透明質(zhì)酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種透明質(zhì)酸的制備方法，其解決了現(xiàn)有方法產(chǎn)率不高的技術(shù)問題，其包括以下步驟：種子培養(yǎng)；菌體發(fā)酵；蛋白酶誘導(dǎo)表達；生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還提供了其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明可廣泛用于透明質(zhì)酸的制備領(lǐng)域。
【專利說明】
透明質(zhì)酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種高分子多糖的制備方法，具體說是一種透明質(zhì)酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)是由(1_β _4)D_ 葡糖醛酸(1-β_3)Ν_ 乙?；?D-氨基葡萄糖雙糖單位重復(fù)連接組成的高分子直鏈多糖。具有高保濕性、粘彈性和生物相容性等優(yōu)良性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、日化、食品等領(lǐng)域，是國內(nèi)外生物化工界熱點廣品之一O
[0003]目前，生產(chǎn)HA的方法主要有:動物組織提取法及獸疫鏈球菌發(fā)酵法。動物組織提取法原料來源有限且生產(chǎn)成本高，已逐漸被微生物發(fā)酵法取代。然而，近年來，原料價格上漲導(dǎo)致微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA成本的提高，HA的大規(guī)模生產(chǎn)面臨著巨大挑戰(zhàn)，進而限制了 HA在醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法的出發(fā)菌株為獸疫鏈球菌，是一種致病菌，潛在威脅相關(guān)從業(yè)人員的安全。而且，由于獸疫鏈球菌自身的生理代謝特性，使得HA產(chǎn)量的提高受到多方面因素的制約，如:高發(fā)酵粘度、低傳質(zhì)傳氧、菌體生長與HA生物合成競爭碳源與能量等。因此，如何用更高效、經(jīng)濟、安全的生產(chǎn)方法制備HA成為HA產(chǎn)業(yè)能否持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。
[0004]隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的成熟，HA的高效安全性生產(chǎn)有了長足的發(fā)展。有文獻報道:通過代謝工程手段，可以實現(xiàn)在安全的宿主生物中重建或改造生物合成途徑來生產(chǎn)HA的目標(biāo)。因此，大量的研究者開始研究基因工程菌制備HA的方法。
[0005]目前，應(yīng)用較廣泛的是全細胞催化技術(shù)。全細胞催化法的基本原理是利用完整的生物有機體作為催化劑進行化學(xué)轉(zhuǎn)化，將某種前體分子轉(zhuǎn)化成特定產(chǎn)物，其實質(zhì)是利用生物體系中酶的催化作用。主要技術(shù)路線為培養(yǎng)菌體并誘導(dǎo)菌體表達作為生物催化劑，然后加入底物并利用生物體系中酶及能量、代謝系統(tǒng)進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0006]Widner, B.等在枯草芽孢桿菌中成功表達鏈鎖狀球菌的HA合成基因，工程菌在搖瓶中發(fā)酵獲得0.5?0.6g/L HA。2008年美國麻省理工學(xué)院的St印hanopoulos G.研究組在大腸桿菌中優(yōu)化表達鏈鎖狀球菌的HA合成基因，獲得約0.2g/L的HA。2011年，專利號為CN 102154405 A的發(fā)明公開了一種大腸桿菌生產(chǎn)HA的方法，該方法在大腸桿菌中共表達透明質(zhì)酸合成酶基因hasA和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因hasB，發(fā)酵得到2.5g/L HA。是迄今報道的大腸桿菌工程菌合成HA的最高水平。但是該方法與發(fā)酵法仍有很大差距而難以獲得產(chǎn)業(yè)化運用。因為其HA產(chǎn)量及產(chǎn)率低、培養(yǎng)基成分復(fù)雜、成本高、發(fā)酵過程繁瑣、生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)條件嚴(yán)苛，嚴(yán)重制約了規(guī)?；a(chǎn)。
[0007]綜上所述，雖然目前HA制備仍多采用傳統(tǒng)發(fā)酵法，并已逐漸向全細胞催化技術(shù)發(fā)展。但仍存在一定的缺陷:(1)發(fā)酵過程要求嚴(yán)格的無菌條件，維持純種培養(yǎng)，避免雜菌的入侵，生產(chǎn)過程復(fù)雜；(2)生產(chǎn)過程受罐溫、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量、罐壓、液位、補料、加糖、PH、溶氧、培養(yǎng)基等條件及參數(shù)的限制；(3)發(fā)酵過程中參數(shù)監(jiān)測要及時，并需規(guī)范化控制生產(chǎn)過程，要求嚴(yán)格，操作復(fù)雜；(4)出發(fā)菌株為致病性的獸疫鏈球菌，對相關(guān)從業(yè)人員構(gòu)成潛在的威脅；(5)獸疫鏈球菌發(fā)酵制備HA存在一定的弊端，代謝復(fù)雜，副產(chǎn)物多，后續(xù)的分離純化工藝復(fù)雜；(6)目前采用全細胞催化技術(shù)制備HA多面臨著工藝過程復(fù)雜、產(chǎn)率低、難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)制備透明質(zhì)酸工藝過程復(fù)雜、產(chǎn)率低、難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)問題，提供一種以大腸桿菌工程菌高效制備透明質(zhì)酸的方法。
[0009]為此，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0010]全細胞催化法制備透明質(zhì)酸的方法，包括以下步驟:
[0011](I)種子培養(yǎng):將工程菌E.coli PBPAB/BW25113接種到LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度35-40°C，培養(yǎng)時間2-6h，轉(zhuǎn)速200-300r/min，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)接。
[0012](2)菌體發(fā)酵:將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30-37 °C，轉(zhuǎn)速200_300r/min，菌體密度(0D6_J至0.6-1.50D時，進行蛋白酶誘導(dǎo)。
[0013](3)蛋白酶誘導(dǎo)表達:添加0.l-2g/L誘導(dǎo)物L(fēng)-阿拉伯糖，同時降低誘導(dǎo)溫度至27-350C，轉(zhuǎn)速200-300r/min，培養(yǎng)16_20h，得到轉(zhuǎn)化菌體，并離心收集菌體。
[0014](4)生物轉(zhuǎn)化:用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體至10-400D，轉(zhuǎn)化溫度30-37 °C，轉(zhuǎn)速200-300r/min，用氨水每隔2_5h調(diào)節(jié)pH值至7.0-9.0，轉(zhuǎn)化16_24h，得含有透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)化液。
[0015]優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:酪蛋白l-10g/L ;酵母粉l_5g/L ;甘油l_8g/L ；NaCl 5-10g/L ;無機氮源 30_70mM。
[0016]優(yōu)選地，無機氮源包括:硫酸銨，氯化銨，硝酸銨，尿素，硝酸鉀，硝酸鈉。
[0017]優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖30-60g/L ；N-乙酰葡萄糖胺20_45g/L ;硫酸銨3-5g/L ;正十二烷2-7% ;硫酸鎂l_4mM ;氯化錳l_2mM ;磷酸氫二鉀15_20g/L ;磷酸二氫鉀 l-5g/Lo
[0018]現(xiàn)有的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA基本采用單一分批發(fā)酵模式，而本發(fā)明顛覆了這種常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)模式。通過采用分段的全細胞催化技術(shù)，將整個過程分兩個階段分別進行菌體生長及產(chǎn)物合成，有效地使HA產(chǎn)量提高至8.0g/L-10.0g/L。比傳統(tǒng)發(fā)酵法的6.0g/L-8.0g/L提高了 20% -30%,比目前全細胞催化法的3.0g/L,提高了 1.5-2.5倍，具有顯著的進步意義。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0020](I)本發(fā)明采用全細胞催化技術(shù)，生產(chǎn)過程中的反應(yīng)是通過生命體自動調(diào)節(jié)方式進行，可充分利用微生物代謝產(chǎn)生的ATP，避免了添加昂貴的ATP，從而使反應(yīng)過程更高效率、低成本、綠色環(huán)保。
[0021](2)本發(fā)明采用全細胞催化技術(shù)，轉(zhuǎn)化階段不要求無菌操作，轉(zhuǎn)化底物不要求進行高溫滅菌，避免了雜菌污染對生產(chǎn)過程的干擾以及高溫對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分的破壞。
[0022](3)本發(fā)明采用全細胞催化技術(shù)，轉(zhuǎn)化階段工藝要求簡單，生產(chǎn)過程無需控制罐溫、空氣流量、罐壓、液位、補料、加糖等，操作條件更溫和易控且有效節(jié)省了生產(chǎn)成本。
[0023](4)本發(fā)明以大腸桿菌為出發(fā)菌株，生產(chǎn)過程中不會產(chǎn)生毒素和透明質(zhì)酸酶，保證了 HA產(chǎn)品的安全性及高分子量。
[0024](5)本發(fā)明培養(yǎng)基組分簡單明了，減少了菌體的副反應(yīng)，便于后續(xù)分離純化工藝。
[0025](6)本發(fā)明最大程度的簡化了培養(yǎng)基組分，減少了各種營養(yǎng)成分的用量，極大地降低了生產(chǎn)成本。
[0026](7)本發(fā)明采用甘油作為發(fā)酵階段的唯一碳源，并輔配一定濃度的無機氮源，顯著提高了透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)率，可達8.0-10.0g/L。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下面實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。本說明書中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。
[0028]本發(fā)明中所用的工程菌E.coli pBPAB/BW25113制備方法如下:
[0029]本發(fā)明用一種表達透明質(zhì)酸合成酶基因(hyaluronic acid synthase, hasA)和尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因(UDP-glucose Dehydrogenase, hasB)的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌PBPAB/BW25113來生產(chǎn)透明質(zhì)酸。
[0030]含有透明質(zhì)酸合成酶基因和UDP-萄糖脫氫酶基因的高效產(chǎn)透明質(zhì)酸工程大腸桿菌是通過以下方法構(gòu)建獲得的:
[0031]—、含多殺巴氏桿菌的透明質(zhì)酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脫氫酶基因PmhasB的共表達載體pBPAB的構(gòu)建
[0032]以多殺巴氏桿菌CVCC 408的基因組DNA為模版，PCR擴增PmhasA和PmhasB基因，各自的PCR反應(yīng)條件如下:
[0033]PmhasA:95°C預(yù)變性2min，然后每個循環(huán)95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，共35個循環(huán)，最后延伸5min ；
[0034]PmhasB:95°C預(yù)變性2min，然后每個循環(huán)95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸Imin,共35個循環(huán)，最后延伸5min。
[0035]用Nco I和BamH I對透明質(zhì)酸合成酶基因PmhasA的擴增產(chǎn)物進行雙酶切，用BamH I和Sac I對UDP-葡萄糖脫氫酶基因PmhasB的擴增產(chǎn)物進行雙酶切，用Nco I和Sac I對載體pBAD-HisB進行雙酶切。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收DNA片段。采用T4連接酶將上述3個片段連接，16°C過夜。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，涂布于氨芐平板(100 μ g/mL)。挑選單克隆，進行菌落PCR鑒定(上游引物為PmhasA-F和下游引物為PmhasB-R)，挑選陽性克隆(PCR片段在4000-5000bp)提質(zhì)粒，送上海生工進行測序鑒定。重組載體記作ρΒΡΑΒο
[0036]二、重組菌的構(gòu)建
[0037]pBPAB/BW25113菌液的獲得:從大腸桿菌BW25113平板上挑選單克隆接種到5ml的LB培養(yǎng)基中，在37°C，200rpm的條件下培養(yǎng)至OD6。。為0.3-0.4之間，冰上放置lOmin，然后4000rpm離心lOmin，棄上清，菌體用預(yù)冷的氯化|丐溶液(0.lmol/L CaCl2)洗滌，4000rpm離心lOmin，菌體懸浮于200 μ I的氯化鈣溶液中。將測序鑒定正確的質(zhì)粒ρΒΡΑΒ加入到上述感受態(tài)細胞中，冰浴30min，于42°C熱休克90s，加入500 μ I的LB培養(yǎng)基，在37°C，200rpm條件下培養(yǎng)lh，取50 μ I涂布在氨芐平板上，37°C培養(yǎng)過夜。挑選單克隆，接種到5ml的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，所得為PBPAB/BW25113的菌液。
[0038]菌種保藏:500 μ I的上述菌液與50%的無菌甘油等體積混勻，保存在_70°C冰箱。
[0039]本發(fā)明通過共表達透明質(zhì)酸合成酶基因和含有UDP-葡萄糖脫氫酶基因的重組E.coli PBPAB/BW25113，并利用簡單糖類及簡化工藝合成透明質(zhì)酸。大腸桿菌BW25113購自于普如汀生物技術(shù)有限公司。
[0040]實施例1
[0041]—種全細胞催化法制備透明質(zhì)酸的工藝過程如下:
[0042](I)種子培養(yǎng):將工程菌E.coli pBPAB/BW25113甘油管菌種按I %接種量接種到裝有滅菌LB培養(yǎng)基10mL的500mL搖瓶中添加100mg/L的Amp，然后35°C培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)速200r/min，觀察菌體生長情況，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)接。
[0043](2)菌體發(fā)酵:按I %接種量將搖瓶種子液接種到裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基10mL的500mL 搖瓶中(酪蛋白 10.0g/L、酵母粉 5.0g/L、甘油 1.0g/L, NaCl 10.0g/L、尿素 30mM)，然后37°C、轉(zhuǎn)速200r/min培養(yǎng)3h至菌體OD為0.6。
[0044](3)蛋白酶誘導(dǎo)表達:添加2.0g/L誘導(dǎo)物L(fēng)-阿拉伯糖，降低溫度至35°C，轉(zhuǎn)速250r/min，培養(yǎng)16h，6000r離心15min收集菌體。
[0045](4)生物轉(zhuǎn)化:按如下配方配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖30g/L ;N-乙酰葡萄糖胺20g/L ;硫酸銨5g/L ;正十二烷2%;硫酸鎂ImM ;氯化錳2mM ;磷酸氫二鉀15g/L ;磷酸二氫鉀5g/L0然后用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體，制備成100D的菌懸液，30°C、轉(zhuǎn)速300r/min進行轉(zhuǎn)化。過程中用氨水每隔5h調(diào)節(jié)pH值至9.0，轉(zhuǎn)化24h。
[0046]經(jīng)測定，本實施例所制備的透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化液中，HA產(chǎn)量為8.3g/L。
[0047]實施例2:
[0048](I)種子培養(yǎng):將工程菌E.coli pBPAB/BW25113甘油管菌種按I %接種量接種到裝有滅菌LB培養(yǎng)基10mL的500mL搖瓶中添加100mg/L的Amp，然后37°C培養(yǎng)4h，轉(zhuǎn)速300r/min，觀察菌體生長情況，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)接。
[0049](2)菌體發(fā)酵:按I %接種量將搖瓶種子液接種到裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基10mL的500mL 搖瓶中(酪蛋白 5.0g/L、酵母粉 3.0g/L、甘油 5.0g/L, NaCl 7.0g/L、硝酸銨 50mM)，然后35°C、轉(zhuǎn)速250r/min培養(yǎng)4h至菌體OD為1.2。
[0050](3)蛋白酶誘導(dǎo)表達:添加1.0g/L誘導(dǎo)物L(fēng)-阿拉伯糖，降低溫度至33°C，轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)18h，6000r離心15min收集菌體。
[0051](4)生物轉(zhuǎn)化:按如下配方配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖45g/L ;N-乙酰葡萄糖胺30g/L ;硫酸銨5g/L ;正十二烷5%;硫酸鎂4mM ;氯化錳ImM ;磷酸氫二鉀18g/L ;磷酸二氫鉀3g/L0然后用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體，制備成300D的菌懸液，33°C、轉(zhuǎn)速200r/min進行轉(zhuǎn)化。過程中用氨水每隔2h調(diào)節(jié)pH值至8.0，轉(zhuǎn)化16h。
[0052]經(jīng)測定，本實施例所制備的透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化液中，HA產(chǎn)量為8.8g/L。
[0053]實施例3:
[0054](I)種子培養(yǎng):將工程菌E.coli pBPAB/BW25113甘油管菌種按I %接種量接種到裝有滅菌LB培養(yǎng)基10mL的500mL搖瓶中添加100mg/L的Amp，然后40°C培養(yǎng)2h，轉(zhuǎn)速250r/min，觀察菌體生長情況，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)接。
[0055](2)菌體發(fā)酵:按I %接種量將搖瓶種子液接種到裝有滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基10mL的500mL 搖瓶中(酪蛋白 1.0g/L、酵母粉 1.0g/L、甘油 8.0g/L, NaCl 5.0g/L、硫酸銨 70mM)，然后30°C、轉(zhuǎn)速200r/min培養(yǎng)5h至菌體OD為1.5。
[0056](3)蛋白酶誘導(dǎo)表達:添加0.lg/L誘導(dǎo)物L(fēng)-阿拉伯糖，降低溫度至27°C，轉(zhuǎn)速300r/min，培養(yǎng)20h，6000r離心15min收集菌體。
[0057](4)生物轉(zhuǎn)化:按如下配方配制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖60g/L ;N-乙酰葡萄糖胺45g/L ;硫酸銨3.0g/L ;正十二烷4% ;硫酸鎂3mM ;氯化錳2mM ;磷酸氫二鉀20g/L ;磷酸二氫鉀
1.0g/L。然后用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體，制備成100D的菌懸液，33°C、轉(zhuǎn)速300r/min進行轉(zhuǎn)化。過程中用氨水每隔5h調(diào)節(jié)pH值至7.0，轉(zhuǎn)化16h。
[0058]經(jīng)測定，本實施例所制備的透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化液中，HA產(chǎn)量為9.8g/L。
[0059]從以上實施例中可見，本發(fā)明進行HA生產(chǎn)，產(chǎn)量高達8-10g/L，大大提高了大腸桿菌工程的HA合成能力，為規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【主權(quán)項】
1.一種透明質(zhì)酸的制備方法，其特征是包括以下步驟: (1)種子培養(yǎng):將工程菌E.coli PBPAB/BW25113接種到LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度35-40°C，培養(yǎng)時間3-6h，轉(zhuǎn)速200-300r/min，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長期時進行轉(zhuǎn)接； (2)菌體發(fā)酵:將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30-37°C，轉(zhuǎn)速200-300r/min，菌體密度至0.6-1.5 OD時，進行蛋白酶誘導(dǎo)； (3)蛋白酶誘導(dǎo)表達:添加0.l_2g/L誘導(dǎo)物L(fēng)-阿拉伯糖，同時降低誘導(dǎo)溫度至27-35°C，轉(zhuǎn)速200-300r/min，培養(yǎng)16_20h，得到轉(zhuǎn)化菌體，并離心收集菌體； (4)生物轉(zhuǎn)化:用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基重懸菌體至10-400D,轉(zhuǎn)化溫度30-37°C，轉(zhuǎn)速200_300r/min，用氨水每隔2-5h調(diào)節(jié)pH值至7.0-9.0，轉(zhuǎn)化16_24h，得含有透明質(zhì)酸的轉(zhuǎn)化液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:酪蛋白l-10g/L ;酵母粉l_5g/L ;甘油l-8g/L ;NaCl5-10g/L ;無機氮源 30-70mM ； 所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成成分為:葡萄糖30-60g/L ；N-乙酰葡萄糖胺20-45g/L ;硫酸銨3-5g/L ;正十二烷2-7% ;硫酸鎂l_4mM ;氯化錳l_2mM ;磷酸氫二鉀15_20g/L ;磷酸二氫鉀l-5g/Lo2.—種用于制備透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:酪蛋白l-10g/L ;酵母粉 l_5g/L ;甘油 l-8g/L ；NaCl 5-10g/L ;無機氮源 30_70mM。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基，其特征在于所述無機氮源包括:硫酸銨，氯化銨，硝酸銨，尿素，硝酸鉀，硝酸鈉。4.一種用于制備透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基，其特征是轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成成分為葡萄糖30-60g/L ；N-乙酰葡萄糖胺20-45g/L ;硫酸銨3_5g/L ;正十二烷2_7% ;硫酸鎂l_4mM ;氯化錳l_2mM ;磷酸氫二鉀15-20g/L ;磷酸二氫鉀l_5g/L。
【文檔編號】C12P19/26GK105861596SQ201510035560
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月23日
【發(fā)明人】晏禮明, 陶勇, 張叢叢, 陳笑, 溫雅, 陳彩霞
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所