一種稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法，該方法利用多起點(diǎn)培養(yǎng)技術(shù)，以及氣生菌絲產(chǎn)孢技術(shù)，快速培養(yǎng)制備稻瘟病菌分生孢子。該方法實(shí)施步驟如下：1)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備；2)多起點(diǎn)移植菌體的配備；3)將多起點(diǎn)移植菌體植入培養(yǎng)平板；4)孢子制備培養(yǎng)；5)孢子的洗脫分離。本發(fā)明的特色與優(yōu)點(diǎn)是：1)快速高效，通常培養(yǎng)5天后新一代孢子能達(dá)到高產(chǎn)孢量的理想狀態(tài)；2)制備培養(yǎng)全程能保持無(wú)菌操作，成品孢子液的污染機(jī)率大幅降低；3)操作技術(shù)簡(jiǎn)單，結(jié)果產(chǎn)孢量大。
【專利說(shuō)明】
一種稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)和微生物學(xué)技術(shù)。具體是一種稻痕病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]植物病原真菌的繁殖體除了具有繁殖擴(kuò)大自身種群數(shù)量的基本作用外，更重要的是擁有與寄主互作識(shí)別，并發(fā)動(dòng)侵染寄主的功能，因此在大多數(shù)植物病害的研究過(guò)程中，都需要使用病原菌的繁殖體作試驗(yàn)材料，顯而易見(jiàn)，高效便捷的繁殖體材料的培養(yǎng)制備方法，將非常有利于研究工作的高效開(kāi)展。稻瘟病是我國(guó)水稻生產(chǎn)的一種重大病害，該病害的病原菌(Magnaporthe grisea)的繁殖體包括有性態(tài)的子囊孢子、和無(wú)性態(tài)的分生孢子二種類型。目前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制備有性孢子存在較大的技術(shù)難度，因此，至今的有關(guān)研究所用的繁殖體主要是使用該病菌的分生孢子。
[0003]稻痕病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法可歸結(jié)為二大類。
[0004]—類是采用植物籽粒作培養(yǎng)基的培養(yǎng)法，即先將植物籽粒(如大麥粒等)浸潤(rùn)并滅菌制成培養(yǎng)基，然后將菌絲體移植入籽粒培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)菌絲長(zhǎng)滿籽粒后，用水洗刷掉籽粒表面菌絲，并轉(zhuǎn)放到方盤類器具內(nèi)再進(jìn)行光照培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程一般需要18天以上。該方法通常能制備大量的分生孢子，不過(guò)，培養(yǎng)制備全程時(shí)間較長(zhǎng)，成品孢子液難以避免雜菌污染，而且存在較多的培養(yǎng)基雜質(zhì)。
[0005]另一類是采用凝固劑瓊脂制成培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)法，即先將有關(guān)養(yǎng)分(如燕麥汁)與瓊脂制成固體培養(yǎng)基并倒成平板，然后將少許菌絲體塊移植入培養(yǎng)基平板中間培養(yǎng)，當(dāng)平板上長(zhǎng)滿菌絲后，用工具刮除平板表面氣生菌絲，并轉(zhuǎn)到光照條件下再培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程一般需要10?13天以上。該方法能克服前述方法的一些不足，如獲得的成品孢子液雜質(zhì)少，且容易避免雜菌污染。但該方法耗費(fèi)時(shí)間仍有過(guò)長(zhǎng)之嫌;且長(zhǎng)時(shí)間的平板培養(yǎng)仍然存在較高的雜菌污染機(jī)率;在培養(yǎng)中途需要刮去氣生菌絲的技術(shù)操作，以及需要提供光照等技術(shù)支持，實(shí)踐應(yīng)用仍然不方便。因而技術(shù)上仍有改進(jìn)提高的空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法。
[0007]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下:
[0008]—種稻瘟病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法，主要是應(yīng)用多起點(diǎn)培養(yǎng)技術(shù)，以及氣生菌絲產(chǎn)孢技術(shù)，快速培養(yǎng)制備稻瘟病菌分生孢子，培養(yǎng)制備方法的步驟如下:
[0009]1.產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備:按常規(guī)方法制備產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:燕麥167g，瓊脂20g，水1000ml;常規(guī)高溫滅菌，倒入9cm培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)平板。
[0010]2.多起點(diǎn)移植菌體的配備:在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水洗滌常規(guī)備存的稻瘟病菌菌落，得到孢子-菌絲碎混合液，用該混合液作為制備新一代分生孢子的多起點(diǎn)移植菌體。
[0011 ] 3.將多起點(diǎn)移植菌體植入培養(yǎng)平板:用微量移液器將步驟2配備的多起點(diǎn)移植菌體移植入步驟I制備的培養(yǎng)平板，并使菌體液在平板面上分散均勻。
[0012]4.孢子制備培養(yǎng):將步驟3操作完備后的制備培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)入溫度為28°C、相對(duì)濕度為90 %的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)。
[0013]5.孢子的洗脫分離:通常步驟4培養(yǎng)5天后，新一代分生孢子達(dá)到高產(chǎn)孢量的狀態(tài)；用無(wú)菌水將平板上孢子洗脫，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得較純凈的稻瘟病菌分生孢子液。
[0014]本發(fā)明的特色與優(yōu)點(diǎn)是:
[0015]I)快速高效，通常培養(yǎng)5天后新一代孢子能達(dá)到高產(chǎn)孢量的理想狀態(tài)。
[0016]2)制備培養(yǎng)全程能保持無(wú)菌操作，成品孢子液的污染機(jī)率大幅降低。
[0017]3)操作技術(shù)簡(jiǎn)單，結(jié)果產(chǎn)孢量大。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是本發(fā)明將多起點(diǎn)移植菌體植入培養(yǎng)平板并培養(yǎng)2天后的稻瘟病菌菌落。
[0019]圖2是本發(fā)明將多起點(diǎn)移植菌體植入培養(yǎng)平板并培養(yǎng)5天后的稻瘟病菌菌落。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0021]本發(fā)明所述的產(chǎn)孢培養(yǎng)基是應(yīng)用燕麥作主要成分的培養(yǎng)基，其組分為:燕麥167g，瓊脂20g，水1000ml;組分燕麥為水煮開(kāi)180分鐘后取汁用;培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)常規(guī)高壓高溫滅菌后備用。
[0022]本發(fā)明所述的多起點(diǎn)移植菌體是指洗滌常規(guī)備存的平板菌落所獲得的分生孢子與菌絲碎的混合液，該混合液中孢子占大多數(shù)，將該混合液移植到培養(yǎng)平板并均勻分散于平板面上，每一個(gè)孢子或菌絲片段都可以萌發(fā)生長(zhǎng)，因而可以在培養(yǎng)平板上形成大量的生長(zhǎng)起點(diǎn)，因此，本發(fā)明將這種移植方式的菌體液稱為多起點(diǎn)移植菌體。大量的生長(zhǎng)起點(diǎn)同時(shí)生長(zhǎng)，就能在培養(yǎng)平板上快速形成均勻的菌落。
[0023]相對(duì)而言，常規(guī)的移植菌體為一菌絲塊，盡管該菌絲塊可能含有較多的菌絲片段，但在培養(yǎng)平板面上，病菌是以該菌絲塊為中心向四周空白培養(yǎng)基輻射生長(zhǎng)，實(shí)際相當(dāng)于只有單一個(gè)生長(zhǎng)起點(diǎn)。
[0024]多起點(diǎn)移植菌體液內(nèi)的孢子和菌絲量一般無(wú)需準(zhǔn)確定量，取一個(gè)9cm培養(yǎng)皿的正常菌落加水1ml洗滌獲得的菌體液，取其20?50μ1作移植菌體，能滿足正常制備培養(yǎng)新一代孢子用的菌體量要求。
[0025]發(fā)明人觀察發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)孢培養(yǎng)過(guò)程中，新一代分生孢子形成于菌落表面的氣生菌絲上，刮除菌落表面菌絲的技術(shù)操作并不能增加產(chǎn)孢量，反而降低產(chǎn)孢量；同樣進(jìn)行光照處理也不能增加產(chǎn)孢量，反而降低產(chǎn)孢量，因而在技術(shù)操作上，本發(fā)明無(wú)需按常規(guī)實(shí)施刮除菌落表面菌絲，也無(wú)需增加光照條件。
[0026]產(chǎn)孢培養(yǎng)環(huán)境的相對(duì)濕度應(yīng)維持在90%左右，過(guò)低的濕度不利于菌落產(chǎn)孢，也容易導(dǎo)致培養(yǎng)基干燥，實(shí)際工作中若利用沒(méi)有控濕條件的培養(yǎng)箱，可在箱內(nèi)放置干凈的濕毛巾增加濕度；但不宜將濕度提高至近于飽和濕度，因?yàn)榘l(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在近于飽和濕度條件下，該培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)孢效能反而下降。
[0027]通常產(chǎn)孢制備培養(yǎng)2天后可見(jiàn)明顯的菌落并形成氣生菌絲，如圖1所示，培養(yǎng)3天后就能產(chǎn)生新一代孢子，培養(yǎng)5天后菌落表面已形成密集的氣生菌絲，并且新一代孢子達(dá)到高產(chǎn)孢量的理想狀態(tài)，如圖2所示;另外，此高產(chǎn)孢量狀態(tài)能維持至培養(yǎng)11天后。
[0028]在制備培養(yǎng)結(jié)果的新一代孢子洗脫操作中，若用毛刷類工具刷洗會(huì)產(chǎn)生大量的菌絲片段混雜于孢子液中，而用光滑玻棒刷洗獲得的孢子液，其中混雜的菌絲片段較少。
[0029]實(shí)施例1
[0030]應(yīng)用本發(fā)明一種稻瘟病菌孢子的培養(yǎng)制備方法，培養(yǎng)制備稻瘟病菌菌株Mg2013_l的分生孢子，按如下步驟實(shí)施操作:
[0031]1.產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備
[0032]按常規(guī)方法制備產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:燕麥167g，瓊脂20g，水1000ml;常規(guī)高溫滅菌，倒入9cm培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)平板。
[0033]2.多起點(diǎn)移植菌體的配備
[0034]在無(wú)菌條件下，用1ml無(wú)菌水洗滌常規(guī)備存的稻瘟病菌菌株Mg2013-1的菌落一皿，得到孢子-菌絲碎混合液，用該混合液作為制備新一代分生孢子的多起點(diǎn)移植菌體。
[0035]3.將多起點(diǎn)移植菌體植入培養(yǎng)平板
[0036]用微量移液器取步驟2配備的多起點(diǎn)移植菌體40μ1移植入步驟I制備的培養(yǎng)平板，用T形玻棒在平板面上輕輕涂抹，使菌體液在平板面上分散均勻。
[0037]4.孢子制備培養(yǎng):將步驟3操作完備后的制備培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)入溫度為28°C、相對(duì)濕度為90 %的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)。
[0038]5.孢子的洗脫分離:步驟4培養(yǎng)5天后，新一代分生孢子達(dá)到高產(chǎn)孢量的狀態(tài);取無(wú)菌水15ml將一皿培養(yǎng)平板的新一代孢子洗脫，所獲得的分生孢子液，孢子濃度可達(dá)1.48X16 個(gè)/ml。
[0039]實(shí)施例2
[0040]應(yīng)用本發(fā)明一種稻瘟病菌孢子的培養(yǎng)制備方法，培養(yǎng)制備稻瘟病菌菌株Mg2015_7的分生孢子，按實(shí)施例1的步驟I至步驟5操作實(shí)施，只是步驟2的菌株是Mg2015-7;結(jié)果用無(wú)菌水15ml洗脫一皿培養(yǎng)平板所獲得的新一代分生孢子液，孢子濃度可達(dá)1.20 X 16個(gè)/ml。[0041 ] 實(shí)施例3
[0042]應(yīng)用本發(fā)明一種稻瘟病菌孢子的培養(yǎng)制備方法，培養(yǎng)制備稻瘟病菌菌株Mg2015_
14的分生孢子，按實(shí)施例1的步驟I至步驟5操作實(shí)施，只是步驟2的菌株是Mg2015-14;結(jié)果用無(wú)菌水15ml洗脫一皿培養(yǎng)平板所所獲得的新一代分生孢子液，孢子濃度可達(dá)1.38 X 16個(gè)/ml。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種稻痕病菌分生孢子的培養(yǎng)制備方法，其特征在于，利用多起點(diǎn)培養(yǎng)技術(shù)，以及氣生菌絲產(chǎn)孢技術(shù)，快速培養(yǎng)制備稻瘟病菌分生孢子;方法的步驟如下: .1)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的制備:按常規(guī)方法制備產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組成為:燕麥167g，瓊月旨20g，水100ml;常規(guī)高溫滅菌，倒入9cm培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)平板； .2)多起點(diǎn)移植菌體的配備:在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水洗滌常規(guī)備存的稻瘟病菌菌落，得到孢子-菌絲碎混合液，用該混合液作為制備新一代分生孢子的多起點(diǎn)移植菌體；. 3)將多起點(diǎn)移植菌體植入培養(yǎng)平板:用微量移液器將步驟2)配備的多起點(diǎn)移植菌體移植入步驟I)制備的培養(yǎng)平板，并使菌體液在平板面上分散均勻；. 4)孢子制備培養(yǎng):將步驟3)操作完備后的制備培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)入溫度為28°C、相對(duì)濕度為90 %的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)；. 5)孢子的洗脫分離:通常步驟4)培養(yǎng)5天后，新一代分生孢子達(dá)到高產(chǎn)孢量的狀態(tài)；用無(wú)菌水將平板上孢子洗脫，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得較純凈的稻瘟病菌分生孢子液。
【文檔編號(hào)】C12N3/00GK105861412SQ201610345467
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】張君成, 王忠文, 曾東強(qiáng), 李界秋, 熊英, 時(shí)婷婷
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)