一株禽致病性大腸桿菌菌株及其在疫苗制備中的應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術領域，本發(fā)明提供一株禽致病性大腸桿菌菌株，為禽致病性大腸桿菌luxS和aroA雙基因缺失株，其保藏號為CGMCC10601。本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌菌株可用于制備禽致病性大腸桿菌滅活、弱毒疫苗和菌蛻疫苗，預防禽致病性大腸桿菌感染。CGMCC No.1060120150311
【專利說明】
一株禽致病性大腸桿菌菌株及其在疫苗制備中的應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及一株禽致病性大腸桿菌菌株及 其在疫苗制備中的應用。
【背景技術】
[0002] 禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli， APEC)引起的嚴重影響?zhàn)B禽業(yè)的傳染病之一。APEC感染家禽可引起肺炎、氣囊炎、心包炎、肝 周炎、腹膜炎、輸卵管炎等癥狀。嚴重時引起以敗血癥為特征的全身感染，導致急性死亡。目 前禽致病性大腸桿菌復雜的血清型和廣譜的耐藥性，給禽大腸桿菌病的防控提出了新的挑 戰(zhàn)。APEC不僅危害禽體健康，同時影響了產(chǎn)蛋量和肉用禽的上市時間，并且增加了飼養(yǎng)成 本，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 目前對禽大腸桿菌病的防治除加強管理外，主要采用藥物防治，治療藥物主要選 用抗生素。但由于耐藥性的出現(xiàn)，導致目前在該病的防控過程中大量使用抗生素，極易造成 禽產(chǎn)品出現(xiàn)藥物殘留，進而直接影響禽產(chǎn)品的食品的安全，這不僅關系到畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜 牧業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，還關系到人類的身體健康和生存環(huán)境。
[0004] 制約APEC疫苗研制的一個關鍵因素是缺少具有良好免疫原性、毒力低的APEC疫苗 株。因此篩選合適的APEC毒力基因，對APEC菌株毒力進行致弱、減毒是獲得APEC疫苗株的主 要技術方式之一。國內外的研究表明，對大腸桿菌的基因進行缺失、改造和修飾，都可以減 毒，這些基因主要包括一些毒力基因、調控基因以及代謝相關基因，如aroA和IuxS等。
[0005] 在上述減毒基因中，APEC中的IuxS基因是構成LuxS/AI-2型密度感應系統(tǒng)的關鍵 基因，不但是APEC的重要毒力基因，而且對APEC的致病性具有重要的調控作用。此外，aroA 基因缺失對細菌可以明顯減毒并保持良好的免疫原性，是大腸桿菌減毒的主要手段之一。 aroA基因編碼芳香族氨基酸生物合成途徑中的3-烯醇丙酮酰莽草酸-5-磷酸合成酶，該基 因的功能缺失導致細菌的生長需要酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等，在缺乏這些代謝產(chǎn)物的情 況下，細菌的生長會受到抑制。此外，aroA突變株所需要的芳香族代謝產(chǎn)物沒有在脊椎動物 組織中發(fā)現(xiàn)，包括人體組織，確保了其在哺乳動物體內有限的復制，減少了在野外條件下散 毒的風險。

【發(fā)明內容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供一株禽致病性大腸桿菌菌株，為禽致病性大腸桿 菌aroA和IuxS雙基因缺失株，命名為DE17 Δ aroA Δ luxS。
[0007] 本發(fā)明再一目的在于提供一株禽致病性大腸桿菌菌株在用于制備禽致病性大腸 桿菌滅活、弱毒疫苗和菌蛻疫苗中的應用。
[0008] 本發(fā)明還一目的在于提供包含該禽致病性大腸桿菌菌株的疫苗。
[0009] 本發(fā)明采用如下技術方案：
[0010] -株禽致病性大腸桿菌菌株，為禽致病性大腸桿菌IuxS和aroA缺失株，命名為 DE17 Δ aroA Δ luxS，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，已于2015年3月11日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號），其保藏號為CGMCC10601。
[0011] 本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌菌株用于制備禽致病性大腸桿菌滅活、弱毒疫苗和 菌蛻疫苗中的應用。
[0012] 本發(fā)明提供一種包含保藏號為CGMCC10601的禽致病性大腸桿菌菌株的禽致病性 大腸桿菌滅活、弱毒疫苗和菌蛻疫苗，可用于預防禽致病性大腸桿菌感染。
[0013] 為驗證本發(fā)明缺失株DE17 Δ aroA Δ IuxS對APEC的減毒作用，進行了 IuxS和aroA缺 失株對櫻桃谷鴨半數(shù)致死量的檢測、對雞胚層纖維細胞DF-I的黏附和入侵檢測、在櫻桃谷 鴨體內肝臟、脾臟和血液的載菌量檢測、運動性檢測、部分毒力基因，轉錄水平檢測以及對 感染櫻桃谷鴨臟器(肝臟、腎臟、脾臟)的病變分析，結果表明，IuxS和aroA的缺失導致APEC 的毒力顯著降低。
[0014]本發(fā)明通過同時缺失禽致病性大腸桿菌DE17株aroA和IuxS基因，有效的實現(xiàn)了對 DE17的毒力減弱，建立了致弱禽致病性大腸桿菌毒力的新方法。本發(fā)明的禽致病性大腸桿 菌滅活、弱毒疫苗和菌蛻疫苗，可用于預防禽致病性大腸桿菌感染的防控，減少抗生素的使 用，對該病的防控和食品安全具有重要的公共衛(wèi)生意義和良好的經(jīng)濟效益。
[0015] 本發(fā)明所述禽致病性大腸桿菌菌株，為禽致病性大腸桿菌IuxS和aroA缺失株，命 名為DEl7 Δ aroA Δ luxS，分類命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli，已于2015年3月11日 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號），其保藏號為CGMCC10601。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明aroA和IuxS缺失對APEC運動性的影響；
[0017] 圖2A為本發(fā)明野生株DE17、缺失株DE17ΔaroA和雙缺失株DE17ΔluxSΔaroA對 APEC黏附的影響；
[0018] 圖2B為本發(fā)明野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA對入 侵DF-I細胞的影響；
[0019] 圖3為本發(fā)明針對野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA 進行動物感染實驗；
[0020] 圖4為本發(fā)明對感染野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA的櫻桃谷鴨的肝臟、脾臟和腎臟做病理切片分析。
【具體實施方式】
[0021] 以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按 照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟 練人員所熟悉的意義相同。
[0022] 本發(fā)明中未標注的試劑和原料均為市場上購買所得。
[0023]實施例1禽致病性大腸桿菌IuxS和aroA缺失株的構建
[0024] 以禽致病性大腸桿菌DE17基因組為模板，以luxS-UF/luxS-UR為引物，進行IuxS基 因上游同源臂片段的擴增(775bp)，以luxS-DF/luxS-DR為引物，進行IuxS基因下游同源臂 片段的擴增（l〇23bp)。以aroA-UF/aroA-UR為引物，進行aroA基因上游同源臂片段的擴增 (886bp)，以aroA-DF/aroA-DR為引物，進行aroA基因下游同源臂片段的擴增(957bp)。
[0025] 分別將IuxS和aroA基因上、下游同源臂片段克隆至pUC19載體中，分別構建pUC19- luxS-up-down 和 pUC19-aroA_up-down 重組載體。
[0026]以pKD3質粒為模板，以pkD3-F/pkD3-R為引物，擴增氯霉素抗性基因（cat)，PCR產(chǎn) 物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收。將單酶切后的氯霉素抗性基因分別與PUC19-luxS-up-down和pUC19-aroA-up-down重組載體4°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉化入DH5a感受 態(tài)細胞，在氯霉素的LB固體培養(yǎng)基進行篩選，構建用于IuxS和aroA基因缺失的缺失載體 pUC19-luxS-up-cat_down和pUC19-aroA-up-cat_down〇
[0027]以質粒 pUC19-luxS-up-cat_down 和 pUC19_aroA-up-cat-down 為模板，分別以 luxS-UF/luxS-DR和aroA-UF/aroA-UR為引物，擴增含有同源臂的抗氯霉素片段，用于Red同 源重組反應。
[0028]將含有pKD46的DE17菌株在28°C條件下培養(yǎng)，在對數(shù)生長初期加入L-阿拉伯糖誘 導Red重組系統(tǒng)充分表達后，6000g，4°C離心5min，收集菌體。10 %甘油洗滌兩次，最后用 10%甘油重懸，分裝，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0029]將制備好的的含有pKD46的DE17感受態(tài)與帶同源臂的抗氯霉素 DNA片段預混，放入 點擊杯，進行電轉化后，加入LB培養(yǎng)基，在37°C搖床中復蘇lh，涂布于含氯霉素的LB固體平 板培養(yǎng)。
[0030] 挑取單菌落進行培養(yǎng)，分別使用引物luxS-inF/luxS-inR和11^3-〇1^?/111叉3- outR，&1'〇4-;[1^/&1'04-;[111?和&1'04-01^?/&1'04-01^1?進行？0?鑒定，篩選11^3和&1'04雙缺失 株，PCR鑒定結果表明，成功獲得禽致病性大腸桿菌DE17株的IuxS和aroA雙缺失株，并將該 缺失株命名為DE17 AaroA Δ IuxS(保藏號為CGMCC10601)。
[0031]表1缺失株構建及鑒定引物
[0033] 上述構建的缺失株DE17 Δ aroA Δ IuxS，已于2015年3月11日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），其保藏號為 CGMCCl0601。
[0034] 為了驗證本發(fā)明缺失株DE17 Δ aroA Δ IuxS對APEC的減毒作用，開展了IuxS和aroA 缺失株對櫻桃谷鴨半數(shù)致死量的檢測、對雞胚層纖維細胞DF-I的黏附和入侵檢測、在櫻桃 谷鴨體內肝臟、脾臟和血液的載菌量檢測、運動性檢測、部分毒力基因，轉錄水平檢測以及 對感染櫻桃谷鴨臟器(肝臟、腎臟、脾臟)的病變分析，上述研究結果表明，IuxS和aroA的缺 失導致APEC的毒力顯著降低。
[0035] 實施例2半數(shù)致死量(LD5q)的測定
[0036] 本實施例將野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和DE17 Δ aroA Δ IuxS培養(yǎng)到對數(shù)期， 收集菌體，無菌PBS洗滌三次，調整細菌數(shù)，倍比稀釋。每株細菌分五組，每組8只櫻桃谷鴨， 使每株細菌每組的細菌數(shù)分別為IO 7CFU/只，IO6CFU/只，IO5CFU/只，IO4CFU/只，IO 3CFU/只和 IO2CFU/只采用大腿肌肉注射，攻毒后觀察7日，記錄櫻桃谷鴨的死亡情況。數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用 Reed-Muench 法計算 LD50。
[0037] 檢測結果表明，DE17、缺失株DE17 Δ ar〇A和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A的LD5q分別 為1.2\1040?1]，3.8\10 50?1]&11(12.4\10(^71]。缺失了31(^后，與野生株相比，缺失株毒力 降低31.7倍，而雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A毒力降低了200倍，表明同時缺失aroA和IuxS基 因，可以顯著降低APEC的毒力。
[0038] 實施例3 aroA和IuxS缺失對APEC運動性的影響
[0039] 本實施例將野生株DE17，缺失株DE17 Δ aroA和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA培養(yǎng)到 對數(shù)期，用無菌PBS將細菌洗滌三次，并將OD6qq調到1.0。在運動性培養(yǎng)基中央，加入10μ1的 菌體，放于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。用游標卡尺記錄菌圈大小，進行比較分析。運動性分析結 果表明，單獨缺失aroA基因不會影響APEC的運動性，而同時缺失IuxS和aroA基因，能顯著降 低APEC的運動性(p〈0.05)，如圖1所示。
[0040] 實施例4 aroA和IuxS缺失對APEC黏附和入侵DF-I細胞的影響
[0041 ] 本實施例將野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA培養(yǎng)到 對數(shù)期，將處理好的細菌加入到鋪滿DF-I細胞的24孔細胞板中，陰性對照加入等體積的 DMEM，以感染復數(shù)200為加入感染細菌的量，于37°C培養(yǎng)箱中孵育1.5h，使細菌與細胞充分 作用后，無菌PBS洗5次。黏附組每孔加入0.5% Triton X-100 200μ1，室溫作用10min，用平 板計數(shù)法進行細菌計數(shù)。入侵組每孔加入1ml含有慶大霉素的DMEM，37°C培養(yǎng)箱中作用lh， 用0.5 % Triton Χ-100200μ1裂解細胞，平板計數(shù)法進行細菌計數(shù)。
[0042] 檢測結果表明，缺失aroA基因后，APEC對DF-1的黏附和入侵能力分別有25.8 %和 29.3%的降低(p〈0.05)，如圖2A所示，而同時缺失aroA和luxS，其對DF-I的入侵和黏附能力 分別有36.5%和42.5%的降低(p〈0.01)，如圖2B所示。
[0043]實施例5動物感染實驗
[0044] 本實施例將野生株DE17、缺失株DE17 Δ aroA和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ aroA培養(yǎng)到 對數(shù)期，收集菌體，每組細菌感染10只櫻桃谷鴨，每只攻毒劑量6X IO5CFU/只。感染24h后將 櫻桃谷鴨安樂死，無菌條件下分別取血液，肝臟和脾臟。血液直接用無菌PBS倍比稀釋，肝臟 和脾臟先稱重，再加入無菌PBS勻漿，倍比稀釋，均用平板計數(shù)法進行細菌計數(shù)。
[0045] 與野生株相比，DE17 Δ ar〇A和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A顯著降低了其在櫻桃谷 鴨體內的細菌載量。DE17在感染的櫻桃谷鴨肝和脾的細菌載菌量量分別為2.6 X IO5CFlVg 和4.2X IO5CFlVg，在血液中為1.7 X 105CFU/ml ;DE17 Δ ar〇A感染的櫻桃谷鴨肝和脾細菌載 菌量分別為3 · 5 X IO2和4 · 3 X IO2CFlVg，在血液中為1 · 0 X IO2CFlVml;而DE17 Δ IuxS Δ aroA 感染的櫻桃谷鴨肝中沒有分離到細菌，脾細菌載菌量為5.OX IO1CFlVg,雙缺失株的脾臟和 血液中細菌載量比野生株分別減少8400倍和11333倍，如圖3所示。
[0046] 結果表明，進行雙基因缺失可以顯著降低細菌在感染宿主體內的增殖能力。
[0047]實施例6 aroA和IuxS缺失對感染動物臟器組織病理切片分析
[0048] 本實施例分別對分別感染野生株DE17、缺失株DE17 Δ ar〇A和雙缺失株DE17 Δ IuxS Δ ar〇A的櫻桃谷鴨的肝臟、脾臟和腎臟做病理切片分析。
[0049] 結果表明，DE17 Δ IuxS AaroA基本不造成感染櫻桃谷鴨上述臟器的病理損傷，如 圖4所示。
[0050]實施例7 aroA和IuxS缺失株的免疫原性評價
[00511本實施例為了評價aroA和IuxS缺失株的免疫原性，將50只7日齡的櫻桃谷鴨分成5 組，每組10只，其中4組分別免疫DE17、DE17 Δ aroA、DE17 Δ IuxS和DE17 Δ IuxS Δ aroA，第5組 對照組免疫佐劑作為空白對照。免疫2周后，用IO9個CFU的DE17菌株進行攻毒，觀察各組的 存活與死亡數(shù)，對各免疫菌株的免疫原性進行評價。
[0052] 結果表明，未免疫的對照組全部死亡，用DE17A IuxS AaroA菌株進行免疫的保護 率為80%，其他菌株保率率均為70%，表明本發(fā)明構建的禽致病性大腸桿菌菌株具有良好 的免疫原性。
[0053]本發(fā)明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本 領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所述改進也落 入所附權利要求書的范圍之內。
【主權項】
1. 一株禽致病性大腸桿菌菌株，為禽致病性大腸桿菌luxS和aroA缺失株，其保藏號為 CGMCC10601。2. 權利要求1所述禽致病性大腸桿菌菌株在制備疫苗中的應用。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，所述的疫苗為禽致病性大腸桿菌滅活、弱毒疫苗和菌蛻 疫苗。4. 一種包含權利要求1所述菌株的禽致病性大腸桿菌疫苗。5. 根據(jù)權利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗為禽致病性大腸桿菌滅活、弱 毒疫苗和菌蛻疫苗。
【文檔編號】C12R1/19GK105861404SQ201610254852
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】韓先干, 于圣青, 王少輝, 楊立軍, 陳兆國, 黃燕, 米榮升, 賈海燕
【申請人】中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所