一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法
【專利摘要】本發(fā)明一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域；其制備方法包括基礎(chǔ)母液培養(yǎng)液的制備、微量元素溶液的制備、維生素及氨基酸溶液的制備、液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制和固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制；本培養(yǎng)基成份明確，含有偽結(jié)核桿菌生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，偽結(jié)核桿菌在該培養(yǎng)基上可以完全自主生長(zhǎng)繁殖，不含有動(dòng)物血清成份，擺脫了偽結(jié)核桿菌體外培養(yǎng)依賴動(dòng)物血清的技術(shù)問(wèn)題，屏蔽了偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)過(guò)程中由動(dòng)物血清污染牲病毒的可能，在滿足微生物生長(zhǎng)的同時(shí)，避免了動(dòng)物血清作為偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)基成分，對(duì)疫苗制品引入傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽結(jié)核桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，廣泛分布于土壤、植株和荊棘表面，在自然環(huán)境中可 長(zhǎng)期保持生命力。偽結(jié)核桿菌也存在于羊體表面，偽結(jié)核桿菌主要通過(guò)體表外傷感染羊只。 感染部位通常羊體容易被荊棘刺傷的頭面部、前胸、肩胛和后肢正面。偽結(jié)核桿菌一旦從羊 只體表傷口進(jìn)入羊體，會(huì)被吞噬細(xì)胞帶至附近的淋巴結(jié)處，但是羊體的免疫系統(tǒng)在淋巴結(jié) 處不能消滅偽結(jié)核桿菌，偽結(jié)核桿菌以淋巴結(jié)為中心繁殖增生，直至形成巨大腫塊。偽結(jié)核 桿菌傳染異常迅速，羊群中一旦出現(xiàn)羊只感染，并且膿腫未經(jīng)科學(xué)處理，膿腫破潰流出的膿 液會(huì)污染羊圈，短時(shí)間可以波及整個(gè)羊群，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。偽結(jié)核桿菌感染分布廣泛， 在國(guó)內(nèi)公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道中在福建、廣西、山東和陜西都有大面積發(fā)生。國(guó)外英國(guó)和美國(guó)也曾爆 發(fā)大范圍的波爾山羊偽結(jié)核桿菌疫情。
[0003] 偽結(jié)核桿菌感染形成的膿腫，初期難以發(fā)覺(jué)，一般在膿腫直徑達(dá)到5cm以上時(shí)可以 被觀察到。在養(yǎng)殖中往往通過(guò)手術(shù)切除聯(lián)合青霉素注射的方式予以治療，在養(yǎng)殖中重治療 輕預(yù)防的應(yīng)對(duì)策略危害到種群健康，增加了養(yǎng)殖戶疾病治療投入，消弱了山羊養(yǎng)殖也經(jīng)濟(jì) 性，妨礙了地區(qū)山羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。同時(shí)具有抗生素濫用的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] 目前尚無(wú)商業(yè)化的偽結(jié)核桿菌疫苗可供使用，在實(shí)際生產(chǎn)中滅活偽結(jié)核桿菌可以 為動(dòng)物提供較好的保護(hù)。在已有文獻(xiàn)中滅活偽結(jié)核桿菌疫苗的制備主要來(lái)自于病畜組織膿 液和含山羊血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的菌體。偽結(jié)核桿菌可以在常規(guī)微生物肉湯培養(yǎng)基中緩慢生 長(zhǎng)，推測(cè)偽結(jié)核桿菌為營(yíng)養(yǎng)缺陷性菌株，不能夠合成全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，高溫滅菌破壞了肉湯培 養(yǎng)基中部分熱敏感營(yíng)養(yǎng)成份。而含血清培養(yǎng)基所制備的疫苗有疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)，并且難以大 規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用于生產(chǎn)。探索無(wú)血清合成培養(yǎng)基是大規(guī)模獲得偽結(jié)核桿菌的有效途徑，可 為偽結(jié)核桿菌滅活疫苗的制備打下基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于偽結(jié)核桿菌的 無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，包括液體和固體兩種培養(yǎng)基。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血 清培養(yǎng)基制備方法，液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法包括基礎(chǔ)母液培養(yǎng)液的制 備、微量元素溶液的制備、維生素及氨基酸溶液的制備、液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的 配制，具體步驟如下：
[0007] a、基礎(chǔ)母液培養(yǎng)液的制備，在1000 mL水溶液中溶解下述成份 KH2PO4 OJg Na2HPO4-12Η·,0 I Ag
[0008] 胰蛋白胨 5 .Og 酵母提取物 2.5g KaCl 3. Og
[0009] 將上述溶液在121°C條件下濕熱滅菌20分鐘，放置至常溫備用；
[0010] b、微量元素溶液的制備，在1000 mL7Jc溶液中配制下述微量元素成份 FcSO4 ·7Η20 O.lg MnCI2 ·4Η20 O.lg
[0011] ZnSiV 7丨-I2O O.lg CoSOh ·7H2〇 O.lg
[0012] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后備用；
[0013] C、維生素及氨基酸溶液的制備，在IOOmL水溶液中溶解下述成份 谷氨酰胺 3.0g 天冬酰胺 3.0.g
[0014] 維·Ψ._?Κ·Β1 0.25g 維屮尜H 0.25g
[0015] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后放置于-20°C備用。
[0016] d、液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制為每1000 mL步驟a中所述配制完成的基 礎(chǔ)培養(yǎng)液在無(wú)菌條件下加入0.5-5mL的步驟b配制的微量元素溶液，加入0.5-2mL步驟c中配 制的維生素及氨基酸溶液。
[0017]固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制如下，在每1000 mL步驟a中所述基礎(chǔ)培養(yǎng) 液未經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌前加入15g瓊脂粉，然后經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌20分鐘處理 后冷卻到50-60 °C時(shí)加入0.5-5mL的步驟b中配制的微量元素溶液，加入0.5-2mL步驟c中配 制的維生素及氨基酸溶液。
[0018] 所述的液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制方法如下，每1000 mL步驟a中所述 配制完成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液在無(wú)菌條件下加入5mL的步驟b配制的微量元素溶液，加入2mL步驟c 中配制的維生素及氨基酸溶液。
[0019] 所述的固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制方法如下，在每1000 mL步驟a中所 述基礎(chǔ)培養(yǎng)液未經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌前加入15g瓊脂粉，然后經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌 20分鐘處理后冷卻到50-60 °C時(shí)加入5mL的步驟b中配制的微量元素溶液，加入2mL步驟c中 配制的維生素及氨基酸溶液。
[0020] 所述的固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基用于傾倒玻璃培養(yǎng)皿。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下有益效果。
[0022] 本培養(yǎng)基成份明確，含有偽結(jié)核桿菌生長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，偽結(jié)核桿菌在該 培養(yǎng)基上可以完全自主生長(zhǎng)繁殖，不含有動(dòng)物血清成份，擺脫了偽結(jié)核桿菌體外培養(yǎng)依賴 動(dòng)物血清的技術(shù)問(wèn)題，屏蔽了偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)過(guò)程中由動(dòng)物血清污染牲病毒的可能，在滿 足微生物生長(zhǎng)的同時(shí)，避免了動(dòng)物血清作為偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)基成分，對(duì)疫苗制品引入傳染 性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025]微量元素添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)速度的影響 [0026] (1 )、在1000 mL溶液中溶解下述成份 KH2PO4 0.3g Na2HPO4-12H?0 1.4g
[0027] 胰蛋白胨 5·% 酵母提取物： 2,5g NaCI 5.Og
[0028] (2)、將（1)中所述溶液在121°C條件下濕熱滅菌20分鐘，放置至常溫備用。
[0029] (3 )、在I OOOmL溶液中配制下述微量元素成份 FcSO^VH2O O.lg MnCMHbO O.lg
[0030] ' ZnS〇4-7H：0 O.lg CoS〇4-7H：O O.lg
[0031] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后備用。
[0032] (4)、在IOOmL溶液中溶解下述成份 谷氨酰胺 3.0g
[0033] 天冬酰胺 3.0g 維牛尜BI 0.25g
[0034] 維生素 H 0.25g
[0035] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后放置于_20°C備用。
[0036] (5)、配制如下液體偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)基
[0037] 每1000 mL步驟(2)中所述配制完成的溶液在無(wú)菌條件下分別加入0.5mL、lmL、2mL、 3mL、4mL和5ml的步驟(3)中所述微量元素溶液，再分別加入2ml步驟(4)中所述溶液。
[0038] (6)、偽結(jié)核桿菌的培養(yǎng)
[0039] 配制完成后，分別取上述步驟(5)中配制好的6個(gè)微量元素梯度的培養(yǎng)基各15mL加 入到IOOmL滅菌三角瓶中，在其中接入10微升的偽結(jié)核桿菌菌液，三角瓶口部塞入棉塞，于 37°C，180RPM條件下下培養(yǎng)72小時(shí)
[0040] (7)、偽結(jié)核桿菌液體培養(yǎng)密度的測(cè)定
[0041 ]取步驟(6)中培養(yǎng)完成的菌液，在分光光度計(jì)上以未接菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè) 定菌液A600濁度。菌液濁度越高，表示細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)越好。
[0042]表1不同微量元素添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 維生素&氨基酸添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)速度的影響
[0046] (1 )、在1000 mL溶液中溶解下述成份 KH2PO4 OJg Na：HP0.r12H20 1,4g
[0047] 胰蛋白胨 5, Og 酵母提取物 2.5g NaCI 5.Og
[0048] (2)、將（1)中所述溶液在121°C條件下濕熱滅菌20分鐘，放置至常溫備用。
[0049] (3)、在1000 mL溶液中配制下述微量元素成份 FcSOr 7H 0.1g
[0050] Μη(；?2·4Η：0 0.1 g ZnSO4-TH7O (λ Ig
[0051] CoSO4-TH2O O.lg
[0052] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后備用。
[0053] (4)、在IOOmL溶液中溶解下述成份 谷氨酰胺 3.0g 天冬酰胺 3.0g
[0054] 維牛.?Κ·Β1 0.25g 維屮 0.25g
[0055] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后放置于_20°C備用。
[0056] (5)、配制如下液體偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)基
[0057] 每1000 mL步驟(2)中所述配制完成的溶液在無(wú)菌條件下分別加入0.25mL、0.5mL、 lmL、1.5mL、2mL和2.5ml的步驟(4)中所述維生素和氨基酸溶液，然后分別加入2ml步驟(3) 中所述溶液。
[0058] (6)、偽結(jié)核桿菌的培養(yǎng)
[0059] 步驟(5)中偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)基配制完成后，分別取上述步驟(5)所述配制好的6個(gè) 維生素梯度培養(yǎng)基各15mL加入到IOOmL滅菌三角瓶中，在其中接入10微升的偽結(jié)核桿菌菌 液，三角瓶口部塞入棉塞，于37°C，180RPM條件下下培養(yǎng)72小時(shí)。
[0060] (7)、偽結(jié)核桿菌液體培養(yǎng)密度的測(cè)定
[0061 ]取步驟(6)中培養(yǎng)完成的菌液，在分光光度計(jì)上以未接菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè) 定菌液A600濁度。
[0062]表2維生素&氨基酸添加量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響
[0064] 實(shí)施例3
[0065] 固體培養(yǎng)基上偽結(jié)核桿菌的培養(yǎng)
[0066] (1 )、在1000 mL溶液中溶解下述成份 KH2PO4 0.3g Na2HPO4-12H：0 1.4g
[0067] 胰蛋白胨 5..% 酵母提取物 2.5g KaCI 5.Og
[0068] (2)、將（1)中所述溶液在121°C條件下濕熱滅菌20分鐘，放置至常溫備用。
[0069] (3 )、在I OOOmL溶液中配制下述微量元素成份 FoSO4TH2O OJg MriCMH2O OJg
[0070] ZnSO4TH2O OJg CoSO4TH 20 (Ug
[0071]配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后備用。
[0072] (4)、在IOOmL溶液中溶解下述成份 谷氨酰胺 3.0g 天冬酰胺 3.0ii
[0073] 維生素BI 0.25g 維生素H 0.25〇
[0074] 配制完成后，通過(guò)0.22微米濾膜過(guò)濾后放置于-20°C備用。
[0075] (5)、配制如下液體偽結(jié)核桿菌培養(yǎng)基
[0076] 每1000 mL步驟(2)中所述配制完成的溶液加入15g瓊脂粉，于滅菌鍋中121°C滅菌 20分鐘，滅菌后待溶液冷卻至55°C_60°C時(shí)在無(wú)菌條件下分別加入加入2ml步驟(3)中所述 溶液;加入ImL的步驟(4)中所述維生素和氨基酸溶液。
[0077] (6)、偽結(jié)核桿菌的培養(yǎng)
[0078]在9cm直徑的無(wú)菌培養(yǎng)皿中加入20mL步驟(5)中所述培養(yǎng)基，室溫放置待培養(yǎng)基凝 固后，用接種環(huán)沾取偽結(jié)核桿菌菌液在培養(yǎng)基表面進(jìn)行涂布。涂布有菌液的培養(yǎng)皿倒置放 于37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)96小時(shí)候后可觀察到菌落生長(zhǎng)。
[0079]本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來(lái)概述。因此，無(wú) 論從哪一點(diǎn)來(lái)看，本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不能限制發(fā)明， 權(quán)利要求書(shū)指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說(shuō)明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明 的權(quán)利要求書(shū)相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何變化，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，其特征在于，液體偽結(jié)核桿菌的無(wú) 血清培養(yǎng)基制備方法包括基礎(chǔ)母液培養(yǎng)液的制備、微量元素溶液的制備、維生素及氨基酸 溶液的制備、液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制，具體步驟如下： a、 基礎(chǔ)母液培養(yǎng)液的制備，在1 OOOmL水溶液中溶解下述成份 KH2P〇4 0 · 3g Na2HP〇4-12H20 1.4g 胰蛋白胨 5.0g 酵母提取物 2.5g NaCl 5.0g 將上述溶液在121°C條件下濕熱滅菌20分鐘，放置至常溫備用； b、 微量元素溶液的制備，在1000mL水溶液中配制下述微量元素成份 FeS04-7H20 O.lg MnCl2-4H20 O.lg ZnS04-7H20 O.lg CoS〇4-7H20 O.lg 配制完成后，通過(guò)〇. 22微米濾膜過(guò)濾后備用； c、 維生素及氨基酸溶液的制備，在100mL水溶液中溶解下述成份 谷氨酰胺 3.0g 天冬酰胺 3.0g 維生素B1 0.25g 維生素H 0.25g 配制完成后，通過(guò)〇. 22微米濾膜過(guò)濾后放置于-20°C備用； d、 液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制為每1000mL步驟a中所述配制完成的基礎(chǔ)培 養(yǎng)液在無(wú)菌條件下加入0.5-5mL的步驟b配制的微量元素溶液，加入0.5-2mL步驟c中配制的 維生素及氨基酸溶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，其特征在于， 固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制如下，在每l〇〇〇mL步驟a中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液未經(jīng)121 °(：條件下濕熱滅菌前加入15g瓊脂粉，然后經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌20分鐘處理后冷卻到 50-60 °C時(shí)加入0.5-5mL的步驟b中配制的微量元素溶液，加入0.5-2mL步驟c中配制的維生 素及氨基酸溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，其特征在于， 步驟d所述的液體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制方法如下，每1000mL步驟a中所述配制 完成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液在無(wú)菌條件下加入5mL的步驟b配制的微量元素溶液，加入2mL步驟c中配 制的維生素及氨基酸溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，其特征在于， 所述的固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基的配制方法如下，在每lOOOmL步驟a中所述基礎(chǔ)培 養(yǎng)液未經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌前加入15g瓊脂粉，然后經(jīng)121°C條件下濕熱滅菌20分鐘處 理后冷卻到50-60 °C時(shí)加入5mL的步驟b中配制的微量元素溶液，加入2mL步驟c中配制的維 生素及氨基酸溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基制備方法，其特征在于， 所述的固體偽結(jié)核桿菌的無(wú)血清培養(yǎng)基用于傾倒玻璃培養(yǎng)皿。
【文檔編號(hào)】C12R1/15GK105861357SQ201610210151
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月6日
【發(fā)明人】李光飛, 蘇少博
【申請(qǐng)人】山西瑞亞力科技有限公司