一種高效的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒及其在流感病毒反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒及其在流感病毒反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒是以真核表達(dá)載體pEF4/myc?His B為骨架進(jìn)行改造得到的。為了建立馬流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的反向遺傳操作系統(tǒng)，本發(fā)明使用構(gòu)建得到的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒雙向分別表達(dá)馬流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS以及M基因，通過共轉(zhuǎn)染、測序、生長曲線的繪制和酶切鑒定，成功拯救得到一株EIV及其突變體。同時與現(xiàn)有的pBD系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)毒量的比較，表明本發(fā)明建立的反向遺傳操作系統(tǒng)優(yōu)于pBD系統(tǒng)。本發(fā)明的提出為流感病毒的反向遺傳研究提供了一種新的技術(shù)手段，同時也為日后深入研究馬流感病毒的傳播，致病機(jī)理，乃至疫苗候選株的篩選奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【專利說明】
-種高效的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒及其在流感病毒反向遺傳學(xué) 中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種雙向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒及其在流感病毒反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒屬于正黏病毒科((Irthomyxoviridae)，根據(jù)NP蛋白和M蛋白的抗原性可 分為，A、B和C型流感病毒。其中，C型流感病毒僅溫和感染人，幾乎無癥狀。A型和B型流感病 毒均可導(dǎo)致季節(jié)性的流感，而A型流感病毒可W造成全球大流行。此外，流感病毒的基因組 由7(C型)或8(A型和B型)個分節(jié)段的單鏈負(fù)義RNA組成，容易發(fā)生重排，產(chǎn)生新的毒株，運(yùn)使 流感的防控遇到了挑戰(zhàn)。研究流感病毒對于促進(jìn)流感病毒的認(rèn)識和流感的防控具有積極意 義。
[0003] 反向遺傳學(xué)為流感病毒研究中應(yīng)用最為廣泛的工具之一。目前，已經(jīng)有許多病毒 捶救系統(tǒng)被應(yīng)用于流感病毒的相關(guān)研究中，其中W8質(zhì)粒系統(tǒng)最為簡便易行，其核屯、是雙向 轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體。運(yùn)類載體一般擁有轉(zhuǎn)錄方向相對的poll啟動子和pol II啟動子，能夠W同 一CDNA為模板分別轉(zhuǎn)錄病毒負(fù)鏈RNA和表達(dá)病毒蛋白，進(jìn)而組裝出病毒。2000年，化ffman等 首次利用PHW2000載體建立了HlNl的8質(zhì)粒系統(tǒng)。2005年，李澤君等首次使用基于地D載體的 8質(zhì)粒系統(tǒng)研究H5N1禽流感病毒。盡管PHW2000和P抓均采用強(qiáng)有力的CMV啟動子，捶救的第 一代病毒的滴度仍然較低，需要通過MDCK細(xì)胞或雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)，費(fèi)時費(fèi)力，難W適應(yīng)諸多研 究需求。然而，有報(bào)道稱EFl-a啟動子比CMV啟動子活性要高?；蛟S可W采用EFl-a啟動子構(gòu) 建雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體，建立8質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)，捶救出更高滴度的病毒。
[0004] 基于上述假設(shè)，經(jīng)過科學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒及其在流感病 毒反向遺傳學(xué)中的應(yīng)用。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)手段：
[0007] 一種雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體，其特征在于W真核表達(dá)載體祀FVmyc-His B為骨架進(jìn) 行改造:在所述祀F4/myc-HiS B載體的KpnI和BclI酶切位點(diǎn)之間插入鼠源的poll終止子、 BsmBI酶切位點(diǎn)和人源的poll啟動子序列；在其SphI和BspQI酶切位點(diǎn)之間插入一段短的 Linker序列，替換原載體上從fIori到SV40poly A信號之間的非必需元件，所述的Linker序 列為5 ' -CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3 '，將改造后的載體命名為祀Z。
[000引在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所 /J、- O
[0009]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種馬流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，其含有8個基于 本發(fā)明所述的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒而構(gòu)建的重組質(zhì)粒，分別表達(dá)野生型或突變型的馬流感 病毒 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NSW及M基因節(jié)段。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NSW及M基因節(jié)段的 核巧酸序列分別如SEQ ID NO.2-9所示。
[0011] 在本發(fā)明的一個具體實(shí)施例中，優(yōu)選的，HA基因節(jié)段帶有化ndn I和NdeI酶切位 點(diǎn)，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0012] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了 W上任一項(xiàng)所述的反向遺傳操作系統(tǒng)在馬流感病毒 捶救中的用途。
[0013] -種利用本發(fā)明所述的反向遺傳操作系統(tǒng)捶救馬流感病毒的方法，包括W下步 驟：
[0014] (1)雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的構(gòu)建
[001日]真核表達(dá)載體pEF4/myc-His B為骨架進(jìn)行改造 :在所述pEF4/myc-His B載體的 Kpn I和Bc 11酶切位點(diǎn)之間插入鼠源的PO 11終止子、BsmBI酶切位點(diǎn)和人源的PO 11啟動子序 列；在其SphI和BspQI酶切位點(diǎn)之間插入一段短的Linker序列，替換原載體上從flori到 SV40poly A信號之間的非必需元件，所述的Linker序列為5'-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3'，將改造后的載體命名為祀Z;
[0016] (2)攜帶病毒CDNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建和分子標(biāo)記的引入
[0017] 提取A/equine/Jilin/1/1989株的病毒RNA，Wunil2為反轉(zhuǎn)錄引物，W各個節(jié)段相 應(yīng)引物對為擴(kuò)增引物，使用RT-PCR方法擴(kuò)增8個基因節(jié)段:PB2，PBl，PA，HA，NP，NA，M和NS;各 個節(jié)段經(jīng)BsmBI或BsaI酶切后，分別定向克隆至I帖Z的BsmBI之中，構(gòu)建得至化個重組質(zhì)粒； [001引所述的引物序列如下所示：
[00191
[0020] (3)重組病毒的捶救
[0021] 使用步驟(2)構(gòu)建得到的8個節(jié)段的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，捶救重組病毒。
[0022] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，還包括使用W下引物對對野生型HA節(jié)段進(jìn)行 T449C和C983T的無義點(diǎn)突變，構(gòu)建含有突變型HA節(jié)段的重組質(zhì)粒，使其HA節(jié)段含有單一的 HindIII和NdeI酶切位點(diǎn)，使用含有突變的HA節(jié)段的重組質(zhì)粒和分別含有另外7個節(jié)段的重 組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，捶救重組病毒；
[0023] 5 '-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-3 '
[0024] 5 '-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-3 ' 和 [00 巧]5 '-CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3 '
[0026] 5，-GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3 '
[0027] 更優(yōu)選的，突變的HA節(jié)段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[002引在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟(1)構(gòu)建得到的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體祀Z的核 巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0029] 在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NSW及M基因節(jié) 段的核巧酸序列分別如SEQ ID NO.2-9所示。
[0030] 相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0031] 本發(fā)明采用了人源的EFl-a和poll啟動子創(chuàng)造出了優(yōu)化的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體， EFl-a啟動子和BGH poly A信號位于poll啟動子和終止子外側(cè)且兩個啟動子的轉(zhuǎn)錄方向相 對，并在poll啟動子和終止子之間含有兩個BsmBI酶切位點(diǎn)W便于插入外源DNA片段，具有 利用同一模板轉(zhuǎn)錄出HiRNA和負(fù)鏈RNA的功能，可W應(yīng)用于負(fù)鏈RNA病毒的研究中，建立反向 遺傳系統(tǒng)。本發(fā)明將其運(yùn)用于EIV化89株及其變異體的反向遺傳學(xué)中，成功捶救了EIV JL89。并且此系統(tǒng)與國內(nèi)現(xiàn)有的P抓系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)可W大量捶救第一代病毒，其滴度是 P抓系統(tǒng)的19倍，顯著高于地D系統(tǒng)，產(chǎn)毒量更高。
【附圖說明】
[0032] 圖1為雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體祀Z的構(gòu)建示意圖；
[0033] 圖2為祀Z-VEGFP的構(gòu)建示意圖；
[0034] 圖3為綠色巧光的檢測結(jié)果；
[0035] 圖4為負(fù)鏈RNA完整性檢測結(jié)果；
[0036] 圖5為擴(kuò)增的8個片段的電泳檢測結(jié)果；
[0037] 圖6為HA節(jié)段的酶切鑒定結(jié)果；
[003引圖7為在MDCK細(xì)胞中的生長動力學(xué)曲線；
[0039] 圖8為采用祀Z系統(tǒng)W及地D系統(tǒng)捶救病毒滴度的測定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但運(yùn)些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但運(yùn)些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0041] 本發(fā)明W下實(shí)施例中所設(shè)及的主要試劑和實(shí)驗(yàn)材料
[0042] 1、病毒株和細(xì)胞
[0043] A/equine/Jilin/1/1989化3N8)病毒株(簡稱化89)已記載在文獻(xiàn)（黑龍江省一株 馬流感病毒的全基因組測序及同源性分析，趙創(chuàng)等，《中國動物檢疫》，2015年12期），現(xiàn)由中 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存、提供;HEK293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0044] 2、主要試劑
[0045] pEF4/myc-His B質(zhì)粒、Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自invitrogen公司；T4RNA連接酶、Phusion DNA聚合酶、限制性內(nèi)切核酸酶 購自化W England Biolabs公司；病毒RNA提取試劑盒購自Qiagen公司；PMD18-T載體購自 化KaRa公司；P抓載體由陳化蘭研究員惠贈；SPF雞胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究 所。
[0046] 實(shí)施例1雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的構(gòu)建及功能鑒定
[0047] 1、雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的構(gòu)建
[004引如圖1所示，W真核表達(dá)載體祀FVmyc-His B為骨架進(jìn)行改造:在其Kpn巧郵ClI酶 切位點(diǎn)之間插入必需元件（Insert 1，序列如SEQ ID NO. 11所示）--鼠源的poll終止子 (化011，33bp)、BsmBI酶切位點(diǎn)和人源的poll啟動子(PpolI，236bp)序列；在其SphI和BspQI 酶切位點(diǎn)之間插入一段短的Linker序列（Insert 2，序列為5'-CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3'），替換原載體上從flori到SV40poly A信號之間的非必需元件。改造后的載體命名為 祀z，其核巧酸序列如SEQ ID NO. I所示。
[0049] 2、攜帶報(bào)告基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建
[0050] 在pEZ載體中插入報(bào)告基因 W驗(yàn)證其雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)功能。使用引物對（5 ' -TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGATATTTAAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'（BsmBI)/5 '-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3 '（BsmBI ))，WEGFP基因 為模板，利用PCR方法獲得報(bào)告基因（vEGFP，765bp)，其5 '末端和3 '末端分別融合上EIV 化89株M節(jié)段的5'非編碼區(qū)（5'UTR)和3'非編碼區(qū)（3'UTR)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsmBI酶切后定 向插入于祀Z載體的BsmBI之中，構(gòu)建重組質(zhì)粒(pEZ-vEGFP)(圖2)。
[0化1] 3、綠色巧光的檢測
[0052] 按照Lipofectamin 2000說明書，將重組質(zhì)粒pEZ-vEGFP轉(zhuǎn)染豐度達(dá)90% W上的 293T細(xì)胞，加后換液，4化后置于倒置巧光顯微鏡下觀察綠色巧光。實(shí)驗(yàn)中同時設(shè)置空載體 對照。
[0化3] 4、負(fù)鏈RNA完整性的檢測
[0化4] 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4化后使用TRIzol提取細(xì)胞中的總RNADWunil2(5'-AGCAAAAGCAGG-3'） 為反轉(zhuǎn)錄引物，W引物對M-F/M-R(表1)為擴(kuò)增引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增vEGFP，克隆于 PMD18-T載體并測序驗(yàn)證。
[0055] 同時，利用RNA連接技術(shù)使RNA分子環(huán)化，WO-vEGFP F(5'-CTGCTGCCCGACAACCACTACCTGA-3 '）為反轉(zhuǎn)錄引物，W 引物對0-vEGFP F/O-vEGFP R(5 ' -GTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTC-3'）為擴(kuò)增引物，通過RT-PCR方法擴(kuò)增vEGFP的非編碼區(qū)，克隆 于PMD18-T載體并測序驗(yàn)證。
[0056]結(jié)果：
[0057]雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體祀Z改造自真核表達(dá)載體祀F4/myc-化S B，在其poll啟動子和 poll終止子序列之間含有兩個BsmBI酶切位點(diǎn)W便于定向克隆外源DNA片段，其EFl-a啟動 子和BGH poly A信號位于poll啟動子和poll終止子外側(cè)且兩個啟動子的轉(zhuǎn)錄方向相對（圖 1)。其中EFl-a啟動子和BGH poly A信號可W指導(dǎo)mRNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯出蛋白；而poll啟 動子和POl I終止子能夠控制負(fù)鏈RNA的轉(zhuǎn)錄。
[005引為了驗(yàn)證祀Z載體具有利用同一模板轉(zhuǎn)錄出mRNA和負(fù)鏈RNA的功能，構(gòu)建重組質(zhì)粒 祀Z-vEGFP，其vEGFP由5 ' UTR，EGFP和3 ' UTR組成（圖2)。祀Z-vEGFP和祀Z分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞， 4化后觀察綠色巧光。祀Z-VEGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可W觀察到綠色巧光，而祀Z轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有綠 色巧光（圖3)。運(yùn)表明pEZ-vEGFP在細(xì)胞內(nèi)W vEGFP為模板轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，進(jìn)而翻譯出 EGFP蛋白。
[0化9] 一方面，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增(RT組)和直接PCR擴(kuò)增(No RT 組）。其中，僅pEZ-vEGFP轉(zhuǎn)染后可W經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出與陽性對照(+Ctr 1)相符的條帶，而其 他處理不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖4A)，并且測序結(jié)果與vEGFP序列一致。另一方面，提取的RNA 分子經(jīng)RNA連接酶作用后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。其中pEZ-vEGFP轉(zhuǎn)染后能夠擴(kuò)增出與預(yù)期 (212bp)相符的條帶，而祀Z轉(zhuǎn)染后不能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖4B)。此外測序結(jié)果與預(yù)期一致 (圖4C)。運(yùn)表明祀Z-vEGFP在細(xì)胞內(nèi)WvEGFP為模板轉(zhuǎn)錄出完整的具有精確的5'UTR和3'UTR 的負(fù)鏈RNA。
[0060] W上結(jié)果表明祀Z載體具有雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)功能，可W利用同一模板表達(dá)出相應(yīng)的 蛋白和轉(zhuǎn)錄出完整的負(fù)鏈RNA。
[0061 ] 實(shí)施例沈IV反向遺傳系統(tǒng)的建立
[0062] 1、攜帶病毒CDNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建和分子標(biāo)記的引入
[0063] 按病毒RNA提取試劑盒使用說明書提取EIV化89株的病毒RNA，Wunil2為反轉(zhuǎn)錄 引物，W各個節(jié)段相應(yīng)引物對(表1)為擴(kuò)增引物，使用RT-PCR方法擴(kuò)增8個基因節(jié)段(PB2， PB 1，PA，HA，NP，NA，M和NS)。各個節(jié)段經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(BsmBI或BsaI)酶切后，分別定 向克隆到pEZ的BsmBI之中，構(gòu)建得到8個重組質(zhì)粒，所含有的8個基因節(jié)段一PB2、PB1、PA、 HA、NP、NA、NSW及M基因節(jié)段的核巧酸序列分別如沈QIDN0.2-9所示。
[0064] 表1擴(kuò)增8個節(jié)段的引物
[00 化]
[0066] 此外，使用引物對S'-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-S'/S'-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-S ' 和5 ' -CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3 ' /5 ' -GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3'，對野生型(Wt)HA節(jié)段進(jìn)行無義點(diǎn)突變(T449C和C 983T),構(gòu) 建含有突變型(mutant)HA節(jié)段的重組質(zhì)粒，使其HA節(jié)段含有單一的化ndin和NdeI酶切位 點(diǎn)，突變后的HA節(jié)段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
[0067] 結(jié)果：
[0068] 提取病毒RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增8個節(jié)段（圖5)，將其分別克隆至pEZ載體的BsmBI之 中，構(gòu)建8個重組質(zhì)粒。
[0069] 2、重組病毒的捶救
[0070] 使用含有突變的HA節(jié)段的重組質(zhì)粒和分別含有另外7個節(jié)段的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，捶救重組病毒。按照Lipofectamin 2000說明書，將8個重組質(zhì)粒各0.扣g(共化g)和10化 脂質(zhì)體分別溶于250化化ti-MEM中，二者混勻，逐滴加入到六孔板中豐度達(dá)90% W上的 293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染化后換液為無抗無血清的化ti-MEM，轉(zhuǎn)染30h后加入終濃度為250ng/mL的 TPCK-膜酶，轉(zhuǎn)染4她后收獲上清，將其作為第一代重組病毒(dL89)。使用9~11日齡SPF雞 胚擴(kuò)大培養(yǎng)rJL89，7化后收獲尿囊液，使用1 %雞紅細(xì)胞測定其血凝效價。
[007。結(jié)果：
[0072] 利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建HA節(jié)段上含有化ndIII和NdeI酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒。將該 質(zhì)粒與另外7個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞捶救重組病毒，在雞胚中復(fù)制后HA效價達(dá)到2 8。運(yùn)說明 捶救出重組病毒(dL89)。
[0073] 實(shí)施例3重組病毒的鑒定
[0074] 1、重組病毒的序列測定和其分子標(biāo)記的檢測
[0075] 按照實(shí)施例2方法1中所述引物和方法擴(kuò)增rJL89的8個節(jié)段，克隆至PMD18T載體， 測定各個節(jié)段序列，并與化89各個節(jié)段序列進(jìn)行比對分析。同時，使用限制性內(nèi)切酶 Hindi H和NdeI對HA節(jié)段進(jìn)行酶切鑒定。
[0076]結(jié)果：
[0077]克隆rJL89的8個節(jié)段，并測定其序列。dL89的各個節(jié)段與化89的比對顯示，HA節(jié) 段含有無義突變(T44化和C983T),與化89的HA節(jié)段一致性達(dá)99.9%;而PB2、PB1、PA、NP、NA、M 和NS與化89的相應(yīng)節(jié)段一致性達(dá)100%;運(yùn)說明rJL89的遺傳信息幾乎全部源自化89。
[007引 r化89的HA節(jié)段含有化ndin和NdeI酶切位點(diǎn)，W此為分子標(biāo)記區(qū)分捶救的重組病 毒株和親本毒株。利用限制性內(nèi)切酶化ndin和NdeI酶切該突變型(mutant)HA節(jié)段和野生 型（Wt)HA節(jié)段。結(jié)果顯示，突變型（mutant)HA可W被化ndllI切割為兩條帶（約44化P和1 319bp)，被NdeI切割為兩條帶（約78加 P和980bp)，被化ndIII和NdeI雙酶切為S條帶（約 446bp、534bp和78化P);而野生型(Wt)HA不能被切割，與陰性對照(-C化1)帶型相符（圖6)。 運(yùn)說明重組病毒rJL89已經(jīng)穩(wěn)定攜帶該分子標(biāo)記。
[0079] 2、病毒生長動力學(xué)測定
[0080] Wo. Olmoi的病毒量感染MDCK細(xì)胞，分別于感染后3、6、9、12、24、36、48、60和7化收 獲上清液。使用TCIDso法測定各個時間點(diǎn)的病毒滴度，將病毒液進(jìn)行倍比稀釋（i(ri~ 共11個稀釋度），各個稀釋度10化L接種8孔MDCK細(xì)胞，7化后統(tǒng)計(jì)各個稀釋度下出現(xiàn)細(xì)胞病 變的孔數(shù)，計(jì)算病毒滴度(TCI化日/mL)。W感染時間化ours post infection)為橫坐標(biāo)，W病 毒滴度（IgTCI化o/mL)為縱坐標(biāo)，繪制病毒生長曲線。并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各個時間點(diǎn) r化89和化89病毒滴度的差異。
[00川結(jié)果：
[0082] r化89經(jīng)雞胚擴(kuò)大培養(yǎng)后，其血凝效價達(dá)到28,與化89的血凝效價相同。運(yùn)表明 r化89保存了化89的血凝特性。
[0083] r化89和化89感染MDCK細(xì)胞后不同時間點(diǎn)收獲上清，并測定其病毒滴度，繪制生長 曲線（圖7)。從圖7結(jié)果可W看出:rJL89感染MDCK細(xì)胞后，在0~1化內(nèi)其病毒滴度緩慢增長； 在12~4她內(nèi)其病毒滴度迅速上升并達(dá)到峰值;之后維持在此滴度附近。運(yùn)與化89的生長特 性相同。盡管二者在各個時間點(diǎn)的病毒滴度有差別，但差異不顯著。運(yùn)表明該系統(tǒng)成功捶救 出具有感染性的病毒粒子，且在MDCK細(xì)胞上rJL89具有與化89相同的生長特性。
[0084] 實(shí)施例4pEZ系統(tǒng)捶救病毒能力的評估
[0085] 方法；
[0086] 利用祀Z系統(tǒng)和P抓系統(tǒng)（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，亦含有化89的全基因組，參考文獻(xiàn):Li Z,Chen H,Jiao P,Deng G,Tian G,Li Y,Hoffmann E,Webster RG,Matsuoka Y,Yu K.Molecular basis of replication of duck HSNlinfluenza viruses in a mammalian mouse model.J Virol.2005Sep;79(18):12058-64.化bMed PMID:16140781;PubMed Central PMCID:PMC1212590.)，使用實(shí)施例2方法2中所述方法捶救病毒。使用實(shí)施例3方法 2所述方法測定第一代病毒的滴度。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析二者差異。
[0087] 結(jié)果：
[0088] 使用pEZ系統(tǒng)和pBD系統(tǒng)同時捶救病毒，并測定第一代病毒的滴度。結(jié)果分別為 2.38X 10哺1.25 X IO4個TCIDso/mL，說明祀Z系統(tǒng)捶救病毒的滴度是P抓系統(tǒng)的19倍，二者 差異顯著（圖8)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體，其特征在于以真核表達(dá)載體pEF4/myc-His B為骨架進(jìn)行 改造：在所述pEF4/myC-His B載體的ΚρηΙ和Ben酶切位點(diǎn)之間插入鼠源的poll終止子、 BsmB頂每切位點(diǎn)和人源的poll啟動子序列；在其SphI和BspQI酶切位點(diǎn)之間插入一段短的 Linker序列，替換原載體上從fl ori到SV40poly A信號之間的非必需元件，所述的Linker 序列為5 ' -CTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG-3 '，將改造后的載體命名為pEZ。2. 如權(quán)利要求1所述的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體，其特征在于所述的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. -種馬流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于含有8個基于權(quán)利要求1或2所述 的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)質(zhì)粒而構(gòu)建的重組質(zhì)粒，分別表達(dá)野生型或突變型的馬流感病毒PB2、 PB1、？厶、擬、陬、嫩、吧以及1基因節(jié)段。4. 如權(quán)利要求3所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于所述的流感病毒PB2、PB1、PA、 HA、NP、NA、NS以及M基因節(jié)段的核苷酸序列分別如SEQIDN0.2-9所示。5. 如權(quán)利要求3所述的反向遺傳操作系統(tǒng)，其特征在于HA基因節(jié)段帶有Hindlll和Ndel 酶切位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。6. 權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的反向遺傳操作系統(tǒng)在馬流感病毒拯救中的用途。7. -種利用權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的反向遺傳操作系統(tǒng)拯救馬流感病毒的方法，其 特征在于包括以下步驟： (1) 雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的構(gòu)建 真核表達(dá)載體pEF4/myc-His B為骨架進(jìn)行改造:在所述pEF4/myc-His B載體的ΚρηΙ和 Bell酶切位點(diǎn)之間插入鼠源的poll終止子、BsmBI酶切位點(diǎn)和人源的poll啟動子序列;在其 SphI和BspQI酶切位點(diǎn)之間插入一段短的Linker序列，替換原載體上從flori到SV40poly A 信號之間的非必需元件，所述的1^111?^序列為5'-〇^^^^^了6066了666(：1'(^4了6-3'，將改造后 的載體命名為pEZ; (2) 攜帶病毒cDNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建和分子標(biāo)記的引入 提取A/equine/Jilin/1/1989株的病毒RNA，以unil2為反轉(zhuǎn)錄引物，以各個節(jié)段相應(yīng)引 物對為擴(kuò)增引物，使用RT-PCR方法擴(kuò)增8個基因節(jié)段:PB2，PB1，PA，HA，NP，ΝΑ，M和NS;各個節(jié) 段經(jīng)BsmBI或Bsa頂每切后，分別定向克隆到pEZ的BsmBI之中，構(gòu)建得到8個重組質(zhì)粒； 所述的引物序列如下所示：(3)重組病毒的拯救 使用步驟(2)構(gòu)建得到的8個節(jié)段的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，拯救重組病毒。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于還包括使用以下引物對對野生型HA節(jié)段進(jìn)行 T449C和C983T的無義點(diǎn)突變，構(gòu)建含有突變型HA節(jié)段的重組質(zhì)粒，使其HA節(jié)段含有單一的 Hindlll和Ndel酶切位點(diǎn)，使用含有突變的HA節(jié)段的重組質(zhì)粒和分別含有另外7個節(jié)段的重 組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，拯救重組病毒； 5 '-CTTCGCTGAAAGCTTCACTTGGACA-3 ' 5 '-TGTCCAAGTGAAGCTTTCAGCGAAG-3 ' 和 5 '-CAAGATCACATATGGAGCATGTCCC-3 ' 5 '-GGGACATGCTCCATATGTGATCTTG-3 ' 優(yōu)選的，突變的HA節(jié)段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟(1)構(gòu)建得到的雙向轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體pEZ的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于流感病毒ro2、PBl、PA、HA、NP、NA、NS&&MS 因節(jié)段的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.2-9所示。
【文檔編號】C12N7/01GK105861555SQ201610309169
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】王曉鈞, 張翔, 郭巍, 張振宇, 胡哲
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所