物，由疏水性羥基化合物制備得到，具體為以疏水性羥基化合 物、對硝基苯基氯甲酸酯為原料，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)得到對硝基苯基氯甲酸酯 活化的功能性疏水小分子;然后以對硝基苯基氯甲酸酯活化的功能性疏水小分子和二胺為 反應(yīng)物，在無水二氯甲烷和吡啶中，反應(yīng)制備疏水性胺基化合物。8. 權(quán)利要求1所述基于疏水功能小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物在增溶憎 水性藥物中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1所述基于疏水功能小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物作為高分 子表面活性劑的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1所述基于疏水功能小分子-親水聚氨基酸的生物可降解聚合物在制備多 功能性納米藥物載體中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K5/093GK105860057SQ201610307256
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】鄧超, 武金田, 孟鳳華, 鐘志遠(yuǎn)
【申請人】蘇州大學(xué)