一種有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑dh-1及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH?1及其應(yīng)用。其含有假單胞菌(Pseudomona)屬的細(xì)菌、申氏桿菌(Shinella)屬的細(xì)菌、熱單胞菌(Thermomonas)屬的細(xì)菌、德沃斯氏菌(Devosia)屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌(Alishewanella)屬的細(xì)菌。本發(fā)明通過向水體中投入特定的功能微生物?復(fù)合菌劑DH?1，發(fā)揮微生物水生微生態(tài)調(diào)節(jié)和“藻菌互作”的作用，從而達(dá)到抑制(去除)銅綠微囊藻的微生物除藻法，具有成本低、安全性高和不破壞水體生態(tài)環(huán)境的特色，對治理銅綠微囊藻水華水體具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】
一種有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑 DH-I及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著城市化和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，大量富含氮(N)、磷(P)等營養(yǎng)物質(zhì)的工業(yè)廢水、 生活污水流入湖泊、河流等緩流水體，使水中營養(yǎng)物質(zhì)迅速富集，水中藻類暴發(fā)性增長，藍(lán) 藻水華頻繁發(fā)生，造成水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化，給水體質(zhì)量、用水安全和景觀環(huán)境等方面帶來不 利影響。銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)是引起水華的最常見藻種，也是我國藍(lán)藻 水華的主要藻種，其特殊的生理生態(tài)特點(diǎn)使其在富營養(yǎng)化水體中容易成為優(yōu)勢藻種并導(dǎo)致 藍(lán)藻水華的暴發(fā)。銅綠微囊藻在細(xì)胞生長及死亡過程中會釋放出肝毒素，該毒素是一種強(qiáng) 促癌劑，對水生生物危害極大，間接危害人類的健康，因此，治理藍(lán)藻水華污染已成為急迫 解決的問題。
[0003] 目前藍(lán)藻水華的治理方法主要有物理法和化學(xué)法，這些方法存在一定的缺陷，如 物理法成本高、需要大量人力物力和處理能力有限?；瘜W(xué)法容易造成二次污染，選擇毒性差 或者只能適應(yīng)小面積水域。因此，積極尋找新型、高效、環(huán)保的藍(lán)藻水華防治方法具有十分 重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-I及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-I，其特征在于，含有假單胞 菌屬（Pseudomona sp.)的細(xì)菌、申氏桿菌屬（Shinella sp.)的細(xì)菌、熱單胞菌屬 (Thermomonas sp.)的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬（Devosia sp.)的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬 (Alishewanella sp.)的細(xì)菌。
[0006] 優(yōu)選，所述的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-I中，假單胞菌屬的細(xì)菌、 申氏桿菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌數(shù) 量比為 160:27:8:3:1。
[0007] 優(yōu)選，所述的假單胞菌屬的細(xì)菌優(yōu)選為門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina)ACCC01078或假單胞菌（Pseudomonas sp. )FIM_20151013001;所述的申氏桿菌 屬的細(xì)菌為申氏桿菌（Shinella sp.)ACCC19821或申氏桿菌（Shinella sp.)FIM_ 20151013002;所述的熱單胞菌屬的細(xì)菌為熱單胞菌（Thermomonas sp.)F頂-20151013003; 所述的德沃斯氏菌屬的細(xì)菌為德沃斯氏菌(Devosia honganense)ACCC19737或德沃斯氏菌 (Devosia sp . )FIM-20151013004,所述的另類希滅氏菌屬的細(xì)菌優(yōu)選為另類希滅氏菌 (Alishewanella fetalis)ACCC10045或另類希滅氏菌（Alishewanella sp.)FIM_ 20151013005〇
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-I的制備 方法，其特征在于，將假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃斯氏 菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌的菌液混合后，去除菌液留下菌體，菌體即為復(fù)合菌 劑DH-I。
[0009]優(yōu)選，是分別將假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃 斯氏菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌分別進(jìn)行發(fā)酵，然后稀釋至菌體濃度為IXIO8 個(gè)/ml，再將I X IO8個(gè)/ml的假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德 沃斯氏菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌按照體積比160:27:8:3:1混合均勻，然后離心 去除上清，留下菌體，菌體即為復(fù)合菌劑DH-I。
[0010]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-I在抑制 水華銅綠微囊藻中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明依據(jù)微生物生態(tài)學(xué)原理和方法，對水華銅綠微囊藻功能菌進(jìn)行合理復(fù)配， 獲得對銅綠微囊藻具有良好的抑制(去除)效果的復(fù)合菌劑DH-I，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。
[0012] 本發(fā)明通過向水體中投入特定的功能微生物-復(fù)合菌劑DH-I，發(fā)揮微生物水生微 生態(tài)調(diào)節(jié)和"藻菌互作"的作用，從而達(dá)到抑制（去除）銅綠微囊藻的微生物除藻法，具有成 本低、安全性高和不破壞水體生態(tài)環(huán)境的特色，對治理銅綠微囊藻水華水體具有重要的現(xiàn) 實(shí)意義。
【具體實(shí)施方式】：
[0013] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0014] 以下實(shí)施例中使用的假單胞菌(Pseudomonas sp · )FIM_20151013001、申氏桿菌 (Shinella sp· )F頂-20151013002、熱單胞菌（Thermomonas sp· )F頂-20151013003、德沃斯 氏菌（Devosia sp.)FIM_20151013004和另類希滅氏菌（Alishewanella sp.)FIM_ 20151013005均來自于福建省微生物研究所，其保藏于福建省微生物研究所，保藏于福建省 微生物研究所的菌株是對外銷售的，這些菌株也是對外銷售的，因此在申請日以前，現(xiàn)有技 術(shù)中的任何人都可以購買到這些菌株。并且上述菌株在申請日以前已經(jīng)公開在網(wǎng)頁上 (http: //www. fjim. org. cn/kytd/ktz/getNews · jsp?newsid = 220)，該菌株本
【申請人】也持 有，并保證自申請日起20年內(nèi)向公眾提供。
[0015] 實(shí)施例1:
[0016] 1、斜面培養(yǎng)
[0017] 將假單胞菌（Pseudomonas sp · )FIM_20151013001、申氏桿菌（Shinella sp · )FIM_ 20151013002、熱單胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp.) F頂-20151013004和另類希滅氏菌(Alishewanella sp. )F頂-20151013005以及銅綠假單胞 菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和門多薩假單胞菌 (Pseudomonas mendocina)接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3d。
[0018]營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方：蛋白胨IOg，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15~20g，蒸餾水 1000 mL，混合均勾后，121 °C高壓滅菌15min。
[0019] 2、發(fā)酵培養(yǎng)
[0020] 用接種環(huán)分別挑起少量斜面培養(yǎng)基上的上述菌株的菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 °C、150r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)2~3d。用發(fā)酵培養(yǎng)基對菌液進(jìn)行稀釋，使其濃度為IX IO8 ~IO9個(gè)/ml。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/1):胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉10.0，余量為水，pH 自然，將上述成份混合均勻后，滅菌備用。
[0021] 3、復(fù)合菌劑的制備
[0022] 將I X IO8個(gè)/ml的假單胞菌菌液、I X IO8個(gè)/ml的申氏桿菌菌液、I X IO8個(gè)/ml的熱 單胞菌菌液、I X IO8個(gè)/ml的德沃斯氏菌菌液和I X IO8個(gè)/ml的另類希滅氏菌菌液，按照體積 比160:27:8:3:1的體積比混合均勻，8000r/min離心5min，棄上清液得到菌體，即為復(fù)合菌 劑，將此復(fù)合菌劑命名為復(fù)合菌劑DH-I。
[0023] 實(shí)施例2復(fù)合菌劑DH-I和假單胞菌屬菌種對銅綠微囊藻的抑制作用試驗(yàn)
[0024] 采集福州長樂某藍(lán)藻水華河水，該藍(lán)藻水華優(yōu)勢種為銅綠色微囊藻。河水預(yù)先經(jīng)8 層紗布過濾去除大顆粒物質(zhì)。量取2L河水，加入到5L燒杯中，同時(shí)加入IL BG-11培養(yǎng)基，攪 勻混均。以不添加菌的組作為空白對照組(CK)，以分別添加實(shí)施例1的復(fù)合菌劑DH-1、銅綠 假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌、申氏桿菌(Shinella sp. )F頂-20151013002、熱 單胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp. )FIM_20151013004 和另類希滅氏菌(Alishewanella sp. )F頂-20151013005的組為實(shí)驗(yàn)組，均設(shè)三個(gè)平行樣， 銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌、申氏桿菌（Shine Ila sp. )FIM-20151013002、熱單胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp.) F頂-20151013004和另類希滅氏菌(Alishewanella sp. )F頂-20151013005的菌體添加量與 復(fù)合菌劑DH-I的添加量相同。由于葉綠素 a(chlorophyll-a，chl_a)作為藻類細(xì)胞的重要吸 光色素在光合作用中起著吸收和傳遞光能的關(guān)鍵作用，對藻類的生長起重要影響，是植物 生長狀況的重要指標(biāo)之一，所以以葉綠素 a的含量作為藻類含量的評價(jià)指標(biāo)。采用丙酮提取 分光光度法（中華人民共和國水利行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SL 88-2012))測定葉綠素 a含量。
[0025] 預(yù)先測定初始水體中的葉綠素 a含量。實(shí)驗(yàn)組分別按1%。的體積百分比投加復(fù)合菌 劑DH-I、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌、申氏桿菌（Shine I la sp. )FIM-20151013002、熱單胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp.) FIM-20151013004和另類希滅氏菌（Alishewanella sp. )FIM-20151013005,底部設(shè)有曝氣 頭，采用間歇曝氣，即曝2h，停2h，實(shí)驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為(25±1)°C，光暗比 (光照時(shí)間與無光照時(shí)間之比）為12:12,光照強(qiáng)度為20001UX。定時(shí)觀察。培養(yǎng)8d后測定水體 中的葉綠素 a含量。
[0026]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表1)，培養(yǎng)8d后，空白對照組(CK)以及加入復(fù)合菌劑DH-1、銅綠假 單胞菌、惡臭假單胞菌、門多薩假單胞菌、申氏桿菌(Shinella sp.)F頂-20151013002、熱單 胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp. )FIM_20151013004和 另類希滅氏菌(Alishewanella sp. )FIM_20151013005的處理組水體中的葉綠素 a平均含量 分別為 1 · 349yg/L、0 · 2 lyg/L、0 · 60yg/L、0 · 69yg/L、0 · 63yg/L、1 · 0 lyg/L、0 · 98yg/L、1 · 07yg/ L和0.95yg/L。與初始水體中的葉綠素 a含量0.29yg/L相比，空白對照組(CK)水體中的葉綠 素 a含量有顯著的上升，說明經(jīng)過Sd培養(yǎng)后空白對照組中的銅綠微囊藻迅速生長繁殖，含量 明顯提高。與空白對照組(CK)相比，添加了假單胞菌屬銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、門多 薩假單胞菌的處理組水體中的葉綠素 a含量有小幅度的上升，說明假單胞菌屬銅綠假單胞 菌、惡臭假單胞菌和門多薩假單胞菌對銅綠微囊藻具有一定的抑制效果，而添加申氏桿菌 (Shinella sp· )F頂-20151013002、熱單胞菌（Thermomonas sp· )F頂-20151013003、德沃斯 氏菌（Devosia sp.)FIM_20151013004 和另類希滅氏菌（Alishewanella sp.)FIM-20151013005的處理組水體中的葉綠素 a含量有一定的上升，說明申氏桿菌(Shinella sp.) F頂-20151013002、熱單胞菌（Thermomonas sp· )FM-20151013003、德沃斯氏菌（Devosia sp· )F頂-20151013004和另類希滅氏菌(Alishewanella sp· )FIM-20151013005對銅綠微囊 藻不具有顯著的抑制效果，而添加復(fù)合菌劑DH-I的處理組與空白對照組(CK)和添加銅綠假 單胞菌、惡臭假單胞菌和門多薩假單胞菌的處理組相比，其水體中的葉綠素 a含量變化不明 顯，說明復(fù)合菌劑DH-I對水華銅綠微囊藻具有強(qiáng)烈的抑制作用，復(fù)合菌劑DH-I比單一的假 單胞菌屬菌株具有更佳的抑制水華銅綠微囊藻的效果。
[0027]表1實(shí)驗(yàn)菌對銅綠微囊藻的抑制結(jié)果
[0029] BGll培養(yǎng)基組分：NaNO3 1.5g，K2HP〇4 0.04g，MgS〇4 · 7H20 0.075g，CaCl2 · 7H20 0.036g ,Na2CO3 0.02g，檸檬酸0.006g，檸檬酸鐵0.006g，微量元素溶液A5 Iml，氨芐青霉素 (終濃度）50yg/mL，水定容至1000 mU微量元素溶液A5組分：H3B〇4 2.86g，MnCl2 · 4H201.81g，ZnS〇4 0.222g，Na2Mo〇4 0.39g，CuS〇4.5H20 0.079g，Co(N03)2.6H2〇 49.4g，水 定容至1000ml。
[0030] 本發(fā)明也可以用假單胞菌(Pseudomona)屬的其他細(xì)菌、申氏桿菌(Shinella)屬的 其他細(xì)菌、熱單胞菌(Thermomonas)屬的其他細(xì)菌、德沃斯氏菌(Devosia)屬的其他細(xì)菌和 另類希滅氏菌(Al ishewanel la)屬的其他細(xì)菌，如將實(shí)施例1中的假單胞菌(Pseudomonas sp. )FIM_20151013001 替換為門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina)ACCC01078、申氏 桿菌（Shinella sp.)F頂-20151013002替換為申氏桿菌（Shinella sp. )ACCC19821、德沃斯 氏菌（Devosia sp.)FIM_20151013004替換為德沃斯氏菌（Devosia honganense) ACCC19737，另類希滅氏菌（Alishewanel la sp · )FIM_20151013005替換為另類希滅氏菌 (Alishewanella fetalis)ACCC10045,然后按照實(shí)施例1的方法制備得到復(fù)合菌劑DH-I (2)，然后按照上述方法進(jìn)行抑制水華銅綠微囊藻的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)合菌劑DH-1(2) 對水華銅綠微囊藻具有強(qiáng)烈的抑制作用，復(fù)合菌劑DH-1(2)比單一的假單胞菌屬菌株具有 更佳的抑制水華銅綠微囊藻的效果。所述的門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina) ACCC01078、申氏桿菌（Shinella sp.) ACCC19821、德沃斯氏菌（Devo si a honganense) ACCC19737、另類希滅氏菌(Alishewanel la fetal is )ACCC10045均保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物 菌種保藏管理中心，可以從那里購買到。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1，其特征在于，含有假單胞菌屬 (卩8611(1〇1]10仙8。.）的細(xì)菌、申氏桿菌屬（311；[11611&8。.）的細(xì)菌、熱單胞菌屬（1'1161'1]101]1011&8 sp.)的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬(Devosia sp.)的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬(Alishewanella sp.) 的細(xì)菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1，其特征在于，所 述的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1中，假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿菌屬的細(xì) 菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌數(shù)量比為160:27:8: 3:1〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1，其特征在于，所 述的假單胞菌屬的細(xì)菌為門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)ACCCO 1078或假單胞 菌(Pseudomonas sp. )FIM_20151013001;所述的申氏桿菌屬的細(xì)菌為申氏桿菌（Shinella sp.)ACCC19821或申氏桿菌（Shinella sp.)F頂-20151013002;所述的熱單胞菌屬的細(xì)菌為 熱單胞菌(Thermomonas sp. )FIM_20151013003;所述的德沃斯氏菌屬的細(xì)菌為德沃斯氏菌 (Devosia honganense)ACCC19737或德沃斯氏菌（Devosia sp. )FIM_20151013004,所述的 另類希滅氏菌屬的細(xì)菌為另類希滅氏菌(Alishewanella fetal is )ACCC10045或另類希滅 氏菌（Alishewanella sp. )FIM_20151013005〇4. 一種權(quán)利要求1所述的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1的制備方法，其 特征在于，將假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬的 細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌的菌液混合后，去除菌液留下菌體，菌體即為復(fù)合菌劑DH-1。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，是分別將假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿 菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌分別進(jìn)行 發(fā)酵，然后稀釋至菌體濃度為1 X 1〇8個(gè)/ml，再將1 X 108個(gè)/ml的假單胞菌屬的細(xì)菌、申氏桿 菌屬的細(xì)菌、熱單胞菌屬的細(xì)菌、德沃斯氏菌屬的細(xì)菌和另類希滅氏菌屬的細(xì)菌按照體積 比160:27:8:3:1混合均勻，然后離心去除上清，留下菌體，菌體即為復(fù)合菌劑DH-1。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的假單胞菌屬的細(xì)菌為門多薩假 單胞菌（Pseudomonas mendocina)ACCC01078或假單胞菌（Pseudomonas sp.)FIM_ 20151013001;所述的申氏桿菌屬的細(xì)菌為申氏桿菌(Shinella sp. )ACCC19821或申氏桿菌 (Shinella sp· )FIM_20151013002;所述的熱單胞菌屬的細(xì)菌為熱單胞菌（Thermomonas sp. )FIM_20151013003;所述的德沃斯氏菌屬的細(xì)菌為德沃斯氏菌(Devosia honganense) 八〇〇(319737或德沃斯氏菌(06￥〇813 8口.奸頂-20151013004，所述的另類希滅氏菌屬的細(xì)菌 為另類希滅氏菌（Alishewanella fetal is )ACCC 10045或另類希滅氏菌（Alishewanella sp.)F頂-20151013005。7. 權(quán)利要求1、2或3所述的能有效抑制水華銅綠微囊藻的復(fù)合菌劑DH-1在抑制水華銅 綠微囊藻中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/38GK105861395SQ201610421245
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】聶毅磊, 陳宏 , 賈緯
【申請人】福建省微生物研究所