一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物促生菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株及其應(yīng)用。一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株，其分類學(xué)命名為絲膜菌屬b?2?2(Cortinarius sp.)，于2016年5月12日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為GDMCC No.60037。本發(fā)明的促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株在促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長中的應(yīng)用。采用本發(fā)明提供的方法促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長，操作簡單、成本低廉。本發(fā)明對(duì)于帶葉兜蘭的人工繁育有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。GDMCC No.6003720160512
【專利說明】
一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物促生菌技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌 株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 兜蘭屬(Paphiopedi Ium)植物，花形奇特，花色艷麗，是人們最喜愛的蘭科植物之 一，人們常稱兜蘭為"拖鞋蘭"、"仙履蘭"。近十幾年來，由于猖獗走私以及生境破壞等原因， 野生兜蘭的數(shù)量急劇減少，分布區(qū)逐漸萎縮，不少種類已經(jīng)到了滅絕的邊緣。
[0003] 為了緩解對(duì)野生植株的采集壓力，保護(hù)瀕危物種，以及滿足人們對(duì)兜蘭屬植物的 需求，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)兜蘭植物的人工繁殖進(jìn)行了大量地研究。目前，部分兜蘭種類的無菌播 種和組織培養(yǎng)技術(shù)已獲成功，但無菌苗栽培后生長緩慢，成活率低，制約著兜蘭的人工繁 育。在自然條件下，菌根真菌可以幫助植物度過脆弱的幼苗期長成植株，提高植株提高養(yǎng)分 的吸收效率和逆境抵抗力。但因?yàn)槎堤m屬植物菌根真菌分離培養(yǎng)困難，尚缺乏具有較為顯 著的促生菌株。因此，篩選和培養(yǎng)具有促進(jìn)兜蘭植株生長的菌株對(duì)兜蘭栽培和種群恢復(fù)具 有重要意義。
[0004] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的菌株b-2-2是從硬葉兜蘭根部分離得來，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒 定為擔(dān)子菌亞門傘菌目的絲膜菌屬(Cortinarius sp.)，已于2016年5月12日保藏于廣東省 微生物菌種保藏中心(簡稱GDMCC，地址:廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，廣東省微生 物研究所，郵編510075)，保藏號(hào)為GDMCC No. 60037。
[0007] 本發(fā)明還提供了所述的菌株A6-2在促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長中的應(yīng)用。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0009] 1.本發(fā)明的菌株b-2-2與帶葉兜蘭植株共培養(yǎng)可以促進(jìn)幼苗發(fā)育，長出能進(jìn)行光 合作用的葉片，將幼苗移栽至基質(zhì)培育，幼苗均能存活且生長良好。
[0010] 2.采用本發(fā)明提供的方法促進(jìn)帶葉兜蘭育苗效率和進(jìn)程，操作簡單、成本低廉。本 發(fā)明對(duì)于帶葉兜蘭的人工繁育有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0011] 保藏信息說明
[0012] 絲膜菌屬b-2-2(Cortinarius sp·)，保藏編號(hào)為GDMCC No.60037,保藏日期為 2016年5月12日，保藏單位為廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，保藏地址為廣州市先烈 中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明的絲膜菌屬b-2-2(Cortinarius sp.)在roA固態(tài)培養(yǎng)基上的溶的菌 落形態(tài)；
[0014] 圖2為本發(fā)明的絲膜菌屬b-2_2(Cortinarius sp.)的菌絲形態(tài)；
[0015]圖3為本發(fā)明的絲膜菌屬b-2_2(Cortinarius sp .)制備的菌劑對(duì)植株生長對(duì)比 圖；
[0016] 有關(guān)附圖標(biāo)記的說明：
[0017] CK為未使用本發(fā)明的菌劑的植株；b-2-2是使用本發(fā)明的絲膜菌屬b-2-2 (Cortinarius sp.)制備的菌劑的植株。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0019] 下述實(shí)施例中所用的材料和試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施 例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020] 實(shí)施例1:菌根真菌的分離鑒定和培養(yǎng)
[0021] 1.1分離及純化培養(yǎng)基
[0022] 分離菌根真菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，馬鈴薯200g，瓊脂6g，葡萄糖 15g補(bǔ)水至1000ml，PH自然。依照常規(guī)生物學(xué)試驗(yàn)方法，配置分離培養(yǎng)基，121°C高壓濕熱滅 菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至45°C左右，加入鏈霉素（100ug/ml)和青霉素（100ug/ml)，搖勻后 制備平板。
[0023] 1.2菌根真菌分離及純化方法
[0024]菌根真菌分離按照常規(guī)組織分離法:取帶葉兜蘭新鮮營養(yǎng)根，選取在萊卡顯微鏡 下觀察選擇具有菌絲團(tuán)的根段，在流水下沖洗干凈，用75%酒精漂洗分別處理8min，無菌水 沖洗1-2次，再用10%NaC10消毒8min，無菌水沖洗7-8次。將預(yù)處理過的根切成l-2mm的小 段，然后將處理好的材料置于PDA平板上，24°C恒溫培養(yǎng)3-5d，可見從皮層細(xì)胞內(nèi)長出的菌 絲長入培養(yǎng)基內(nèi)。利用菌絲尖端挑取法對(duì)菌株進(jìn)行分離和純化，再接到試管中保存。
[0025] 1.3菌根真菌的形態(tài)學(xué)鑒定
[0026] 觀察菌株的菌落特征，包括菌落形狀、大小、色澤、生長速度及菌絲、孢子梗及孢子 形態(tài)等。觀察發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基上，菌落成乳白色，早期菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，邊緣極不規(guī) 貝IJ;后期可產(chǎn)生大量氣生菌絲，并形成氈層狀菌絲層，菌落成乳黃色；菌絲生長較慢約5.5d 左右即可長滿培養(yǎng)皿;菌絲無隔，菌絲融合程度高，易形成菌絲融合圈；不產(chǎn)生孢子。
[0027] 分子鑒定方法:菌絲的收集:將菌株接種至PDA液體培養(yǎng)基搖菌7-10天(200rpm，25 °C )，濾紙過濾收集菌絲，用于基因組提取?？侱NA提取使用CTAB法。
[0028] I TS區(qū)段的PCR擴(kuò)增：rDNA ITS區(qū)段的擴(kuò)增采用通用引物ITSl (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG3 '），ITS4(5 'TCCTCCGCTTATTGATATGC3 '）ICR反應(yīng)體系的組成為10 X Buffer 5ul，10mmol/L NTP(Mg+)lul，10u mol/L引物各lul，模板DNA Iul(終濃度在80ng/L 左右），Taq酶1U(0.25ul)，用無菌純水定容至50ul ICR反應(yīng)采用BIARAD Engine型PCR儀，循 環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性95°C，4min，變性95°C，40s，退火56°C，40s，延伸72°C，45s;補(bǔ)平72°C， 8min。共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。
[0029] 產(chǎn)物送至北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測序(使用儀器為ABI 3730XL)。所 得序列結(jié)果使用PRMER3軟件進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)，并輔以人工校對(duì)，確定序列的可靠性。得到序 列在 NCBI 上 BLAST。
[0030] 測序結(jié)果如序列表中序列1所示。將測序結(jié)果在GenBank進(jìn)行在線比對(duì)，該菌株與 絲膜菌屬(Cortinarius sp.)的相似性較高，確定分離到的菌株為膠膜菌屬真菌，將其命名 為菌株b-2-2。
[0031] 實(shí)施例2:菌劑的制備及應(yīng)用
[0032] 2.1液體菌劑制備及應(yīng)用
[0033]采用HM液體培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖15g補(bǔ)水至1000mL)12rC高壓濕熱滅菌 20min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫。接種菌株A6-2后在搖床以160-220rpm搖菌20d左右，稀釋菌液 200-300倍，對(duì)近期移栽的組培苗進(jìn)行蘸根或灌根，約60d灌根1次。組培苗出瓶要求為根長 至少在2cm以上，3片以上葉片的植株才可移栽。
[0034] 2.2固體菌劑制備及應(yīng)用
[0035]將栽培基質(zhì)（松樹皮約2m2大?。赫渲閹r4:1)浸泡到完全水飽和后在121°C高壓濕 熱滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫。接種菌株A6-2制備的菌劑后在30°C放置25d左右，直至 觀察到樹皮有乳白色后為止，將帶菌基質(zhì)分裝后移栽組培苗。
[0036]對(duì)施用菌劑(b-2-2)和未施用菌劑(對(duì)照）的移栽苗在移栽后約180d，隨機(jī)各選擇 30株進(jìn)行葉片數(shù)、最長葉、根數(shù)、最長根和鮮重進(jìn)行測量，結(jié)果如表1所示。
[0037] 表1本發(fā)明的絲膜菌屬b-2-2(Cortinarius sp.)制備的菌劑對(duì)帶葉兜蘭植株生物 量的影響
[0039] 注:數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著；不同大寫字母表示0.01水平 上的差異顯著。
[0040] 如表1可知，施用本發(fā)明的絲膜菌屬b-2-2(Cortinarius sp.)制備的菌劑的帶葉 兜蘭植株根長度顯著增加，鮮重增加也極為顯著。
[0041 ]綜上所述，本發(fā)明的絲膜菌屬b-2-2(Cortinarius sp.)制備的菌劑可以顯著增加 植株的葉片生長，促進(jìn)根的伸長，增加植株生物量的積累。
[0042]前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變 和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng) 用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。 SEQUENCE LISTING <110>廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院花卉研究所 <120> -種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株及其應(yīng)用 m〇> ZYWS <160> 1 <?70'> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 656 [0043] <212> DNA <213> Cortinarius Sp <400> 1 gteatttaga ggaagtaaaa gtegtaacaa agtttcggta ggtgaacctg aggaaggatc 60 attattgaga taaacctgat tagttgtagc tggctctgta gagaggatgt gcactcttgt 120 cateaataea tttccagctg tgcacttttt gtagacttat ttaactctct gaagtcaaat 180 tcaggtttga ggattgattt gttctttcct tacatttatg ggtctatgtt catttgtata 240 ctctgtatgt tatagaatgt cattaatggg cctttgtgcc tataaaattt atacaacttt 300 CEgCSEtggS tctcttggct cttgcEtcgE tga：EgEacgc SgCgEtEtgC gaitatgtEEt 360 gtgaattgca gtattcagtg aatcatcgga tctatgaacg caccttgcgc tccttggtat 420 tctgaggagc atgcctgttt gagtgtcatt aatatatcaa cctcataaga gtgtttggat 480
[0044] gtgggggttt cttttttgct ggttttatat tcagctcccc taaaatgcat tagcagaatt 540 atattgcaga ttgttcatta gtgtgataac tatatctaca ctattgacat gaatgcagat 600 tcagcttcaa actgtctatt aatctggaca atgttttcca ctaaatgtga ccctca 656
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株，其分類學(xué)命名為絲膜菌屬b-2-2(Cortinarius sp.)，于2016年5月12日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為GDMCC No.60037。2. 權(quán)利要求1所述的促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長的菌株在促進(jìn)帶葉兜蘭植株生長中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105861332SQ201610389267
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】周主貴, 王曉國, 黃昌艷, 何荊洲, 李秀玲, 盧家仕, 李冬萍, 鄧杰玲, 陳廷速, 張自斌, 卜朝陽
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所