目的基因轉(zhuǎn)化甜櫻桃的方法及其在甜櫻桃原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了目的基因轉(zhuǎn)化甜櫻桃的方法及其在甜櫻桃原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法包括：將甜櫻桃果肉愈傷組織進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞；將懸浮細(xì)胞用CPW13M進(jìn)行處理，得到CPW13M處理的懸浮細(xì)胞，CPW13M為向細(xì)胞?原生質(zhì)體清洗液中加入甘露醇得到的甘露醇質(zhì)量百分比濃度為11％?15％的溶液；用纖維素酶和果膠酶酶解CPW13M處理的懸浮細(xì)胞得到甜櫻桃原生質(zhì)體；以甜櫻桃原生質(zhì)體為受體進(jìn)行甜櫻桃轉(zhuǎn)化。實驗證明，本發(fā)明的甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法可以將目的基因在甜櫻桃原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時表達(dá)，可以用來進(jìn)行目的基因的功能驗證及蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的定位，還可用來檢測蛋白質(zhì)互作及細(xì)胞代謝。
【專利說明】
目的基因轉(zhuǎn)化甜櫻桃的方法及其在甜櫻桃原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化 中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中目的基因轉(zhuǎn)化甜櫻桃的方法及其在甜櫻桃原生質(zhì)體 中瞬時表達(dá)目的基因中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜櫻桃(Primus avium L.)是一種深受人們喜愛，且是具有較高的營養(yǎng)價值及醫(yī) 療保健作用的水果。果實的色澤是影響果品商品性與價值性的重要因素之一，對影響果實 色澤形成調(diào)控基因的研究，有助于揭示果實著色的分子機(jī)理。廣泛應(yīng)用于再生植株的胚性 愈傷組織是游離原生質(zhì)體的良好試材。沒有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體細(xì)胞在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及代謝 過程等方面與完整的植物細(xì)胞或組織基本相同。植物的原生質(zhì)體作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要 工具，是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體，可用于所轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞器定位、功能研究及蛋白互作研究 等，同時也為在細(xì)胞水平上研究植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和生理反應(yīng)等提供了便利。
[0003] 目前尚未在甜櫻桃本屬植物中建立高效的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，影響了甜櫻桃重要 候選基因的功能驗證和研究。因此建立高效的甜櫻桃原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系具有實際意 義，為甜櫻桃重要候選基因的研究分析和遺傳轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何在甜櫻桃原生質(zhì)體中進(jìn)行目的基因的瞬時表 達(dá)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了甜櫻桃原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的甜櫻桃原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法，包括以甜櫻桃原生質(zhì)體為受體進(jìn)行甜 櫻桃轉(zhuǎn)化；
[0007] 所述甜櫻桃原生質(zhì)體為利用甜櫻桃果肉制備的原生質(zhì)體。
[0008] 上述方法中，利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法可包括：
[0009] Al)將甜櫻桃果肉愈傷組織進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞；
[0010] A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細(xì)胞得到所述甜櫻桃原生質(zhì)體。
[0011]上述方法中，所述將甜櫻桃果肉愈傷組織進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)包括:將所述甜櫻桃 果肉愈傷組織在懸浮系繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞；
[0012] 所述懸浮系繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、NAA、維生素 C和蔗糖得到的培養(yǎng) 基;所述懸浮系繼代培養(yǎng)基中所述M、所述NAA、所述維生素 C和所述蔗糖的濃度可分別為 1 · Omg/L、0 · 3mg/L、3mg/L和質(zhì)量百分比濃度3 %，pH為5 · 85。
[0013] 上述方法中，所述Al)具體可包括:研磨所述甜櫻桃果肉愈傷組織，得到研磨物;將 所述研磨物在所述懸浮系繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，得到所述懸浮細(xì)胞。
[0014] 上述方法中，所述研磨甜櫻桃果肉愈傷組織可為用網(wǎng)篩研磨所述甜櫻桃果肉愈傷 組織。所述網(wǎng)篩可為不銹鋼網(wǎng)篩，如40目不銹鋼網(wǎng)篩。
[0015] 上述方法中，所述以甜櫻桃原生質(zhì)體為受體進(jìn)行甜櫻桃原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化可為用含有 目的基因的侵染液侵染所述甜櫻桃原生質(zhì)體。所述用含有目的基因的侵染液侵染所述甜櫻 桃原生質(zhì)體可為利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體瞬時表達(dá)方法完成所述侵染。
[0016] 上述方法中，所述侵染時間可為5_25min，如IOmin或15min。
[0017] 上述方法中，所述懸浮繼代培養(yǎng)的次數(shù)可大于等于2次，每次懸浮繼代培養(yǎng)的時間 可為7-10d，如8d。所述懸浮繼代培養(yǎng)可在黑暗、120r/min下進(jìn)行。所述懸浮繼代培養(yǎng)的溫度 可為22-24°C。
[0018] 上述方法中，所述用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細(xì)胞前還可包括將所述懸浮 細(xì)胞用CPWl3M進(jìn)行處理;所述CPWl3M為向細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液（ce 11 protoplast wash medium，以下簡稱CPW溶液）中加入甘露醇得到的甘露醇的質(zhì)量百分比濃度為11 % -15 %的 溶液(如13%)。
[0019] 上述方法中，用所述CPWl3M處理所述懸浮細(xì)胞的時間可為0.5-2h。用所述CPWl3M 處理所述懸浮細(xì)胞的浸泡時間具體可為Ih。
[0020] 上述方法中，所述纖維素酶、所述果膠酶和所述CPW13M處理的懸浮細(xì)胞的比例可 為1000U:50U:10mL。
[0021] 上述方法中，所述A2)可包括A21)和A22):
[0022] A21)用含有所述纖維素酶和所述果膠酶酶的酶液浸泡所述懸浮細(xì)胞，得到酶-原 生質(zhì)體混合液；
[0023] A22)將所述酶-原生質(zhì)體混合液加至CPW25S上，得到下層為CPW25S上層為酶-原生 質(zhì)體混合液的分層液體1;將所述分層液體1進(jìn)行離心，使原生質(zhì)體位于所述分層液體1的界 面處，分離原生質(zhì)體，得到所述甜櫻桃原生質(zhì)體；
[0024] 所述CPW25S為向所述細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液中加入蔗糖得到的溶液;所述CPW25S 中蔗糖質(zhì)量百分比濃度為23%-27% (如25% )。
[0025] 上述方法中，所述酶液由溶質(zhì)和溶劑組成;所述溶劑為所述CPW溶液，所述溶質(zhì)及 其濃度分別為1000001VL所述纖維素酶、5000U/L所述果膠酶、0.6mol/L D-mannitol、1.0% (質(zhì)量百分比濃度)聚乙烯啦咯烷酮(PVP)、0.1 % (質(zhì)量百分比濃度)MES和0.1 % (質(zhì)量百分 比濃度)BSA，pH為5.8。
[0026] 上述方法中，用所述酶液浸泡所述懸浮細(xì)胞可在弱光（如5001ux以下）、22-24Γ、 50r/min下進(jìn)行。用所述酶液浸泡所述CPW13M處理的懸浮細(xì)胞的時間可為16-20h，如18h。
[0027] 上述方法中，所述纖維素酶可為Cellulase R-10。所述果膠酶可為Pectolase Y-23。所述Cellulase R-IO具體可為北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號為L0012。所述 Pectolase Y-23具體可為北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號為aov0093。
[0028] 上述方法中，所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法可包括:將甜櫻桃果肉在誘導(dǎo) 培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到甜櫻桃果肉愈傷組織；
[0029] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2,4_D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基；
[0030] 其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中BA、2,4-D和蔗糖的濃度分別可為2mg/L、lmg/L和3% (質(zhì) 量百分比濃度）。
[0031] 上述方法中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)可在22-24Γ、黑暗下進(jìn)行。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)時間 可為 7-21d，如 14d。
[0032] 上述方法中，所述甜櫻桃果肉具體可為10_40DAFB(盛花后天數(shù)，Day after full b Ioom)的甜櫻桃果實的果肉，如34DAFB的甜櫻桃果實的果肉。
[0033] 上述方法中，所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法還可包括將所述甜櫻桃果肉愈 傷組織在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)；
[0034]所述繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、NAA和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基；
[0035]其中所述繼代培養(yǎng)基中M、NAA和蔗糖的濃度分別可為3mg/L、1.5mg//L和3% (質(zhì)量 百分比濃度）。
[0036] 上述方法中，所述繼代培養(yǎng)可在22-26Γ、黑暗下進(jìn)行。所述繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)時間 可為 7-21d，如 14d。
[0037] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述Pl或P2的方法：
[0038] P1、所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法；
[0039] P2、所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法。
[0040] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述Ml或M2的產(chǎn)品：
[00411 M1、用于制備甜櫻桃原生質(zhì)體的成套試劑，為所述CPW13M、所述CPW25S、所述細(xì)胞- 原生質(zhì)體清洗液、所述纖維素酶、所述果膠酶酶、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、所述繼代培養(yǎng)基中的至 少兩種；
[0042] M2、用于誘導(dǎo)甜櫻桃果肉愈傷組織的成套試劑，為所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或所述繼代 培養(yǎng)基。
[0043] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0044] Xl、所述甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目的基因中的應(yīng)用；
[0045] X2、所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目的基因中的 應(yīng)用；
[0046] X3、所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目的基因中的應(yīng) 用；
[0047] X4、所述產(chǎn)品在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目的基因中的應(yīng)用；
[0048] X5、所述甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法在植物基因功能驗證中的應(yīng)用；
[0049] X6、所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法在植物基因功能驗證中的應(yīng)用；
[0050] X7、所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在植物基因功能驗證中的應(yīng)用；
[0051 ] X8、所述產(chǎn)品在植物基因功能驗證中的應(yīng)用；
[0052] X9、所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在制備甜櫻桃原生質(zhì)體的中的應(yīng)用；
[0053] X10、所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在甜櫻桃轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用；
[0054] XII、所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法在制備甜櫻桃原生質(zhì)體的中的應(yīng) 用。
[0055] 本發(fā)明中，所述甜櫻桃具體可為'紅燈'櫻桃。
[0056] 本發(fā)明中，所述懸浮系繼代培養(yǎng)基可為無菌培養(yǎng)基。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基可為無菌培 養(yǎng)基。所述繼代培養(yǎng)基可為無菌培養(yǎng)基。所述CPW13M可為無菌液體。所述酶液可為無菌液 體。所述CPW25S可為無菌液體。
[0057] 實驗證明，本發(fā)明的甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法能將目的基因在甜櫻桃，尤其是甜櫻桃的果 肉中進(jìn)行瞬時表達(dá)，并使目的基因得到表達(dá):對照中綠色熒光信號分布在整個原生質(zhì)體細(xì) 胞中，而轉(zhuǎn)化目的基因 PacMYBA基因的甜櫻桃原生質(zhì)體中綠色熒光信號集中在細(xì)胞核區(qū)域， 表明PacMYBA基因在細(xì)胞核區(qū)域有表達(dá)，與PacMYBA基因在自然情況下的表達(dá)特點一致。本 發(fā)明的甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法能制備甜櫻桃愈傷組織:利用本發(fā)明的甜櫻桃果肉 愈傷組織的制備方法得到的愈傷組織顏色淡黃、質(zhì)地松脆、表面有顆粒狀凸起，鏡檢觀察到 細(xì)胞為圓形細(xì)胞，并且經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后形態(tài)穩(wěn)定，增殖能力強(qiáng)。本發(fā)明的甜櫻桃原生質(zhì)體 的制備方法能制備高質(zhì)量的由細(xì)胞膜包裹著的圓球狀甜櫻桃原生質(zhì)體。
[0058]實驗證明，本發(fā)明的甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法可以將目的基因在甜櫻桃，尤其是甜櫻桃的 果肉中進(jìn)行瞬時表達(dá)，可以用來進(jìn)行目的基因的功能驗證及蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的定位，還可 用來檢測蛋白質(zhì)互作及細(xì)胞代謝。本發(fā)明建立了高效的甜櫻桃原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系，為 甜櫻桃重要候選基因的研究分析和遺傳轉(zhuǎn)化提供了技術(shù)支持。
【附圖說明】
[0059] 圖1為甜櫻桃果肉愈傷組織的外觀。A為甜櫻桃果肉剛接種;B為甜櫻桃果肉接種后 7d;C為甜櫻桃果肉接種后14d;D為甜櫻桃果肉接種后21d;E為甜櫻桃果肉接種后28d;F為繼 代培養(yǎng)五次的甜櫻桃果肉愈傷組織。Bar = 2mm。
[0060] 圖2為甜櫻桃果肉愈傷組織懸浮系。
[0061 ]圖3為酶解懸浮系細(xì)胞。A為酶解前的懸浮系細(xì)胞;B為酶解后的懸浮系細(xì)胞。
[0062]圖4為甜櫻桃原生質(zhì)體的鏡檢和純化。A為未經(jīng)純化的原生質(zhì)體鏡檢結(jié)果;B為純化 過程中的分層情況，1為酶解液，2為原生質(zhì)體層，3為殘渣及CPW25S; C為純化后的原生質(zhì)體 鏡檢結(jié)果。
[0063]圖5為目的基因在甜櫻桃原生質(zhì)體中的表達(dá)情況。Al為暗場下轉(zhuǎn)化E3025的甜櫻桃 原生質(zhì)體;A2為明場下的轉(zhuǎn)化E3025的甜櫻桃原生質(zhì)體;A3為明暗疊加場下的轉(zhuǎn)化E3025的 甜櫻桃原生質(zhì)體;Bl為暗場下的轉(zhuǎn)化E3025-PacMYBA的甜櫻桃原生質(zhì)體;B2為明場下的轉(zhuǎn)化 E3025-PacMYBA的甜櫻桃原生質(zhì)體;B3為明暗疊加場下的轉(zhuǎn)化E3025-PacMYBA的甜櫻桃原生 質(zhì)體。Bars = I 5μηι。
【具體實施方式】
[0064]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0065] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0066] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0067]下述實施例中的'紅燈'櫻桃(P.avium L.cv.Hong Deng)，公眾可從
【申請人】處獲 得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其他用途使用。
[0068] 下述實施例中的載體E3025為將pSAT6-RFP-Nl載體中的RFP基因替換為GFP基因， 保持其他序列不變得到的載體，載體E3025表達(dá)綠色熒光蛋白GFP。其中pSAT6-RFP-Nl載體 記載在文南犬（Sang-Min Chung et al.A versatile vector system for multiple gene expression in plants .TRENDS in Plant Science Vol .IONo .8August 2005)中。公眾可 從
【申請人】處獲得載體E3025,該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用 途使用。
[0069] 下述實施例中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2，4-D、鹿糖和瓊脂得到的無 菌固體培養(yǎng)基;其中M、2，4-D、鹿糖和瓊脂的濃度分別為2mg/L、lmg/L、3 % (質(zhì)量百分比濃 度)和7.5g/L。
[0070] 下述實施例中的繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、NAA、蔗糖和瓊脂得到的無菌 固體培養(yǎng)基;其中M、2，4-D、鹿糖和瓊脂的濃度分別為3mg/L、1.5mg/L、3 % (質(zhì)量百分比濃 度)和7.5g/L。
[0071] 下述實施例中的懸浮系繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、NAA、維生素 C和蔗糖 得到的無菌液體培養(yǎng)基，其中BA、NAA、維生素 C和蔗糖的濃度分別為1.0mg/L、0.3mg/L、3mg/ L和3% (質(zhì)量百分比濃度），pH為5.85。
[0072]下述實施例中的CPWl 3M為向CPW溶液中加入甘露醇得到的甘露醇質(zhì)量百分比濃度 為13 %的無菌溶液。CPW溶液由水和溶質(zhì)組成，CPW溶液的溶質(zhì)及其濃度分別為KH2P〇4 27.2mg/L、KN0 3 101.0mg/L、CaCl2 1180.0mg/L、MgS〇4 120.0mg/L、KI 0.16mg/L及CuS〇4· 5H2O 0.025mg/L〇
[0073] 下述實施例中的酶液為溶質(zhì)和溶劑；溶劑為CPW(cell protoplast washing medium)，溶質(zhì)及其濃度分別為1000001VL纖維素酶R-10、5000U/L果膠酶Y-23、0.6mol/L甘 露醇、1.0% (質(zhì)量百分比濃度)聚乙烯吡咯烷酮(PVP K-30)、0.1% (質(zhì)量百分比濃度)MES和 0.1% (質(zhì)量百分比濃度)BSA，pH為SAXellulase R-10為北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn) 品，貨號為L0012 Jectolase Y-23為北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，貨號為aov0093。
[0074] 下述實施例中的W5溶液為由水和溶質(zhì)組成的無菌溶液，W5溶液的溶質(zhì)及其濃度分 別為CaCl2 · 2H2O 125mmol/L，NaCl 154·0mmol/L，KCl 5.0mmol/L，葡萄糖5.0mmol/L，一水 嗎啉乙磺酸(MES)5 · Ommol/Lo
[0075] 下述實施例中的CPW25S為向CPW溶液中加入蔗糖得到的蔗糖質(zhì)量百分比濃度為 25%的無菌溶液。
[0076] 下述實施例中的MMg為由溶質(zhì)和溶劑組成的無菌溶液;溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分 別為MgCl2 15mmol/L，MES 0.1%(質(zhì)量百分比濃度)和甘露醇0.4111〇1/1。
[0077]下述實施例中的PEG 4000水溶液為由溶質(zhì)和溶劑組成的無菌溶液;溶劑為水，溶 質(zhì)及其濃度分別為PEG 4000 40% (質(zhì)量百分比濃度）。
[0078] 實施例1、甜櫻桃原生質(zhì)體中目的基因的瞬時表達(dá)
[0079] 甜櫻桃中目的基因的瞬時表達(dá)，包括利用甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法將目的基因轉(zhuǎn)至甜櫻桃 中，具體為用含有目的基因的侵染液侵染甜櫻桃原生質(zhì)體，完成甜櫻桃轉(zhuǎn)化。實驗重復(fù)三 次，每次重復(fù)實驗的具體操作步驟如下：
[0080] 一、甜櫻桃原生質(zhì)體的制備
[0081] 1、甜櫻桃果肉愈傷組織的制備
[0082] 1.1外植體消毒
[0083] 將 34DAFB(盛花后天數(shù)，Day after full bloom)'紅燈'甜櫻桃（P.avium L. cv. Hong Deng)的幼果清洗干凈，并用75 % (體積百分比濃度）的乙醇水溶液表面消毒 30s，然后用有效氯質(zhì)量百分比為5%的次氯酸鈉水溶液消毒13min，最后用無菌水沖洗3-4 次，得到無菌幼果。
[0084] 1.2甜櫻桃果肉愈傷組織的誘導(dǎo)
[0085] 用無菌濾紙將步驟I. 1的無菌幼果表面的水吸干，在無菌條件下用鑷子小心去除 種皮，將幼果的果肉切成4mm見方小塊后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，而后在25± TC下避光培養(yǎng) 28d，得到甜櫻桃果肉愈傷組織。
[0086] 1.3甜櫻桃果肉愈傷組織的繼代培養(yǎng)
[0087]將步驟1.2的甜櫻桃果肉愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，而后在25土 TC下避光培 養(yǎng)14d，得到繼代培養(yǎng)的甜櫻桃果肉愈傷組織，將該繼代培養(yǎng)的甜櫻桃果肉愈傷組織在25± 1°C、黑暗下重復(fù)繼代培養(yǎng)4次。
[0088]觀察步驟1.2得到的甜櫻桃果肉愈傷組織和步驟1.3的繼代培養(yǎng)的甜櫻桃果肉愈 傷組織（圖1)，甜櫻桃果肉接種后得到的甜櫻桃果肉愈傷組織顏色淡黃、質(zhì)地松脆、表面有 顆粒狀凸起（圖1中C和D)，鏡檢觀察到細(xì)胞為圓形細(xì)胞，并且經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后形態(tài)穩(wěn)定， 增殖能力旺盛(圖1中F)。
[0089] 2、甜櫻桃原生質(zhì)體的制備
[0090] 2.1懸浮細(xì)胞的制備
[0091]用40目不銹鋼網(wǎng)篩研磨實例1步驟1.3得到的甜櫻桃果肉愈傷組織，得到研磨物， 該研磨物(顆粒直徑約40μπ〇;將研磨物在懸浮系繼代培養(yǎng)基中懸浮繼代培養(yǎng)7d，懸浮繼代 培養(yǎng)的條件為黑暗、120r/min下，溫度為23 ± TC，重復(fù)繼代培養(yǎng)3次，得到懸浮系細(xì)胞（圖 2)〇
[0092] 2.2甜櫻桃原生質(zhì)體的制備
[0093]用CPW13M浸泡步驟2.1得到的懸浮系細(xì)胞lh，棄上層液體，得到CPW13M預(yù)處理的懸 浮系細(xì)胞;按照CPW13M處理的懸浮細(xì)胞和酶液的體積比為1:10的比例向CPW13M預(yù)處理的懸 浮系細(xì)胞中加入酶液，得到酶-懸浮細(xì)胞混合液，將酶-懸浮細(xì)胞混合液在弱光(5001ux)、23 ± 1°C、50r/min下孵育18h，得到酶解后的酶-懸浮細(xì)胞混合液（圖3);將酶解后的酶-懸浮細(xì) 胞混合液用200目尼龍網(wǎng)篩輕輕研磨過濾，釋放原生質(zhì)體，得到酶-原生質(zhì)體混合液。
[0094] 按照下述方法純化酶-原生質(zhì)體混合液中的原生質(zhì)體:將酶-原生質(zhì)體混合液輕輕 加至CPW25S上，過程輕柔緩慢，避免沖撞分界面，盡量使其保持穩(wěn)定，得到下層為CPW25S上 層為酶 -原生質(zhì)體混合液的分層液體;將分層液體在800rpm下離心6min，使原生質(zhì)體位于所 述分層液體的界面處(圖4中B)，小心地將界面處的原生質(zhì)體層吸出，得到甜櫻桃原生質(zhì)體； 將甜櫻桃原生質(zhì)體置于新的離心管中，用CPW13溶液洗滌2-3次，每次洗滌均在800rpm下離 心6min，最后用CPW13M溶液重懸甜櫻桃原生質(zhì)體，得到甜櫻桃原生質(zhì)體懸浮液。
[0095] 將甜櫻桃果肉原生質(zhì)體進(jìn)行鏡檢，結(jié)果如圖4中A和C所示，結(jié)果顯示，純化后可得 到高質(zhì)量的由細(xì)胞膜包裹著的圓球狀甜櫻桃原生質(zhì)體。
[0096]二、甜櫻桃中目的基因的瞬時表達(dá) [0097] 1、目的基因的制備
[0098] 將載體E3025的EcoR I和Sal I識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列1所示 的PacMYBA基因（PacMYBA基因為甜櫻桃基因），得到重組載體E3025-PacMYBA-GFP<^3025-PacMYBA-GFP表達(dá)序列2所示的蛋白質(zhì)。
[0099]其中，序列1為PacMYBA基因的序列，編碼序列2所示的蛋白質(zhì)。
[0100] 2、甜櫻桃原生質(zhì)體中目的基因的瞬時表達(dá)
[0101 ]按照下述方法完成目的基因轉(zhuǎn)化甜櫻桃原生質(zhì)體，并將載體E3025作為對照：
[0102] 1)將步驟一種2得到的甜櫻桃原生質(zhì)體懸浮液于冰上放置30min后，于SOOrpm下離 心6min，棄上清液，得到甜櫻桃原生質(zhì)體；向甜櫻桃原生質(zhì)體中加入300yL MMg重懸原生質(zhì) 體，得到甜櫻桃原生質(zhì)體MMg懸浮液；
[0103] 2)向步驟1)的100μL甜櫻桃原生質(zhì)體MMg懸浮液中加入10μg步驟1的重組載體 E3025-PacMYBA-GFP質(zhì)粒，輕輕混勻，得到甜櫻桃原生質(zhì)體-E3025-PacMYBA-GFP混合液；向 甜櫻桃原生質(zhì)體-E3025-PacMYBA-GFP混合液中加入IlOyL PEG 4000水溶液，混勻后得到待 轉(zhuǎn)化液;將待轉(zhuǎn)化液于23°C下孵育15min進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，得到原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化液；
[0104] 3)向步驟2)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化液中加入440yL CPW13M，輕輕顛倒，得到轉(zhuǎn)化后液 體;將轉(zhuǎn)化后液體于800rpm下離心6min，棄上清液，得到轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體；
[0105] 4)向步驟3)的轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體中加入200yL W5溶液輕柔混勻后，再加入800yL W5溶液，然后于細(xì)胞培養(yǎng)板上、23 ± 1°C、弱光(5001ux)下孵育17h，得到轉(zhuǎn)化15min的甜櫻桃 原生質(zhì)體。
[0106] 按照步驟1 )-4)的方法，將孵育15min分別替換為孵育5、10、20和25min，其他步驟 均不變，分別得到轉(zhuǎn)化5、10、20和25min的甜櫻桃原生質(zhì)體。
[0107] 激光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS FLUVIEW FV1000,日本）下觀察轉(zhuǎn)化5、10、15、20和 25min的甜櫻桃原生質(zhì)體中目的基因的瞬時表達(dá)情況，未見這幾種甜櫻桃原生質(zhì)體中目的 基因表達(dá)的顯著性差異，其中轉(zhuǎn)化15min的甜櫻桃原生質(zhì)體中目的基因的瞬時表達(dá)情況如 圖5所示。
[0108] 結(jié)果顯示，對照中綠色熒光信號分布在整個原生質(zhì)體細(xì)胞中，而轉(zhuǎn)化5、10、15、20 和25min的甜櫻桃原生質(zhì)體中綠色熒光信號均集中在細(xì)胞核區(qū)域，表明PacMYBA基因在細(xì)胞 核區(qū)域有表達(dá)，與PacMYBA基因在自然情況下的表達(dá)特點一致。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的方 法可以將目的基因在甜櫻桃中進(jìn)行瞬時表達(dá)，并可進(jìn)行目的基因的功能驗證。
【主權(quán)項】
1. 甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法，包括以甜櫻桃原生質(zhì)體為受體進(jìn)行甜櫻桃轉(zhuǎn)化； 所述甜櫻桃原生質(zhì)體為利用甜櫻桃果肉制備的原生質(zhì)體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法包 括： A1)將甜櫻桃果肉愈傷組織進(jìn)行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細(xì)胞； A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細(xì)胞得到所述甜櫻桃原生質(zhì)體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細(xì) 胞前還包括將所述懸浮細(xì)胞用CPW13M進(jìn)行處理;所述CPW13M為向細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液中 加入甘露醇得到的甘露醇的質(zhì)量百分比濃度為11 % -15 %的溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：用所述CPW13M處理所述懸浮細(xì)胞的時間為 0.5~2h〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述A2)包括A21)和A22): A21)用含有所述纖維素酶和所述果膠酶酶的酶液浸泡所述懸浮細(xì)胞，得到酶-原生質(zhì) 體混合液； A22)將所述酶-原生質(zhì)體混合液加至CPW25S上，得到下層為CPW25S上層為酶-原生質(zhì)體 混合液的分層液體1;將所述分層液體1進(jìn)行離心，使原生質(zhì)體位于所述分層液體1的界面 處，分離原生質(zhì)體，得到所述甜櫻桃原生質(zhì)體； 所述CPW25S為向所述細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液中加入蔗糖得到的溶液;所述CPW25S中蔗 糖質(zhì)量百分比濃度為23%-27%。6. 根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于:所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備 方法包括:將甜櫻桃果肉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到甜櫻桃果肉愈傷組織； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于:所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法還包括 將所述甜櫻桃果肉愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)； 所述繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基。8. 下述P1或P2的方法： P1、權(quán)利要求2-7中任一所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法； P2、權(quán)利要求2-7中任一所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法。9. 下述Ml或M2的產(chǎn)品： M1、用于制備甜櫻桃原生質(zhì)體的成套試劑，為權(quán)利要求1-6中所述CPW13M、所述CPW25S、 所述細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液、所述纖維素酶、所述果膠酶酶、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基、所述繼代培養(yǎng) 基中的至少兩種； M2、用于誘導(dǎo)甜櫻桃果肉愈傷組織的成套試劑，為權(quán)利要求6所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或權(quán) 利要求7所述繼代培養(yǎng)基。10. 下述任一應(yīng)用： XI、權(quán)利要求1-7中任一所述甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目的基因中的應(yīng)用； X2、權(quán)利要求1-7中任一所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法在甜櫻桃中瞬時表 達(dá)目的基因中的應(yīng)用； X3、權(quán)利要求6-7中任一所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目 的基因中的應(yīng)用； X4、權(quán)利要求9所述產(chǎn)品在甜櫻桃中瞬時表達(dá)目的基因中的應(yīng)用； X5、權(quán)利要求1-7中任一所述甜櫻桃轉(zhuǎn)化方法在植物基因功能驗證中的應(yīng)用； X6、權(quán)利要求1-7中任一所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法在植物基因功能驗 證中的應(yīng)用； X7、權(quán)利要求6-7中任一所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在植物基因功能驗證中 的應(yīng)用； X8、權(quán)利要求9所述產(chǎn)品在植物基因功能驗證中的應(yīng)用； X9、權(quán)利要求6-7中任一所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在制備甜櫻桃原生質(zhì)體 的中的應(yīng)用； X10、權(quán)利要求6-7中任一所述甜櫻桃果肉愈傷組織的制備方法在甜櫻桃轉(zhuǎn)化中的應(yīng) 用； XII、權(quán)利要求1-7中任一所述利用甜櫻桃果肉制備原生質(zhì)體的方法在制備甜櫻桃原生 質(zhì)體的中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK105861539SQ201610330575
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】李天紅, 姚立萍, 郭蕭, 趙迪, 王彥濤
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)