Gitelman綜合征新的突變致病基因SLC12A3、及其編碼蛋白和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及Gitelman綜合征新的突變致病基因SLC12A3、及其編碼蛋白和應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)對(duì)近期收治的一個(gè)GS患者及其家屬進(jìn)行了基因篩查和隨訪(fǎng)，鑒定得到突變SLC12A3基因，同野生型SLC12A3基因序列相比，該突變序列中第8外顯子存在1個(gè)插入缺失框移突變。該突變的SLC12A3編碼蛋白與野生型SLC12A3蛋白相比，自第332位密碼子開(kāi)始出現(xiàn)框架移碼。本發(fā)明能夠?yàn)镚itelman綜合征的基因診斷提供一個(gè)新的位點(diǎn)，豐富了該病相關(guān)突變位點(diǎn)的資源庫(kù)，為之后的患者診斷提供了更多依據(jù)?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)Gitelman綜合征患者SLC12A3基因序列來(lái)對(duì)其疾病進(jìn)行診斷和分型，也能夠?yàn)樘哼M(jìn)行合理的產(chǎn)前診斷，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育篩查的目的。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
6^6 1(^11綜合征新的突變致病基因31_012八3、及其編碼蛋白和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種Gitelman綜合征新的突變致病基因 SLC12A3、及其編碼蛋白和應(yīng) 用，屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] Gite Iman 綜合征（Gite Imansyndrome，GS，0MIM263800)是常見(jiàn)的遺傳型低鉀血癥 的病因之一，其全球發(fā)病率約25/1，000，000，而在亞洲人群中發(fā)病率更高，有研究發(fā)現(xiàn)日本 的發(fā)病率可達(dá)到10.3/10000[可參見(jiàn)A new familial disorder characterized by hypokalemia and hypomagnesemia[J].Trans Assoc Am Physicians,1966,79:221-235. 以及Four novel mutations in the thiazide-sensitive Na-Cl contransporter gene in Japanese patients with Gitlema's syndrome[J].Nephrol Dial Transplant,2004, 19(7): 1761-1766.]。其主要臨床表現(xiàn)包括低血鉀、代謝性堿中毒、低血鎂、低血鈣而血壓正 常。該病主要是由SLC12A3基因突變所致，該基因位于染色體16ql3,由26個(gè)外顯子組成，可 編碼一種噻嗪類(lèi)敏感的Na+/Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+/Cl-cotransporter，NCCT)。至今為止，在GS 患者中共發(fā)現(xiàn)了443種SLC12A3基因突變，有趣的是，盡管該疾病被認(rèn)為是隱性遺傳，但是僅 18 %的GS患者為純合突變，約45 %為復(fù)合雜合突變，而高達(dá)30 %的患者為單純雜合突變[可 參見(jiàn)Molecular physiology and pathophysiology of electroneutral cation-chloride cotransporter[J] .Physiol Rev，2005,85(2) :423-493.]。此外，GS還具有高度 的遺傳異質(zhì)性，但是目前人們?cè)谄渫蛔冾?lèi)型和疾病的嚴(yán)重程度之間尚未發(fā)現(xiàn)任何相關(guān)性。 GS患者的表型具有多樣性，部分可僅表現(xiàn)為乏力等癥狀，因此容易被忽略或誤診。目前，對(duì) 于該病的發(fā)病機(jī)制和病因仍有待進(jìn)一步探索，從本質(zhì)上揭示GS的病因和發(fā)病機(jī)制對(duì)于GS的 治療至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明主要目的在于，通過(guò)對(duì)近期收治的一個(gè)GS患者及其 家屬進(jìn)行了基因篩查和隨訪(fǎng)：1.鑒定Gi telman綜合征的致病基因 SLC12A3，定位出該疾病的 新型致病位點(diǎn)以及突變情況。2.提供該致病基因及其編碼蛋白質(zhì)，包含該突變基因的表達(dá) 載體、表達(dá)宿主細(xì)胞。3.開(kāi)發(fā)針對(duì)該突變基因的Gi tl eman綜合征快速基因診斷試劑盒，包括 突變基因診斷引物、突變蛋白診斷抗體等試劑盒成分。4.通過(guò)對(duì)該患者的臨床隨訪(fǎng)，提供疾 病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步診斷該病提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)。本發(fā)明能夠?yàn)殛U明Gi te Iman綜合征的 致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，為Gitelman綜合征的治療提供新的藥物作用祀點(diǎn)。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人對(duì)近期收治的一個(gè)GS患者及其家屬進(jìn)行了基因篩查和 隨訪(fǎng)，鑒定得到了一個(gè)新的致病位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于SLC12A3基因，所述突變序列如SEQ ID No.l所示。同野生型SLC12A3基因序列（SEQ ID如.2)相比，該突變序列中第8外顯子存在1 個(gè)插入缺失框移突變，為g.7549_7554delCGGAC and g.7561_7562delGT and g.7571insT and g.7626_7627delCT,c.965-l_969delCGGAC and c.976-977delGT and c.987insT and C.1041-1042delCT。該突變可導(dǎo)致SLC12A3基因編碼的蛋白產(chǎn)物發(fā)生框架移碼突變，突變蛋 白可導(dǎo)致患者出現(xiàn)GS的相關(guān)癥狀。而且該突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變，在既往的國(guó)內(nèi)外研究中均 未被報(bào)道過(guò)。
[0005] 根據(jù)該突變基因序列，本發(fā)明人在體外完成了該突變基因人工表達(dá)載體的構(gòu)建， 得到了該突變基因的表達(dá)產(chǎn)物。發(fā)生上述突變的NCC蛋白（SEQ ID No. 3)是上述突變基因 (SEQ ID No. 1)的編碼產(chǎn)物。與野生型NCC蛋白（SEQ ID No.4)相比，這種突變可導(dǎo)致NCC蛋 白自第332位密碼子開(kāi)始出現(xiàn)框架移碼，這種新突變位于NCC蛋白的氨基端，可產(chǎn)生大量翻 譯錯(cuò)誤的密碼子，并可導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)在NCC氨基酸序列的第360位密碼子區(qū)，導(dǎo) 致NCC蛋白的跨膜區(qū)截短以及胞內(nèi)區(qū)缺失，NCC蛋白結(jié)構(gòu)不完整，從而影響蛋白的活性和功 能。
[0006] 本發(fā)明人針對(duì)所述突變基因 （SEQ ID No. 1)序列的突變位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析， 在100個(gè)正常對(duì)照人群中并未發(fā)現(xiàn)該突變，證明該突變位點(diǎn)在非GS的人群中不存在，是可能 的致病突變位點(diǎn)。
[0007] 因此，本發(fā)明人對(duì)該患者進(jìn)行了為期2個(gè)月的臨床隨訪(fǎng)。該患者自診斷為GS之日起 (2016年3月），規(guī)律服用氯化鉀緩釋片(補(bǔ)達(dá)秀)治療2個(gè)月（2016年5月），血鉀水平較前顯著 升高（2 ·91-3 · 13mmol/L)，血鎂水平也有所升高(0 · 54-0 · 68mmol/L)，肌無(wú)力等癥狀較前明 顯緩解。通過(guò)對(duì)該患者的臨床隨訪(fǎng)，有助于對(duì)GS進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步診斷和治療提供有 價(jià)值的數(shù)據(jù)。
[0008] 進(jìn)一步，本發(fā)明人針對(duì)鑒定得到的SLC12A3突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)提供了一種用于該GS致 病位點(diǎn)的快速基因診斷試劑盒，該試劑盒包含能夠特異性擴(kuò)增SLC12A3基因目的片段的引 物以及能夠特異性檢測(cè)所述NCC突變蛋白的抗體。所述引物序列如SEQ ID No.5所示，可擴(kuò) 增SLC12A3基因845bp長(zhǎng)度的片段(g.7065_7909)，這個(gè)片段包含了上述SLC12A3的突變基因 的新突變位點(diǎn)。所述抗體與所述NCC突變蛋白能夠特異性結(jié)合，且不與野生型SLC12A3基因 編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合。
[0009] 因此，本發(fā)明
[0010] 一方面，提供了Gitelman綜合征新的突變致病基因 SLC12A3,序列如SEQ ID No. 1 所示。該突變位點(diǎn)位于SLC12A3基因，同野生型SLC12A3基因序列（SEQIDNo.2)相比，該突 變序列中第8外顯子存在1個(gè)插入缺失框移突變。該突變可導(dǎo)致SLC12A3基因編碼的蛋白產(chǎn) 物發(fā)生框架移碼突變，突變蛋白可導(dǎo)致患者出現(xiàn)GS的相關(guān)癥狀。
[0011] 另一方面，提供該突變致病基因 SLC12A3所編碼的蛋白質(zhì)（NCC)，序列如SEQ ID NO.3所示，該蛋白質(zhì)與野生型PLEKHM1的蛋白質(zhì)序列（序列如SEQ ID NO.4)相比，NCC蛋白自 第332位密碼子開(kāi)始出現(xiàn)框架移碼，這種新突變位于NCC蛋白的氨基端，可產(chǎn)生大量翻譯錯(cuò) 誤的密碼子，并可導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)在NCC氨基酸序列的第360位密碼子區(qū)，導(dǎo)致NCC 蛋白的跨膜區(qū)截短以及胞內(nèi)區(qū)缺失，NCC蛋白結(jié)構(gòu)不完整，從而影響蛋白的活性和功能。
[0012] 再一方面，提供含有所述突變致病基因 SLC12A3的載體。所述載體的表達(dá)產(chǎn)物是所 述的突變基因 SLC12A3編碼的蛋白。
[0013] 另一方面，提供所述突變基因 SLC12A3在作為治療Gitelman綜合征的藥物靶點(diǎn)的 應(yīng)用。
[0014] 再一方面，提供所述突變的基因 SLC12A3在作為Gitelman綜合征的分子診斷以及 產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，即作為Gitelman綜合征診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0015] 再一方面，提供了一種用于診斷Gitelman綜合征的診斷試劑盒，所述試劑盒包括 能特異性的擴(kuò)增所述基因 SLC12A3的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所 示。所述引物能夠擴(kuò)增SLC12A3基因845bp長(zhǎng)度的片段(g.7065_7909)，該片段包含了上述 SLC12A3的突變基因的新突變位點(diǎn)。
[0016]再一方面，提供一種抗體，所述抗體與突變基因 SLC12A3所編碼的蛋白質(zhì)（SEQ ID NO.3)特異結(jié)合，且不作用于野生型SLC12A3編碼的蛋白質(zhì)（序列如SEQ ID NO.4)。
[0017] 再一方面，提供了一種用于診斷Gitelman綜合征的診斷試劑盒，所述試劑盒包括 上述能夠特異性檢測(cè)SLCl 2A3突變蛋白的抗體。
[0018] 目前，國(guó)內(nèi)對(duì)GS的基因診斷尚未全面開(kāi)展，而新的致病突變則無(wú)法通過(guò)現(xiàn)有的GS 相關(guān)基因診斷試劑盒檢測(cè)出來(lái)。因此，鑒定新的致病基因位點(diǎn)是了解GS致病機(jī)制、指導(dǎo)治療 的關(guān)鍵。
[0019] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)近期收治的一例GS患者及其家屬進(jìn)行基因檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新 的GS致病基因突變位點(diǎn)，并針對(duì)此位點(diǎn)研究開(kāi)發(fā)Gitelman綜合征快速基因診斷試劑盒。
[0020] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0021] (1)能夠?yàn)镚itelman綜合征的基因診斷提供一個(gè)新的位點(diǎn)，豐富了該病相關(guān)突變 位點(diǎn)的資源庫(kù)，為之后的患者診斷提供了更多依據(jù)。可以通過(guò)檢測(cè)Gitelman綜合征患者 SLC12A3基因序列來(lái)對(duì)其疾病進(jìn)行診斷和分型，也能夠?yàn)樘哼M(jìn)行合理的產(chǎn)前診斷，達(dá)到優(yōu) 生優(yōu)育篩查的目的。
[0022] (2)通過(guò)對(duì)本發(fā)明上述的Gi teIman綜合征突變蛋白的獲得以及體內(nèi)體外研究，能 夠較為深入的揭示Gitelman綜合征發(fā)病的分子機(jī)制，可以為Gitelman綜合征致病機(jī)制研究 提供更好的研究對(duì)象、思路和理論基礎(chǔ)。
[0023] (3)通過(guò)對(duì)該患者進(jìn)行的多年臨床隨訪(fǎng)，能夠獲得本發(fā)明所述突變導(dǎo)致的 Gitelman綜合征發(fā)生發(fā)展、疾病危險(xiǎn)性以及預(yù)后的相關(guān)數(shù)據(jù)，為治療Gitelman綜合征提供 新的通路。
[0024] (4)本發(fā)明可以為治療Gitelman綜合征提供一個(gè)新的可能的藥物靶點(diǎn)。
[0025] (5)基于本發(fā)明突變位點(diǎn)研究開(kāi)發(fā)的試劑盒能夠快速、有效的為Gitelman綜合征 患者提供分子診斷依據(jù)，并且可以考慮推廣至其他已知或未知的Gitelman綜合征致病位 點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明鑒定的Gi te Iman綜合征患者家系圖。其中正方形表示男性，圓圈表示 女性，實(shí)心為患病個(gè)體，空心為正常個(gè)體。
[0027]圖2為本發(fā)明鑒定的Gitelman綜合征以及其直系親屬SLC12A3測(cè)序峰圖。上部分是 SLC12A3野生型（正常人）的測(cè)序峰圖，下部分為患者的突變型SLC12A3測(cè)序峰圖。箭頭表示 突變發(fā)生位點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行 進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本 發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 本發(fā)明中所使用的方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用 的試驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 本發(fā)明對(duì)日前收治的一名GS患者進(jìn)行基因檢測(cè)和診斷，該GS家系進(jìn)行了全面的致 病基因篩查，最終得到了一個(gè)新的SLCl 2A3基因突變位點(diǎn)。針對(duì)該突變位點(diǎn)，
【申請(qǐng)人】開(kāi)展了 一下工作：1.體外構(gòu)建SLC12A3基因以及上述突變基因的表達(dá)載體。2.建立了上述表達(dá)載體 的體外表達(dá)系統(tǒng)，獲得了 SLC12A3基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白以及突變體蛋白。3.設(shè)計(jì)并合成了能夠 擴(kuò)增包含該位點(diǎn)在內(nèi)的845bp的核苷酸序列的引物，產(chǎn)物可用于后期測(cè)序鑒定突變情況。4. 設(shè)計(jì)針對(duì)突變蛋白特異性氨基酸序列的單克隆抗體，能夠特異性的結(jié)合NCC該位點(diǎn)突變的 蛋白，同時(shí)不與野生型NCC相結(jié)合。
[0031] 實(shí)施例1突變基因 SLC12A3的獲得與鑒定
[0032] 1.樣本采集
[0033] 本發(fā)明
【申請(qǐng)人】在對(duì)一個(gè)國(guó)內(nèi)的患者進(jìn)行治療時(shí)，通過(guò)對(duì)患者進(jìn)行問(wèn)診、體格檢查、 實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)該患者具有發(fā)作性四肢無(wú)力，且血鉀和血鎂水平均 低于正常，還存在低尿鈣等癥狀，但是血壓正常。該患者無(wú)長(zhǎng)期利尿劑、緩瀉劑史，無(wú)酗酒或 藥物成癮史，無(wú)不良嗜好。該患者的上述表現(xiàn)符合Gi te Iman綜合征的典型癥狀，故考慮其可 能是Gitelman綜合征患者。為進(jìn)一步確診，本發(fā)明人決定對(duì)其及其家屬進(jìn)行基因篩查。該家 系為一個(gè)三代中國(guó)人家系(如圖1所示），共有6人，包括1位患者（II-I)及5個(gè)對(duì)照樣本(1-1， 1-2，II-2，II-3，III-I)。同時(shí)隨機(jī)選取100例無(wú)低血鉀病史的健康正常人作為對(duì)照組，評(píng)估 本研究發(fā)現(xiàn)的所有突變位點(diǎn)。采集這些樣本的外周靜脈血樣品4ml，加入EDTA抗凝，置于-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 2 .DNA 提取
[0035] 收集先證者及其家系成員的外周血，采用試劑盒（TIANGEN BIOTECH，Beijing， China，DP304-03)從外周血中提取全基因組DNA，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定DNA濃度，將DNA濃 度調(diào)整至50ng/ul，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 3 .PCR 擴(kuò)增
[0037] 引物設(shè)計(jì)：SLC12A3基因序列來(lái)自于Genbank(NC_000016 · 10)，參考Shao L[可參見(jiàn) A novel SLC12A3splicing mutation skipping of two exons and preliminary screening for alternative splice variants in human kidney[J].Am J Nephrol， 2008,28(6) :900-907]等人的研究設(shè)計(jì)了22對(duì)引物用于擴(kuò)增SLC12A3的26個(gè)外顯子及其側(cè) 翼的內(nèi)含子序列。本研究所用引物全部由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物均溶 解稀釋為IOUM的工作液，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0038]引物序列如下表所示：
[0041 ] DNA擴(kuò)增：在25ul的PCR反應(yīng)體系中分別加入2.0ul dNTP，2.5ul 10XPCR緩沖液， 0· 15ul Taq酶，2ul基因組DNA和各0·5ul IOum的上下游引物，ddH2〇補(bǔ)足25ulICR反應(yīng)條件 為：梯度PCR儀上94°C預(yù)變性3min;隨后94°C變性30s，59-64°C退火45s，72°C延伸30s，共40 個(gè)循環(huán);最后72 °C延伸IOmin。
[0042] 4 ·測(cè)序
[0043] 采用蝦堿性磷酸酶和外切酶I純化PCR產(chǎn)物，純化的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳定量 后，應(yīng)用ABI Prism TM3730自動(dòng)DNA分析儀（美國(guó)Applied Biosystems)進(jìn)行單向或雙向測(cè) 序。
[0044] 米用Autoassembler 2.0軟件（美國(guó)Perkin Elmer)將測(cè)序結(jié)果與正常SLC12A3基 因組序列進(jìn)行對(duì)比分析。為保證測(cè)序結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，所有與正?；蛐蛄胁煌?的位點(diǎn)均進(jìn)行正反雙向測(cè)序。
[0045] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0046] 通過(guò)基因測(cè)序，
【申請(qǐng)人】發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于第8外顯子，為插入 缺失框移突變g.7549_7554delCGGAC and g.7561_7562delGT and g.7571insT and g.7626_7627delCT,c.965-l_969delCGGAC and c.976-977delGT and c.987insT and c.l041-1042delCT(圖 2)。
[0047 ] 實(shí)施例2-種用于診斷G i te Iman綜合征的診斷試劑盒
[0048] 所述試劑盒包括能特異性的擴(kuò)增基因 SLC12A3的引物，引物序列4:5'_ GCGGTCTTGTTCACTGCTATA-3 '，R:5 '-GCCATTCTGTGGTGTCCCTC-3 '。
[0049] PCR反應(yīng)體系：
[0050] 2.Oul dNTP
[0051 ] 2.5ul 10 X PCR 緩沖液
[0052] 〇.15ul Taq酶
[0053] 2ul基因組DNA
[0054] 各0.5ul IOum的上下游引物
[0055] CldH2O 補(bǔ)足 25ul。
[0056] PCR反應(yīng)條件為：梯度PCR儀上94°C預(yù)變性3min;隨后94°C變性30s，59-64°C退火 45s，72°C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. Gitelman綜合征新的突變致病基因 SLC12A3,其特征是，序列如SEQ ID No.l所示。2. 權(quán)利要求1所述突變致病基因 SLC12A3所編碼的蛋白質(zhì)，其特征是，序列如SEQ ID NO. 3所示。3. -種載體，其特征是，含有權(quán)利要求要求1所述突變致病基因 SLC12A3。4. 一種用于診斷Gitelman綜合征的診斷試劑盒，其特征是，包括能特異性的擴(kuò)增所述 基因 SLC12A3的引物，所述引物序列如SEQIDN0.5和SEQIDN0.6所示。5. -種抗體，其特征是，所述抗體與突變基因 SLC12A3所編碼的蛋白質(zhì)特異結(jié)合，且不 作用于野生型SLC12A3編碼的蛋白質(zhì)。6. -種用于診斷Gitelman綜合征的診斷試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括權(quán)利要求5 所述抗體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861514SQ201610368031
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】徐潮, 石然然, 趙家軍, 高聆
【申請(qǐng)人】山東省立醫(yī)院