拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用。該拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌是多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.8527。多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可顯著抑制牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和芍藥雜色尾孢霉菌(Cercospora varricolor Winter)，并顯著促進牡丹的生長。CGMCC No.852720131209
【專利說明】
拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用
[00011 本申請是申請?zhí)枮?01410117673.5、申請日為2014年03月26日、發(fā)明創(chuàng)造名稱為 "一株拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌及其應(yīng)用"的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及拮抗多種牡丹病原菌的多粘類芽孢桿菌的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 牡丹歸芍藥科(Paeoniaceae)、芍藥屬(Paeonia)，一直以來都是中國最重要的觀 賞植物和藥用植物之一，已有1600多年的歷史。目前，牡丹在國內(nèi)的主要栽培地點為荷澤、 洛陽、北京、臨夏、天彭、銅陵等。近年來，牡丹的油用價值日漸凸顯，油用牡丹的發(fā)展呈現(xiàn)出 快速擴張的態(tài)勢。對于觀賞牡丹來講，一個突出的問題是，由于不同地區(qū)氣候環(huán)境和土壤性 質(zhì)的差異造成的土壤微生態(tài)活性降低，是引種地區(qū)栽培牡丹生長狀況不良、觀賞性狀下降 的重要原因之一。而對于油用牡丹，如何科學(xué)施肥并顯著提高牡丹籽的產(chǎn)量則是非常迫切 的問題。在牡丹的栽培過程中，還面臨著一些真菌病害的威脅，主要有灰霉?。˙otrytis paeoniae)、紅斑?。–ladosporium aeoniae)和褐斑?。–ercospora paeoniae)等。因此，研 制促進牡丹生長并拮抗病原菌的微生物菌劑具有顯著和迫切的現(xiàn)實意義。其中，篩選對牡 丹兼具促生和拮抗病原菌功能的植物促生細菌菌種資源是限制微生物菌劑發(fā)展的重要瓶 頸因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一株能拮抗多種牡丹病原菌、促進牡丹生 長并且能以玉米秸桿為原料生產(chǎn)促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌株。
[0005] 本發(fā)明所提供的菌株是多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101，已 于2013年12月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC)， 保藏登記號為CGMCC No.8527。
[0006] 所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的形態(tài)學(xué)特征如下:革 蘭氏陽性，運動，菌體呈桿狀，直徑為0.6-0.8μπι，長為2.0-7.6μπι。芽孢柱狀，1.6-3.5 X 1.2-1.5μπι，中生到次端生。孢子囊明顯膨大成紡錘型或棒狀。其菌落邊緣不整齊裂片狀，半透明 到不透明。后其菌落粗糙，淺白色，中間略突起。菌落粘著在培養(yǎng)基表面。
[0007] 所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的生理生化特征如下：
[0008] 水解淀粉:陰性；
[0009] 水解酪蛋白：陰性；
[0010] 水解明膠:陰性；
[0011] 利用檸檬酸鹽:陰性；
[0012]酪氨酸分解:陰性；
[0013]苯丙氨酸脫氨酶實驗：陰性；
[0014]卵黃卵磷脂酶實驗:陰性；
[0015] 剛噪產(chǎn)生:陰性；
[0016]馬尿酸鹽實驗:陰性；
[0017]接觸酶實驗：陽性；
[0018] 硝酸鹽還原實驗：陽性；
[0019] 二羥丙酮產(chǎn)生：陽性；
[0020] 抗溶菌酶實驗：陽性；
[0021] 分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0022] 分解阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0023]分解木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0024]分解甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0025] 耐鹽性試驗:7%NaCl生長；
[0026]在pH 6.8的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)和pH 5.7的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中均可生長。 在MR-VP肉湯上產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，pH 6.0。
[0027] 所述多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的 16SrDNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，SEQ ID No. 1由1496個核苷酸組成。
[0028] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的多粘類芽孢桿 菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101。
[0029] 該菌劑除包含作為活性成分的多粘類芽孢桿菌（Paenibacil Ius po lymyxa) CSM1101外，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸桿、松殼、稻草、花生皮等。所 述菌劑還可包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體為礦物材料、植物 材料或高分子化合物;所述礦物材料為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻 土中的至少一種;所述植物材料為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種;所述高分子化合物為 聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為水。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養(yǎng)的 活細胞、活細胞的發(fā)酵液、細胞培養(yǎng)物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合 物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。 [0030] 所述多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可為下述A1)_A3)中任 一種菌劑：
[0031 ] Al)促進牡丹生長和拮抗病原菌的菌劑；
[0032] 所述病原菌為牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三種、任兩種或任 一種。
[0033] A2)詰抗病原菌的菌劑;所述病原菌為牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹 枝抱霉(Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter) 中的二種、任兩種或任一種。
[0034] A3)促進牡丹生長的菌劑。
[0035] 所述的多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在制備所述A1)_A3) 中的任一種菌劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0036] 上述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101或上述菌劑的下述用 途也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0037] Cl)促進牡丹生長和拮抗病原菌；
[0038] C2)所述促進牡丹生長；
[0039] C3)所述拮抗病原菌。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種促進牡丹生長的方法。
[0041] 本發(fā)明所提供的促進牡丹生長的方法，包括在生根前將浸種后的牡丹種子用所述 菌劑處理1-3小時(如1小時)再進行生根培養(yǎng)的步驟。
[0042]上述方法中，將浸種后的牡丹種子用所述菌劑處理的方式因所述菌劑的物理狀態(tài) 而異，如果所述菌劑為液態(tài)，直接用所述菌劑浸泡所述浸種后的牡丹種子即可，所述菌劑中 的所述多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的含量可為108cfu/ml_ 109〇如/1111(如109〇;^/1]11) ;如果所述菌劑為固態(tài)，需要向所述菌劑中加水制成液體菌劑，再 用該液體菌劑浸泡所述浸種后的牡丹種子，所述液體菌劑中的所述多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的含量可為108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml)。 [0043]在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，所述牡丹為鳳丹(Paeonia ostii)。
[0044] 上述文中，所述促進牡丹生長可體現(xiàn)為下述Bl)-B7)中的任一種：
[0045] BI)縮短牡丹種子生根時間；
[0046] B2)提高牡丹種子生根率；
[0047] B3)縮短牡丹種子的發(fā)芽時間；
[0048] B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率；
[0049] B5)提高牡丹的主根長度；
[0050] B6)提高牡丹苗高；
[0051] B7)提高牡丹幼苗生物量；
[0052]所述提高牡丹幼苗生物量體現(xiàn)為提高牡丹幼苗的鮮重或干重。
[0053] 上述方法中，所述病原菌可為牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉 (Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的三 種、任兩種或任一種。
[0054] 本發(fā)明的又一目的是提供一種培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) CSM 1101的方法。
[0055] 本發(fā)明所提供的培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的方 法，包括將多粘類芽孢桿菌(PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101在用于培養(yǎng)多粘類芽孢桿 菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
[0056] 本發(fā)明的又一目的是提供一種制備所述菌劑的方法。
[0057] 本發(fā)明所提供的制備所述菌劑的方法，包括如下步驟:將所述的多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101作為活性成分，得到所述菌劑。
[0058] 本發(fā)明的多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可顯著抑制牡丹 葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾孢霉 菌（Cercospora varricolor Winter)，對它們的抑菌率分別達到了57 · 2 %、65 · 7 % 和 88.3%。本發(fā)明多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101處理的牡丹種子(菌 劑組層積處理）的生根時間比對照組層積處理提前了 10天;菌劑組層積處理的生根率達到 95.0%，比對照組層積處理(未用菌劑處理）的生根率提高了 33.8%;菌劑組層積處理的主 根長度為69.0mm，是對照組層積處理的1.68倍;菌劑組層積處理的主根長度2 40mm的種子 百分率達到90±0.5%，是對照組層積處理的1.3倍;菌劑組層積處理的發(fā)芽時間比對照組 層積處理縮短了 10天;菌劑組層積處理的發(fā)芽率達到99.0%，是對照組層積處理的1.2倍； 菌劑組層積處理的苗高是對照組層積處理的1.77倍，菌劑組層積處理的干重是對照組層積 處理的2.27倍。說明以多粘類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No. 8527為活性成分的促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑不但拮抗牡丹病原菌還顯著地促 進了牡丹種子的生根(胚根萌發(fā))和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))和牡丹幼苗的生長。
[0059] 保藏說明
[0060] 菌種名稱:多粘類芽孢桿菌
[0061] 拉丁名：PaenibaciIlus polymyxa
[0062] 菌株編號：CSM 1101
[0063]保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0064] 保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0065]地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0066] 保藏日期：2013年12月09日
[0067] 保藏中心登記入冊編號:CGMCC No .8527
【附圖說明】
[0068]圖1為菌劑組層積處理和對照組層積處理部分種子生根培養(yǎng)60天的照片。
[0069] a為對照組層積處理，b為菌劑組層積處理。
【具體實施方式】
[0070]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0071 ] 下述實施例中所用的牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)ACCC36053和牡丹枝孢 霉(Cladosporium paeoniae)ACCC36063于本申請的申請日前均收藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心（簡稱ACCC，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號，中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)，這兩個菌株的收藏日均為2006年8月 31日，自收藏之日起，公眾可從中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心獲得該菌 株。
[0072]下述實施例中所用的牡丹褐斑病病原菌為茍藥雜色尾孢霉菌（Cercospora varricolor Winter)(張建國，2001 ·牡丹的主要病害及防治·中國花丼園藝，23:32-34)公 眾可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它 用途使用。
[0073]下述實施例中的牡丹為鳳丹（Paeonia ostii)(Jigang Han,Yao Song,Zhigang Liu，etc·201I·Culturable bacterial community analysis in the root domains of two varieties of tree peony(Paeonia ostii).FEMS Microbiol Lett，322:15-24)公眾 可從上海辰山植物園獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用 途使用。
[0074] 下述實施例中所用的培養(yǎng)基如下：
[0075] 半固體D6bereiner 無氮培養(yǎng)基：鹿糖，IOg;蘋果酸，5g;KH2PO4 · H2O，0 · 4g; K2HPO4 · H20,0.1g;MgS〇4 · 7H2〇,0.2g;NaCl，0.1g;CaCl2 · 2H2〇,0.02g;FeCl3,0.01g; Na2MoO4 · 2H20,0.02g;瓊脂，3g;用蒸餾水定容至1000 mKpH 7.0-7.23211:蒸氣滅菌 20min〇
[0076] D0bereiner無氮培養(yǎng)基：鹿糖，IOg;蘋果酸，5g;KH2P〇4 · H2〇,0.4g;K2HP〇4 · H2O， 0.1g;MgS〇4 · 7H2〇,0.2g;NaCl，0.1g;CaCl2 · 2H2〇,0.02g;FeCl3,0.01g;Na2Mo〇4 · 2H2O， 0.02g;瓊脂18g;用蒸餾水定容至1000ml、pH 7.〇-7.2。121<€蒸氣滅菌2〇111；[11。
[0077] NB培養(yǎng)基:葡萄糖5 · Og，蛋白胨5 · Og，牛肉膏3 · Og，用蒸餾水定容至1000ml，pH7 · 0-7.2，121°C 滅菌 20min。
[0078] NA培養(yǎng)基：葡萄糖5. Og，蛋白胨5. Og，牛肉膏3. Og，瓊脂18g，用蒸餾水定容至 100〇1111，？!17.〇-7.2，121。(：滅菌2〇11^11。
[0079] PDA培養(yǎng)基:葡萄糖20g，瓊脂18g，馬鈴薯200g，加水1000 mL煮沸30min濾取汁液，加 水補足 1000ml，pH6.0-7.0，121°C滅菌20min。
[0080] 下述實施例中的纖維素酶購于生工生物工程(上海)股份有限公司。下述實施例中 的纖維素酶酶活力單位(FPU)定義為Ig纖維素酶粉在55°C下60min內(nèi)水解濾紙所得葡萄糖μ m ο 1數(shù)。纖維素酶酶活力的具體測定方法如下：取纖維素酶10.0 0 g，加10 0 m 1 ρ H 4.8 5的 0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液充分溶解，得到纖維素酶液，將纖維素酶液稀釋后，吸取 0.5ml，加入0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液1.5ml，I X 6cm新華一號濾紙條一張，55 °C下水解 60min。水解完畢后采用如下的DNS法測定體系中的葡萄糖含量，并計算纖維素酶的酶活力。
[0081] 下述實施中，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖含量的測定方法采用DNS法，具體如下：
[0082] (I)DNS試劑的配制：200g酒石酸鉀鈉，溶于一定量的水中，加熱溶解，添加10.0g3， 5-二硝基水楊酸，IOg NaOH溶解后加入2g苯酸，0.5g無水亞硫酸鈉，全部加熱溶解后，冷卻 至室溫，定容至l〇〇〇ml。
[0083] (2)葡萄糖標準曲線的繪制:準確稱取100.Omg分析純的無水葡萄糖(預(yù)先在105°C 干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，再定容到刻度、搖勻，濃度 為lmg/mL。取10支試管，分別加入葡萄糖標準溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL、 1.2mL、1.6mL后，用蒸餾水稀釋至2mL，再加入2.5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。 取出后即用水冷卻至室溫，定容到25ml，搖勻。30min后于520nm下測OD值。以O(shè)D 52q值為縱坐 標，葡萄糖含量為橫坐標繪制標準曲線，形式為Y = aX+b。
[0084] (3)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的測定:取稀釋到一定濃度的發(fā)酵上清液(4000r/min，離 心20min)，加入2.5mL DNS試劑混合均勻，在沸水中加熱5min。取出用水冷卻到室溫，定容至 25mL，搖勻，靜置30min后于520nm出測OD 52q值。根據(jù)樣品的OD52q值與標準曲線計算發(fā)酵液中 的葡萄糖含量。
[0085] 實施例1、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的分離與鑒定
[0086] -、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的分離
[0087] 從安徽省銅陵市順安鎮(zhèn)金山村丹皮種植地的牡丹(Paeonia ostii，鳳丹）（株齡6 年)植株的根際采集土樣，將土樣放入裝有無菌水和滅菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min 振蕩20min;取振蕩后的懸液做系列梯度稀釋，IO3UO4稀釋度懸液各吸取200μ1均勻涂布 ffibere i ner無氮培養(yǎng)基，置30°C培養(yǎng)4d后，挑取單菌落，在DSbere i ner無氮培養(yǎng)基固體培 養(yǎng)基平板上用平板劃線法進行菌種純化。將分離純化所得的其中一個菌株命名為牡丹根際 固氮菌CSM 1101。
[0088] 二、牡丹根際固氮菌CSM 1101的鑒定 [0089] 1.形態(tài)特征觀察和生理生化特性測定
[0090]形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定參考"伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊"（Garrity，2001)和"一 般細菌學(xué)常用鑒定方法"（東秀珠等，2001 )，按照常規(guī)方法進行。
[0091]牡丹根際固氮菌CSM 1101的形態(tài)學(xué)特征如下：革蘭氏陽性，運動，菌體呈桿狀，直 徑為0.6-0.8μπι，長為2.0-7.6μπι。芽孢柱狀，1.6-3.5 X 1.2-1.5μπι，中生到次端生。孢子囊明 顯膨大成紡錘型或棒狀。其菌落邊緣不整齊裂片狀，半透明到不透明。后其菌落粗糙，淺白 色，中間略突起。菌落粘著在培養(yǎng)基表面。
[0092] 牡丹根際固氮菌CSM 1101的生理生化特征測定結(jié)果如下：
[0093]水解淀粉:陰性；
[0094]水解酪蛋白：陰性；
[0095]水解明膠:陰性；
[0096]利用檸檬酸鹽：陰性；
[0097]酪氨酸分解:陰性；
[0098]苯丙氨酸脫氨酶實驗：陰性；
[0099]卵黃卵磷脂酶實驗:陰性；
[0100] 吲哚產(chǎn)生：陰性；
[0101] 馬尿酸鹽實驗:陰性；
[0102] 接觸酶實驗:陽性；
[0103] 硝酸鹽還原實驗：陽性；
[0104] 二羥丙酮產(chǎn)生：陽性；
[0105] 抗溶菌酶實驗:陽性；
[0106] 分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0107] 分解阿拉伯糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0108] 分解木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0109] 分解甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣：陽性；
[0110] 耐鹽性試驗:7%NaCl生長；
[0111] 在pH 6.8的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)和pH 5.7的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中均可生長。 在MR-VP肉湯上產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，pH 6.0。
[0112] 2.16S rDNA的序列擴增和分析
[0113] 采用細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN公司）提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模 板。PCR 引物（Pf 5 ' -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和Pr 5 ' -CGGGATCCAA GGAGGTGATCCAGCC-3'）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9700PCR擴增細菌的 16S rDNA。反應(yīng)體系為 10XPCR buffer，2.5uL; dNTP (2 · 5mM) (TaKaRa)，2uL，Pf (IOpmo I/uL) O · IuL，Pr (IOpmo I/uL) O · IuL，Taq聚合酶（5U/ uL) (TaKaRa)，0.125uL，基因組DNA 0.5uL，加 CldH2O至25UUPCR反應(yīng)條件為，94°C預(yù)變性 5min，94°C 變性 lmin，52°C 復(fù)性 lmin，72°C 延伸 lmin，72°C 最后延伸 10min，30 個循環(huán)。PCR 擴 增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司純化并測序。將菌株的16S rDNA序列在 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進行序列比較分析。
[0114] 結(jié)果表明測得的牡丹根際固氮菌CSM 1101 16S rDNA序列全長I 496bp JnSEQID No· 1。在GENBANK進行blastn分析的結(jié)果表明，其序列與Paenibacillus polymyxa strain M-I (EF656457)的相似性達到99%。
[0115] 根據(jù)牡丹根際固氮菌CSM 1101的形態(tài)特征、生理生化特征和16s rDNA序列同源性 分析結(jié)果，將牡丹根際固氮菌CSM 1101鑒定為多粘類芽孢桿菌（Paenibaci Ilus polymyxa)。多粘類芽抱桿菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101 已于2013年 12月09 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No.8527。
[0116] 實施例2、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的生物活性
[0117] -、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的固氮活性測定
[0?18] 固氮活性測定米用乙炔還原法。在15mm X 15mm螺口試管中加入2 · 5mL半固體 D:0berei.n:er_無氮培養(yǎng)基，接種多粘類芽孢桿菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No. 8527后，塞好棉塞，30°C培養(yǎng)24h;再換無菌膠塞密封，抽出10%氣體，注入相同體 積的乙炔，30°C培養(yǎng)24h。抽取氣樣在Varian VISTA 6000型氣相色譜儀上測定ARA (acetyiene reduction activity，乙炔還原活性）。實驗設(shè)三個重復(fù)，取其平均值并計算方 差不大于5%。
[0119] 測定結(jié)果表明，CSM 1101在DSbereiner無氮培養(yǎng)基中表現(xiàn)出了較高的固氮活性。 其乙炔還原活性為12.6C2H4nmol ml/l·1。
[0120] 二、多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的抑菌活性
[0121 ]以牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae)ACCC36053、牡丹枝抱霉（Cladosporium paeoniae)ACCC36063、茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的任一菌株 單獨為病原菌，均采用平板對峙法測定抑菌率，具體方法如下:病原菌菌株在roA斜面上活 化后，加入無菌水制成病原菌懸浮液，將病原菌懸浮液加到融化后冷卻到45-50 °C的PDA培 養(yǎng)基中混勻倒平板，在30°C培養(yǎng)4天，得到病原菌平板，用直徑為6mm的打孔器打取病原菌菌 餅。
[0122] 按照如下方法測定多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101對每種 病原菌的抑菌率:實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)病原菌設(shè)兩個處理，即CSM 1101組和對照組。將 20個無菌HM平板均分為兩組，即CSM 1101組和對照組，每組10個平板，進行以下接種處理： 在CSM 1101組的無菌PDA平板中心接種直徑為6mm的病原菌菌餅，將多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527斜面活化菌種接種于距病原菌菌餅 3cm處。同時，在對照組的無菌PDA平板中心只接種直徑為6mm的病原菌菌餅。將經(jīng)過上述接 種處理的CSM 1101組平板和對照組平板在30°C培養(yǎng)5-7天，待對照組平板(僅接種病原菌） 長滿整個培養(yǎng)皿時，測量對照組的病原菌菌落直徑和CSM 1101組的病原菌菌落直徑，計算 抑菌率。
[0123] 抑菌率（％ )=(對照組的病原菌菌落直徑-CSM 1101組的病原菌菌落直徑)/對照 組的病原菌菌落直徑X100。
[0124] 結(jié)果如表1所不，表明多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No · 8527對牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae)ACCC36053、牡丹枝抱霉（Cladosporium paeoniae)ACCC36063和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)均具有較強 的平板抑菌活性，其抑菌率分別達到了57.2%、65.7%和88.3%。
[0125]表 1 多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527對病原 菌的抑菌率
[0131]實施例3、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑A
[0132] I、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0133] 取玉米秸桿SOOOg(以干重計），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在180°C和1.0 Mpa的條 件下進行水熱處理20min后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘渣。測定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為55g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0134] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0135] 2.1種子培養(yǎng)
[0136] 將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0137] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0138] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 14小時時補加步驟1的酶解液，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖含量為15g/L，繼續(xù)培養(yǎng)16小時，結(jié) 束發(fā)酵?？偣舶l(fā)酵30小時。取發(fā)酵液，測定發(fā)酵液中的菌體含量，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均 值。結(jié)果表明發(fā)酵液中實施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibaci IIus poIymyxa)CSM 1101的 含量為2.58 X IO1t3Cfu/mL，芽孢含量為85%。將該發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘渣等質(zhì)量混合， 噴霧干燥后(60°C)制粒，得到促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑A。
[0139] 實施例4、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑B
[0140] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0141] 取玉米秸桿SOOOg(以干重計），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在180°C和1.0 Mpa的條 件下進行水熱處理20min后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘渣。測定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為55g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0142] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0143] 2.1種子培養(yǎng)
[0144] 將多粘類芽孢桿菌（？&611化3(^11118口〇1711^13)05]\111010610：吣.8527在嫩培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0145] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0146] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 24小時，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測定發(fā)酵液中的菌體含量，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié) 果表明發(fā)酵液中實施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量為 1.86 X IO8Cfu/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘渣等質(zhì)量混合，噴霧干燥 后(60°C)制粒，得到促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑B。
[0147] 實施例5、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑C
[0148] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0149] 取玉米秸桿8000g (以干重計），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在200 °C和2. OMpa的條 件下進行水熱處理20min后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘渣。測定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為60g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0150] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0151] 2.1種子培養(yǎng)
[0152] 將多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527在NA培養(yǎng) 基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振幅， 200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0153] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0154] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 24小時，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測定發(fā)酵液中的菌體含量，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié) 果表明發(fā)酵液中實施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量為 2.78 X IO9Cf u/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘渣等質(zhì)量混合，噴霧干燥 后(60°C)制粒，得到促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑C。
[0155] 實施例6、利用玉米秸桿酶解液生產(chǎn)促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑D
[0156] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0157] 取玉米秸桿SOOOg (以干重計），切成小段，投入水熱反應(yīng)釜，在200 °C和2. OMpa的條 件下進行水熱處理IOmin后自然晾干，得到經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸桿;將該經(jīng)過預(yù)處理的玉米 秸桿粉碎至100目后，按照以干重計每克秸桿加入15FPU的比例加入纖維素酶，按照以干重 計每200克干秸桿加入IL蒸餾水的比例加入蒸餾水，于55°C，IOOrpm(旋轉(zhuǎn)半徑20mm)，pH = 4.8的條件下水解48h后冷卻離心，分別收集上清液和沉淀，該上清液即為酶解液，該沉淀即 為酶解殘渣。測定酶解液中的葡萄糖含量，結(jié)果表明酶解液中的葡萄糖含量為46g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵培養(yǎng)基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述酶解液的含量滿足每升 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH4) 2S〇4的含量為10g、 MgSO4的含量為0.4g、CaC03的含量為6g、玉米漿的含量為2g。
[0158] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0159] 2.1種子培養(yǎng)
[0160] 將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2-3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0161] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0162] 取50L步驟1的發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后， 將2.1所得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣 量和攪拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30%，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng) 24小時，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測定發(fā)酵液中的菌體含量，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié) 果表明發(fā)酵液中實施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量為 4.42 X IO8Cfu/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液和步驟1中的酶解殘渣等質(zhì)量混合，噴霧干燥 后(60°C)制粒，得到促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑D。
[0163] 對比例:利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑E
[0164] 1、發(fā)酵培養(yǎng)基配制
[0165] 發(fā)酵培養(yǎng)基：用淀粉、（NH4)2S04、MgS04、CaCO 3、玉米漿和水配制發(fā)酵培養(yǎng)基（即發(fā)酵 培養(yǎng)基由淀粉、（NH4)2S〇4、MgS〇4、CaC0 3、玉米漿和水組成），每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中所述淀粉 的含量滿足每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量為20g;每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，（NH 4)2SO4的 含量為l〇g、MgS〇4的含量為0.4g、CaC0 3的含量為6g、玉米漿的含量為2g。）
[0166] 該對比例的發(fā)酵培養(yǎng)基中采用的組分除將玉米秸桿酶解液替換為等葡萄糖含量 的淀粉外，發(fā)酵培養(yǎng)基中的其它組分其它均與實施例3-6相同。
[0167] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0168] 該發(fā)酵培養(yǎng)中，發(fā)酵液的制備方法與實施例4-6相同，具體如下：
[0169] 2.1種子培養(yǎng)
[0170] 將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 養(yǎng)基斜面上活化培養(yǎng)后取2 - 3環(huán)接種到500ml三角瓶內(nèi)的50ml NB培養(yǎng)基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振蕩培養(yǎng)24h作為種子液，準備用于發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。
[0171] 2.2發(fā)酵培養(yǎng)
[0172] 取50L發(fā)酵培養(yǎng)基置于100L全自動發(fā)酵罐中，于121°C滅菌20min，冷卻后，將2.1所 得的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量(V/V)為10%。培養(yǎng)溫度為30°C，通過調(diào)節(jié)通氣量和攪 拌轉(zhuǎn)速維持發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量為30 %，發(fā)酵過程中自動調(diào)節(jié)pH為6.8-7.2。培養(yǎng)24小 時，結(jié)束發(fā)酵。取發(fā)酵液，測定發(fā)酵液中的菌體含量，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果表 明發(fā)酵液中實施例1的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的含量為3.66 X 109cfu/mL，芽孢含量為85 %。將發(fā)酵液噴霧干燥后(60°C )制粒，得到促進牡丹生長并拮 抗病原菌的菌劑E。
[0173] 實施例7、促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑促進牡丹種子萌發(fā)和牡丹幼苗生長
[0174] 種子采收:7月以果皮蟹黃為標準采收鳳丹(Paeonia ostii)朞莢果(安徽省銅陵 市順安鎮(zhèn)金山村），置室內(nèi)陰干至果皮開裂后收集種子，〇.5%KMn04浸泡2h進行消毒得到消 毒后的鳳丹(Paeonia ostii)種子用于試驗。試驗地點為上海市松江區(qū)上海辰山植物園。
[0175] 多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527菌懸液的制 備:將實施例3的促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑A懸浮于無菌水中得到多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC Νο·8527菌懸液，使菌懸液中多粘類芽抱桿菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527的含量為 109cfu/mL。
[0176] 取消毒后的鳳丹(Paeonia ostii)種子，用50°C無菌水浸種24h得到浸種后的鳳丹 (Paeonia ostii)種子，以下簡稱浸種后的牡丹種子，進行下述種子生根(胚根萌發(fā))實驗和 發(fā)芽(胚芽萌發(fā))實驗。種子生根(胚根萌發(fā))實驗和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))實驗均重復(fù)三次，每次 重復(fù)設(shè)置兩種處理，即菌劑組層積處理和對照組層積處理。種子生根(胚根萌發(fā))實驗中，每 種處理300粒浸種后的牡丹種子。發(fā)芽（胚芽萌發(fā)）實驗中，每種處理選取50粒主根長度2 40mm并且長度一致的生根種子。具體實驗方法如下：
[0177] 1、種子生根(胚根萌發(fā))實驗
[0178] 菌劑組層積處理和對照組層積處理這兩種處理中除生根前預(yù)處理方式不同外，其 它處理方式完全相同。菌劑組層積處理的生根前預(yù)處理如下：將浸種后的牡丹種子置于多 粘類芽抱桿菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527菌懸液（109cfu/mL)中 在25-30°C浸泡1小時，完成生根前預(yù)處理。對照組層積處理的生根前預(yù)處理如下:將浸種后 的牡丹種子在25-30Γ置于無菌水中浸泡1小時，完成生根前預(yù)處理。然后將完成生根前預(yù) 處理的種子均進行如下生根培養(yǎng):將完成生根前預(yù)處理的種子與含水量為400%的高溫滅 菌的珍珠巖(層積基質(zhì)）按照1:3的體積比混勻后，裝入聚乙烯塑料袋均置于10°C-25°C(晝 20-25Γ，夜10-15Γ)進行生根培養(yǎng)。每天觀察1次，調(diào)查生根時間，生根培養(yǎng)90d調(diào)查測定生 根率、主根長度、主根長度2 40mm的種子百分率。數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行差異顯著性分析。
[0179] 其中，以胚根露出種皮的長度為種子長度的1/2為生根。
[0180] 生根率=(L1/L0)X100%;
[0181 ] LI:生根實驗種子中生根種子粒數(shù);LO:生根實驗種子粒數(shù)。
[0182] 2、發(fā)芽(胚芽萌發(fā))實驗
[0183] 分別取步驟1的菌劑組層積處理和對照組層積處理這兩種處理得到的主根長度2 40mm并且長度一致的生根種子在4 °C貯藏21天后，栽植于高IOcm裝有泥炭和珍珠巖的穴盤 中，置于l〇-25°C溫室(晝20-25°C，夜10-15°C)中進行發(fā)芽培養(yǎng)成苗，每天觀察1次，測定發(fā) 芽時間，發(fā)芽培養(yǎng)90d測定發(fā)芽率、苗高、整個牡丹幼苗植株的干重，計算發(fā)芽率。數(shù)據(jù)用 SPSS軟件進行差異顯著性分析。
[0184] 其中，以胚芽露出種皮為發(fā)芽。
[0185] 發(fā)芽率=(1^/LO') X 100%;
[0186] LI':發(fā)芽實驗種子中發(fā)芽種子粒數(shù);LO':發(fā)芽實驗種子粒數(shù)。
[0187] 結(jié)果如表3-表5所示，菌劑組層積處理的生根時間比對照組層積處理提前了 10天； 菌劑組層積處理的生根率達到95.0%，比對照組層積處理的生根率提高了33.8% ;菌劑組 層積處理的主根長度為69.0mm，是對照組層積處理的1.68倍;菌劑組層積處理的主根長度 2 40mm的種子百分率達到90±0.5%，是對照組層積處理的1.3倍;菌劑組層積處理的發(fā)芽 時間比對照組層積處理縮短了 10天;菌劑組層積處理的發(fā)芽率達到99.0%，是對照組層積 處理的1.2倍;菌劑組層積處理的苗高是對照組層積處理的1.77倍，菌劑組層積處理的干重 是對照組層積處理的2.27倍。說明以多粘類芽孢桿菌（？3611；^3(3；[11118口017111713)031 1101CGMCC No.8527為活性成分的促進牡丹生長并拮抗病原菌的菌劑顯著地促進了牡丹種 子的生根(胚根萌發(fā))和發(fā)芽(胚芽萌發(fā))和牡丹幼苗的生長。圖1顯示了菌劑組層積處理和 對照組層積處理部分種子生根培養(yǎng)60天的情況。
[0188] 表3、菌劑處理對牡丹種子生根的影響
[0190] 注:表中同列的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯 著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。生根時間是指第1粒種子生根的時間。 [0191]表4、菌劑處理對牡丹種子發(fā)芽的影響
L0193」注：表中同列的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯 著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。發(fā)芽時間是指第1粒主根長度2 40mm的 生根種子發(fā)芽的時間。
[0194]表5、菌劑處理對牡丹幼苗生長的影響
[0196] 注:表中同列的英文字母表示差異顯著程度，相同字母的處理間在0.05水平無顯 著差異，字母不同的處理間在0.05水平有顯著差異。苗高是幼苗地上部分的高度，干重是整
【主權(quán)項】
1 ·多粘類芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在制備下述A1 )_A3)中的任一 種菌劑中的應(yīng)用： A1)促進牡丹生長和拮抗病原菌的菌劑； 所述病原菌為牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三種、任兩種或任 一種； A2)詰抗病原菌的菌劑;所述病原菌為牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢 霉（Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的 二種、任兩種或任一種； A3)促進牡丹生長的菌劑； 所述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.8527。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述促進牡丹生長體現(xiàn)為下述B1 )-B7)中 的任一種： B1)縮短牡丹種子生根時間； B2)提高牡丹種子生根率； B3)縮短牡丹種子的發(fā)芽時間； B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率； B5)提高牡丹的主根長度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量。3. 促進牡丹生長的方法，包括在生根前將浸種后的牡丹種子用菌劑處理1-3小時再進 行生根培養(yǎng)的步驟；所述菌劑的活性成分為所述多粘類芽孢桿菌（Paenibaci 1 lus polymyxa)CSM 1101〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述促進牡丹生長體現(xiàn)為下述Bl)-B7)中 的任一種： B1)縮短牡丹種子生根時間； B2)提高牡丹種子生根率； B3)縮短牡丹種子的初萌期； B4)提高牡丹種子的發(fā)芽率； B5)提高牡丹的主根長度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量； 所述詰抗病原菌為詰抗牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉 (Cladosporium paeoniae)和茍藥雜色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的三 種、任兩種或任一種。
【文檔編號】A01C1/00GK105861378SQ201610308942
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年3月26日
【發(fā)明人】韓繼剛, 王云山, 胡永紅
【申請人】上海辰山植物園