驅(qū)動(dòng)直鏈淀粉合成酶基因gbssi-3在香蕉果實(shí)中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【專利摘要】驅(qū)動(dòng)直鏈淀粉合成酶基因GBSSI?3在香蕉果實(shí)中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。該啟動(dòng)子能夠引導(dǎo)直鏈淀粉合成酶基因GBSSI?3在果實(shí)中特異性表達(dá)，而在根、莖和葉片中不表達(dá)，針對(duì)GBSSI?3啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及功能研究，明確此啟動(dòng)子部分功能和驅(qū)動(dòng)活性，為香蕉GBSSI?3基因啟動(dòng)子序列研究提供理論依據(jù)；同時(shí)為組織特異性啟動(dòng)子的開發(fā)和應(yīng)用，為用基因工程手段提高香蕉果實(shí)直鏈淀粉含量，改良直鏈淀粉品質(zhì)提供了候選果實(shí)特異性啟動(dòng)子；為明晰整個(gè)淀粉合成及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，為滿足人們對(duì)直/支鏈不同比例淀粉多樣化需求提供了候選果實(shí)特異性啟動(dòng)子。
【專利說明】
驅(qū)動(dòng)直鏈淀粉合成酶基因 GBSSI-3在香蕉果實(shí)中特異表達(dá)的 啟動(dòng)子及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種驅(qū)動(dòng)直鏈淀粉合成酶基因 GBSSI-3在香蕉果實(shí)中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 香蕉是熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物，是僅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉 作為香蕉果實(shí)中的主要組成成分，又促使其被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定為僅次于水稻、小 麥、玉米之后的第四大糧食作物，是超過4億人的口糧(Englberger et al. ,2006)。然而，隨 著香蕉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和人們生活水平的迅速提高，對(duì)香蕉果實(shí)品質(zhì)的要求也越來越高。 將現(xiàn)代生物技術(shù)運(yùn)用于香蕉品質(zhì)改良中，可以解決一些用常規(guī)方法難以解決的問題。近年 來，香蕉生物技術(shù)取得了很大的發(fā)展，一些控制重要農(nóng)藝性狀基因的相繼分離并在香蕉中 遺傳轉(zhuǎn)化成功（Sreedharan et al.，2013;Rustagi et al.，2015;Tripathi et al. ,2015; Elitzur et al.，2016)為用基因工程技術(shù)來改良香蕉果實(shí)品質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0003] 目前，我國(guó)香蕉優(yōu)質(zhì)果率不足30%，大多數(shù)香蕉果實(shí)后熟過程中出現(xiàn)硬心、糯性 差、糖分含量偏低、抗性淀粉含量不穩(wěn)定等品質(zhì)問題。直鏈淀粉是香蕉果實(shí)的主要成分之 一，它的含量直接決定著果實(shí)糯性、甜味及抗性淀粉含量等品質(zhì)。直鏈淀粉合成酶基因 (GBSS)編碼結(jié)合在淀粉顆粒上的淀粉合成酶，又稱為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶，是影響直鏈 淀粉合成的一個(gè)關(guān)鍵酶基因。前期研究發(fā)現(xiàn)GBSSI-3基因只在香蕉果實(shí)中高效表達(dá)，因此它 是專一性表達(dá)的基因 （Miao et al·，2014)。
[0004] 植物基因工程中常用組成型啟動(dòng)子（如35S)來調(diào)控外源基因的表達(dá)，但存在一些 缺點(diǎn)，如:35S啟動(dòng)子能促使外源基因在雙子葉植物中獲得較高的表達(dá)，但在單子葉植物中 驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)能力不強(qiáng);35S驅(qū)動(dòng)的表達(dá)無明顯的組織和器官專一性，產(chǎn)生大量異源表達(dá)產(chǎn) 物甚至有毒物質(zhì)，導(dǎo)致植物代謝失衡影響其正常生長(zhǎng)發(fā)育甚至死亡。應(yīng)用組織特異性啟動(dòng) 子則可以避免這種影響。
[0005]因此，希望從香蕉直鏈淀粉合成酶基因中分離出能在香蕉果實(shí)中專一表達(dá)的啟動(dòng) 子和表達(dá)調(diào)控元件，從而能在單子葉植物、特別是包括香蕉在內(nèi)的淀粉轉(zhuǎn)化型作物中驅(qū)動(dòng) 外源基因表達(dá)，從而提高作物產(chǎn)量，改善淀粉品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種驅(qū)動(dòng)直鏈淀粉合成酶基因 GBSSI-3在香蕉果實(shí)中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 其中，該啟動(dòng)子能夠引導(dǎo)直鏈淀粉合成酶基因 GBSSI-3在果實(shí)中特異性表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種重組載體，其為含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的啟 動(dòng)子的載體。
[0010] 其中，所述載體為載體或病毒載體。
[0011] 優(yōu)選地，所述重組載體為利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)將權(quán)利要求1所 述的啟動(dòng)子替換到pVKH-35S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子處得到的表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的啟動(dòng)子，或者本發(fā)明第二 個(gè)方面所述的重組載體在提高香蕉果實(shí)直鏈淀粉含量中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的啟動(dòng)子的獲得方法，其 特征在于，以巴西蕉基因組DNA為模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸為引物， 通過PCR方法擴(kuò)增獲得。
[0014]本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO. 3所示。
[0015] 本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的啟動(dòng)子的應(yīng)用方法，其 特征在于，用含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)化香蕉果實(shí)薄片。
[0016] 本發(fā)明的啟動(dòng)子(GBSSI-3啟動(dòng)子)能驅(qū)動(dòng)目的基因在果實(shí)中高效表達(dá)，而在根、莖 和葉片中不表達(dá)，針對(duì)GBSSI-3啟動(dòng)子進(jìn)行克隆及功能研究，明確此啟動(dòng)子部分功能和驅(qū)動(dòng) 活性，為香蕉GBSSI-3基因啟動(dòng)子序列研究提供理論依據(jù)；同時(shí)為組織特異性啟動(dòng)子的開發(fā) 和應(yīng)用，為用基因工程手段提高香蕉果實(shí)直鏈淀粉含量，改良直鏈淀粉品質(zhì)提供了候選果 實(shí)特異性啟動(dòng)子;為明晰整個(gè)淀粉合成及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論依據(jù)，為滿足人們對(duì)直/支鏈不 同比例淀粉多樣化需求提供了候選果實(shí)特異性啟動(dòng)子。
【附圖說明】
[0017] 圖1為GBSSI-3啟動(dòng)子擴(kuò)增電泳結(jié)果圖：M為DL2000DNA Marker，泳道A為GBSSI-3啟 動(dòng)子PCR產(chǎn)物。
[0018] 圖2為PVKH-GBSSI-3雙酶切驗(yàn)證電泳結(jié)果圖：M為DL2000DNA Marker，泳道A為大片 段為酶切后PVKH(1075bp片段為GBSSI-3啟動(dòng)子），泳道B為pVKH-GBSSI-3重組質(zhì)粒，泳道C為 GBSSI-3啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物。
[0019]圖3為轉(zhuǎn)化后香蕉不同組織GUS染色:Contol為陰性對(duì)照（水)轉(zhuǎn)化后不同組織⑶S 染色，353::(；1^為陽性對(duì)照(？￥101-353-61]3-?六)轉(zhuǎn)化后不同組織(；1]3染色，68331-3 ::61^為 pVKH-GBSSI-3轉(zhuǎn)化后不同組織⑶S染色。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，以更好地理解本發(fā) 明。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按 照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn) 品。
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種驅(qū)動(dòng)直鏈淀粉合成酶基因 GBSSI-3在香蕉果實(shí)中特異表 達(dá)的啟動(dòng)子(GBSSI-3啟動(dòng)子），它是以巴西蕉基因組DNA為模板，以
[0022] 5'-ACTGTTCACTTCTTCCACTGCCA-3'，
[0023] 5'-GTCCATCCCATTTACTATTCCAG-3'，
[0024]為引物，通過PCR方法擴(kuò)增獲得的一種含有堿基序列為1075bp(圖1)的香蕉GBSSI- 3基因啟動(dòng)子序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0025]本具體實(shí)施采用常規(guī)PCR方法克隆1075bp香蕉果實(shí)特異表達(dá)的直鏈淀粉合成酶基 因 GBSSI-3啟動(dòng)子序列，通過PlantCare軟件對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其除具有典型啟動(dòng)子基本 順式作用元件之外，還有ABA響應(yīng)順式作用元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、光 響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)MYB應(yīng)答元件、光誘導(dǎo)MYB應(yīng)答元件、胚乳表達(dá)響應(yīng)元件等其他調(diào)控元件 (見表1)。
[0026] 表1GBSSI-3基因啟動(dòng)子元件分析

[0029] 將上述GBSSI-3啟動(dòng)子序列，利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)將其替換到 pVKH-35S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子處，即得含有GBSSI-3啟動(dòng)子的表達(dá)載體pVKH-GBSSI-3。用表達(dá)載體pVKH-GBSSI-3通過基因槍轉(zhuǎn)化至香蕉根、莖、葉、果實(shí)薄片。具體操作 為：
[0030] 重組載體構(gòu)建：以pVKH-35S-GUS-pA為載體，構(gòu)建以GBSSI-3啟動(dòng)子1075bp序列為 驅(qū)動(dòng)啟動(dòng)子，以GUS基因?yàn)閳?bào)告基因，以潮霉素為篩選，在其兩端加上Sac I和BamM酶切位 點(diǎn)設(shè)計(jì)5 '和3 '端引物。通過PCR方法擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，回收PCR產(chǎn)物，用Sac I和BamHI雙酶切 該產(chǎn)物和表達(dá)載體PVKH，將酶切獲得的目的片段和載體大片段用T4DNA連接酶16°C連接過 夜，轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證正確后，即為pVKH-GBSSI-3重組載體(見圖2)。
[0031] 基因槍轉(zhuǎn)化:利用基因槍將水（陰性對(duì)照）、PVKH-35S-GUS-ρΑ (陽性對(duì)照）、PPVKH-GBSSI-3質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入根、莖、葉、果實(shí)受體細(xì)胞，24~72h后觀察該重組載體中GUS基因 的瞬時(shí)表達(dá)情況，其具體實(shí)驗(yàn)方法步驟如下：
[0032] (1)受體材料預(yù)處理:在基因槍轟擊前先將外植體轉(zhuǎn)入含滲透劑(0.2mol/L甘露醇 和0.2mo I /L山梨醇）的MS培養(yǎng)基預(yù)處理4-6h。
[0033] (2)微彈載體制備:稱取60mg Miq鎢粉(Bio-Rad)置1.5mL離心管中；加入ImL 70% 的酒精，充分禍旋，然后靜置15min，1500rpm離心5min;小心去除上清液，加入ImL無菌水，充 分禍旋，1500rpm離心5min，去上清液，用無菌水重復(fù)沖洗三次;將金屬顆粒轉(zhuǎn)入ImL無菌水 的50%甘油中；取50yL上述制備好并已禍旋的金屬顆粒轉(zhuǎn)入一無菌的1.5mL離心管中，按順 序加入5yL DNA(lygAxL)、50yL 2.5mol/L CaCl2和20yL 0.1mol/L亞精胺(現(xiàn)配現(xiàn)用）；將混 合物渦旋IOmin，然后用15000rpm離心5s，去除上清液；用HOyL 70 %乙醇沖洗上述沉淀物 一次，再用100 %乙醇沖洗一次，最后用48yL100 %乙醇重新懸浮顆粒，并將離心管浸入超聲 波清洗器中3s，以分散金屬顆粒。
[0034] (3)裝彈:將基因槍放置于一個(gè)較大型的超凈工作臺(tái)上，以利于無菌操作。用70% 乙醇擦凈真空室，用浸泡消毒法將可裂圓片、微粒子彈載體、阻擋網(wǎng)于70%酒精中消毒 15min，然后用無菌濾紙吸干或吹干殘余酒精;打開電源開關(guān)、真空栗及氦氣瓶閥；將可裂圓 片裝入固定蓋，旋緊；取6yL包被DNA的金屬顆粒無水乙醇懸浮液（約含0.6yg質(zhì)粒DNA和 0.37mg的金屬顆粒）點(diǎn)于微粒子彈載體中心，立即在干燥器中干燥，或于工作臺(tái)上吹干;將 載有微粒子彈的微粒子彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微粒子彈發(fā)射裝置中；將欲轉(zhuǎn)化的靶組織平鋪 在一個(gè)由液體培養(yǎng)基潤(rùn)濕過的1 -2層濾紙或含有固體培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中心。
[0035] (4)轟擊:按VAC鍵，當(dāng)真空度達(dá)到所需要值(600-760mmHg，ImmHg= 133 · 332Pa)時(shí)， 將VAC鍵轉(zhuǎn)到HOLD位置;按FIRE鍵使氦氣壓力達(dá)到適當(dāng)位置，約花費(fèi)12s打一槍，再按VENT 鍵，取出樣品，通常每四槍打二次。
[0036] (5)外植體材料培養(yǎng):將轟擊后的外植體轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基或芽分化培養(yǎng) 基中于28°C、黑暗條件下培養(yǎng)。該培養(yǎng)基中不添加卡那霉素等選擇壓力，以利于受轟擊細(xì)胞 的恢復(fù)及充分表達(dá)外源基因。
[0037] GUS染色方法:將上述材料黑暗放置48h后，將其浸泡在染色液(50mmol/L磷酸鈉緩 沖液（PH7.0)中含有：0.1mol/L K3[Fe(CN)6]，0.1mol/L K4[Fe(CN)6]，10mmol/L Na2EDTA, 0 · 001 % (v/v)Triton X-100，20% 甲醇，0 · 5mg/mL X-Gluc)中，于25-37°C保溫Ih至過夜；然 后將外植體材料轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色2~3次，至陰性對(duì)照材料呈白色；于顯微鏡下觀察靶 啟動(dòng)子所調(diào)控的GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，染色部位在果實(shí)中， 而根、莖、葉中沒有，說明GUSSI-3基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因香蕉中能夠引導(dǎo)外源基因在果實(shí)中 特異表達(dá)，由此可見，本發(fā)明的GUSSI-3基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源基因特異性表達(dá)，從而提 高作物產(chǎn)量，改善淀粉品質(zhì)。
[0038]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種啟動(dòng)子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于，該啟動(dòng)子能夠引導(dǎo)直鏈淀粉合成酶基因 GBSSI-3在果實(shí)中特異性表達(dá)。3. -種重組載體，其特征在于，其為含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述載體為載體或病毒載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，其為利用Sac I和BamHI兩個(gè)限制性酶 切位點(diǎn)將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子替換到pVKH-35S-GUS-pA表達(dá)載體的CaMV35S啟動(dòng)子處得 到的表達(dá)載體。6. 如權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子，或者權(quán)利要求3-5中任意一項(xiàng)所述的重組載體在提 高香蕉果實(shí)直鏈淀粉含量中的應(yīng)用。7. -種權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的獲得方法，其特征在于，以巴西蕉基因組DNA為模板， 以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸為引物，通過PCR方法擴(kuò)增獲得。8. -種引物對(duì)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。9. 一種如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的應(yīng)用方法，其特征在于，用含有權(quán)利要求1所述的 啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)化香蕉果實(shí)薄片。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK105861510SQ201610477933
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月27日
【發(fā)明人】苗紅霞, 孫佩光, 金志強(qiáng), 徐碧玉, 張建斌, 劉菊華, 賈彩紅, 王卓, 王靜毅
【申請(qǐng)人】中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所