一種成株期小麥紋枯病的鑒定評價方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種成株期小麥紋枯病的鑒定評價方法，是在小麥拔節(jié)期將布滿小麥紋枯病菌絲的牙簽嵌入到基部第1～2葉鞘之間，彌霧器噴水保濕7d，在乳熟期調(diào)查統(tǒng)計紋枯病發(fā)病程度；計算病情指數(shù)，根據(jù)鑒定材料與對照品種的病情指數(shù)進行比較對鑒定材料進行抗紋枯病性評價。
【專利說明】-種成株期小麥紋枯病的鑒定評價方法 -、技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明設及農(nóng)作物病害抗性鑒定方法，具體說是一種成株期小麥紋枯病抗性鑒定 方法，屬于植物保護領域。 二、【背景技術(shù)】
[0002] 小麥紋枯病，又稱小麥尖眼點?。╳heat sharp eyespot)，是由絲核菌中 I^iizactonia cereal is或I^iizactonia SOIani所引起的一種±傳真菌病害（陳延熙，1986; 夏正俊，1989 )，幾乎遍及世界各小麥種植區(qū)。中國是小麥紋枯病發(fā)生和危害較為嚴重的國 家（陳炳章，1975)。近年來，由于耕作制度和氣候的變化，加上感病品種大面積使用和紋枯 病菌累積，危害面積迅速擴大，1992年發(fā)病面積達3.6 X 106hm2，約占全國麥播面積的1/8， 2005年發(fā)病面積約為8.051 X 106hm2,占全國小麥種植面積的1/3W上(2005年中國農(nóng)業(yè)年 鑒）。小麥紋枯病已成為當前影響我國小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要病害之一。
[0003] 篩選紋枯病抗源，選育和使用抗紋枯病小麥新品種無疑是解決運一問題最有效、 最經(jīng)濟的途徑。而簡便有效的小麥紋枯病抗性鑒定技術(shù)體系的建立是開展上述研究的前提 與關鍵。研究表明，在小麥生育進程中紋枯病主要有兩個發(fā)病時期，即苗期和拔節(jié)孕穗期， 其中W拔節(jié)孕穗期的紋枯病危害對小麥的產(chǎn)量影響最大。目前已有不同的學者申請獲得了 有關小麥苗期紋枯病抗性鑒定評價方法的專利，但尚無小麥成株期紋枯病鑒定評價標準方 法的報道。小麥苗期鑒定通常在=葉期進行人工接種，根據(jù)幼苗長勢在接種20d-30d后進行 病情調(diào)查的一種鑒定評價方法。該法雖然可W有效地對苗期小麥紋枯病抗性進行鑒定評 價，但由于小麥苗期與成株期的紋枯病抗性機制不同，其苗期抗性無法真實地反應小麥紋 枯病成株期的抗性，同時由于病情調(diào)查時期迴異，其相應的病害分級標準也顯著不同。因 此，開展小麥成株期紋枯病抗性鑒定方法研究對推動當前小麥紋枯病研究意義重大。
[0004] 小麥紋枯病成株期抗性鑒定是一種在拔節(jié)期進行人工接種、在乳熟期調(diào)查統(tǒng)計紋 枯病發(fā)病情況的鑒定方法。目前小麥成株期紋枯病抗性鑒定的方法主要有:溝帶接種法、± 表接種法、牙簽嵌入法=種方法。其中，溝帶接種法:首先制作帶菌麥粒，選飽滿無病麥粒， 浸泡吸漲后置于雙層塑料袋中，滅菌后接種菌絲培養(yǎng)15~20d(25°C)，期間定期翻動麥粒， 待菌絲體均勻長滿麥粒，備用。接種時期在小麥播種時，將種子和帶菌麥粒一起均勻施于播 種溝內(nèi)，接種量約為50g/m帶菌麥粒;±表接種法:帶菌麥粒的制作同溝帶接種法，接種時期 選擇在小麥返青期，首先將上表噴濕，然后將帶菌麥粒均勻撒施于麥苗基部，接種量約為 50g/m帶菌麥粒，接種后結(jié)合松±將麥?；烊霚\表±層，根據(jù)墻情采取保濕措施，W確保表 ±濕潤5dW上；牙簽嵌入接種法:選市售的木質(zhì)牙簽折成兩半約1.5cm長。水泡12h后煮沸 30min，排在燒杯里，加入適量PDA液體培養(yǎng)基(淹沒牙簽1/2)，滅菌后接種培養(yǎng)20d (25 °C )， 待菌絲密集地布滿牙簽時，用于田間接種。接種時期掌握在小麥拔節(jié)期，基部節(jié)間定長時， 接種中間10株，每株接種3個莖桿，選擇貼近地面葉銷，用綴子將短牙簽輕輕嵌入葉銷與莖 桿之間，并在相應莖桿掛好標牌，接種后噴霧保濕5d。
[0005] 溝帶接種法由于接種時間是在播種時期，環(huán)境溫度較低，不利于紋枯病菌的生長， 且±壤中其他微生物會對紋枯病菌產(chǎn)生括抗作用，因此利用該法接種發(fā)病率較低;±表接 種法是另一種間接接種法，因此存在病原物播撒不均勻、始病時間不統(tǒng)一、始病時間較長等 缺點，由于接種點較為隨機，調(diào)查莖桿只能隨機選擇，無法確定是由于人工接種導致的發(fā)病 還是田間自然發(fā)病。因此，通過間接種法鑒定小麥紋枯病抗性受環(huán)境影響較大，穩(wěn)定性較 差。在運=種方法當中，牙簽嵌入接種法是一種直接將病原菌與接種材料直接接觸的鑒定 方法，該法克服了上述兩種間接接種方法的缺點，在拔節(jié)期接種，乳熟期調(diào)查接種莖桿的發(fā) 病等級，從而計算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)來評價鑒定材料的紋枯病抗性差異，但是，由于 小麥紋枯病是一種±傳真菌病害，其發(fā)生、擴展容易受周圍的環(huán)境的影響，W致于因年份、 地點的變化而造成鑒定結(jié)果差異較大的現(xiàn)象時有發(fā)生。因此，鑒于目前小麥紋枯病牙簽嵌 入接種法所存在的一些技術(shù)缺陷，本方法進一步規(guī)范了小麥成株期紋枯病抗性鑒定的評價 技術(shù)體系，W實現(xiàn)對成株期小麥紋枯病抗性的準確鑒定與評價，滿足當前小麥紋枯病研究 的迫切需要。 H、【附圖說明】
[0006] 圖1為未發(fā)病牙簽飯盒照片和長滿菌絲的牙簽飯盒照片；
[0007] 圖2為田間牙簽接種示意圖。 四、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于:提供一種利用牙簽在拔節(jié)期接種，乳熟期調(diào)查病情指數(shù)，并設 立對照品種，通過鑒定材料與對照品種的病害指數(shù)進行比較來評價小麥成株期紋枯病抗性 鑒定方法。牙簽嵌入接種法克服了利用病麥粒進行接種，對病麥粒接種數(shù)量無法控制，始病 時間不統(tǒng)一，無法將接種莖桿與調(diào)查莖桿一一對應等缺點，同時設立抗性對照品種，克服了 由于年份、環(huán)境變化而造成抗性評價差異較大的弊病。
[0009] 其中，抗性對照品種Niavtl4、寧麥9號和揚麥158均選自本實驗室經(jīng)過多年成株期 鑒定表現(xiàn)為抗、中抗和感病的代表性品種，并已為大家接受并廣泛應用于小麥紋枯病抗性 研究中。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案是通過在小麥拔節(jié)后，將制備好的帶菌牙簽嵌入小麥基部葉銷 內(nèi)，乳熟期記載接種莖桿的發(fā)病等級，計算小麥紋枯病病情指數(shù)，并通過與對照抗性品種的 病情指數(shù)的比較來評價參試材料的紋枯病抗性。
[0011] 本發(fā)明的具體步驟、流程和基本特征是：
[0012] (1)將代表性強致病力小麥紋枯病菌(化izactonia cerealis)菌種置于PDA固體 培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，獲得菌絲。
[001引（2)將木質(zhì)牙簽浸泡24小時，由于市售牙簽為了防腐，均經(jīng)過了甲醒的浸泡，將牙 簽浸泡消除了甲醒對紋枯病培養(yǎng)的影響，對折，牙簽尖頭朝上直立整齊放入不誘鋼飯盒中， 配制PDA培養(yǎng)基，將牙簽與培養(yǎng)基常規(guī)高壓蒸汽滅菌后，在超凈工作臺上將滅菌后未冷卻的 PDA培養(yǎng)基倒入飯盒，使其將牙簽1/2浸沒。倒入飯盒的PDA培養(yǎng)基數(shù)量要適宜，過多，則留下 可W長滿菌絲的部位少，不能獲得足夠的接種菌量，倒入的培養(yǎng)基過少，則接種時活化的菌 株不易接觸到培養(yǎng)基，不利于菌絲的生長，使倒入的培養(yǎng)基浸沒牙簽的1/2處既方便接種操 作又利于菌絲的生長。將牙簽尖頭朝上排布與飯盒內(nèi)，紋枯病菌絲會在尖頭部位生長，由于 接種時是將帶菌端嵌入葉銷和莖桿中間，尖頭較平頭更有利于嵌入狹小的空間。待浸沒牙 簽的PDA培養(yǎng)基冷卻后，將事先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)好的小麥紋枯病菌菌株無菌操作移入含牙 簽的PDA固體培養(yǎng)基中，每個飯盒移入大小為IcmX Icm的布滿菌絲的培養(yǎng)基塊5塊，5塊帶菌 培養(yǎng)基在含牙簽的PDA固體培養(yǎng)基中均勻分布，接種后用封口膜封住飯盒，再放入25°C恒溫 箱中培養(yǎng)Hd~21d，培養(yǎng)過程中每隔7d在超凈工作臺上查看菌絲生長情況，待菌絲長滿牙 簽后形成有菌牙簽備用。每個飯盒移入5塊布滿菌絲的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基成梅花狀接種到飯 盒內(nèi)PDA培養(yǎng)基上，是一種較為均勻的接種方式，可W保證飯盒內(nèi)的牙簽可W均勻的布滿菌 絲;接種后用封口膜將飯盒蓋和盒體接觸處封住和查看過程中在超凈工作臺上操作均是為 了防止雜菌的侵入;培養(yǎng)過程中每隔7d查看生長情況，是為了避免接種失敗便于及時重新 接種，保證接種成功率。
[0014] (3)在小麥拔節(jié)期，用消毒綴子夾取有菌牙簽，將牙簽攜帶菌絲的尖頭一端輕輕地 嵌入麥苗基部第1~2葉銷之間，在該位置接種可W利用葉銷內(nèi)部及±表的濕潤環(huán)境，便于 接種菌絲的生長與初始侵染，每個葉銷嵌入一個有菌牙簽，每份材料接種30個莖桿，接種后 立即對接種材料進行彌霧保濕，W保證牙簽接種后所需的濕度，每天噴水一次，連續(xù)噴水 7d，滿足紋枯病菌菌絲從接種到初始侵入對環(huán)境濕度的需求，然后對接種材料進行正常的 田間管理。
[0015] (4)乳熟期調(diào)查嵌有接菌牙簽莖桿的紋枯病病害等級。病情分級標準如下：
[OOW 0級:全株無??；
[0017] 1級:葉銷有典型的紋枯病病斑，但不侵莖；
[0018] 2級:病菌侵入莖桿，但病斑寬度不超過莖桿周長的1/4;
[0019] 3級:病菌侵入莖桿，病斑寬度占莖桿周長的1/4~1/2;
[0020] 4級:病菌侵入莖桿，病斑寬度占莖桿周長的1/2~3/4;
[0021] 5級：病菌侵入莖桿，病斑寬度超過莖桿周長的3/4,或莖桿已軟腐、出現(xiàn)枯孕穗或 枯白穗。
[0022] 化H+當對照品釉巧倍巧價材魁的紡姑痛痛信拾擲
[0023]
[0024] 式中XI、拉、X3、X4、枯分別表示紋枯病1級、2級、3級、4級、5級莖桿數(shù)；
[0025] (6)根據(jù)病情指數(shù)對參試材料的成株期紋枯病抗性進行評價：
[00%]抗性分級標準：
[0027]抗病(R): DKDIck-R;
[002引 中抗(MR) :DIck-r < DKDIck-MR;
[0029] 中感(MS):DIcmr<DKDIck-s;
[0030] 感病（S) :DI> DIck-So
[0031] 將待鑒定的小麥品種或品系的種子按照（3)步驟~（5)步驟在同一環(huán)境下至少再 進行一次重復鑒定，計算平均值，通過與對照品種的平均病情指數(shù)進行比較，來評價待鑒定 材料的紋枯病抗性差異。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點在于:該方法不僅可W保持接菌量的相對一致，還可W提供紋枯病 菌絲的初始侵入、定植所需的濕度，同時也便于乳熟期病情調(diào)查時做到接種莖桿與調(diào)查莖 桿一一對應。另外，=個已知抗紋枯病性顯著不同對照品種的引入，可W有效避免年份、環(huán) 境等因素對抗性評價帶來的不利影響。 五、【具體實施方式】
[0033] 實施例1
[0034] 紋枯病病原菌：將代表性強致病力小麥紋枯病菌（RMzactonia cerealis)菌株 R030U該菌株引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，具有較強的致病力，是目前南京地 區(qū)的優(yōu)勢菌株)在PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，7天后待用。
[0035] 帶菌牙簽制備：將牙簽浸泡24小時，對折，牙簽尖頭朝上直立整齊放入盒體中，配 審化DA培養(yǎng)基，將牙簽與培養(yǎng)基常規(guī)高壓蒸汽滅菌，在超凈工作臺上將滅過菌尚未冷卻的 PDA培養(yǎng)基溶液倒入飯盒，使其將牙簽1/2浸沒，待浸沒牙簽的PDA培養(yǎng)基冷卻后，將事先在 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)好的小麥紋枯病菌菌株R0301無菌操作移入含牙簽的PDA固體培養(yǎng)基中，每個 飯盒移入大小為IcmX Icm的布滿菌絲的培養(yǎng)基塊5塊，5塊帶菌培養(yǎng)基在含牙簽的PDA固體 培養(yǎng)基中均勻分布，接種后用封口膜封住飯盒，再放入25°C恒溫箱中培養(yǎng)14d~21d，培養(yǎng)過 程中每隔7d在超凈工作臺上查看菌絲生長情況，待菌絲長滿牙簽后形成有菌牙簽備用。
[0036] 實施例2
[0037] 田間彌霧保濕的條件下，利用本發(fā)明方法對包含抗性對照品種W及紋枯病抗性不 同的26個小麥品種(品系)進行了 3年成株期小麥紋枯病抗性鑒定。
[0038] 帶菌牙簽:通過實施例1獲得。
[0039] 將上述參試材料的種子于南京正季播種，行長1米，行距25cm，每行播種30粒種子， 重復2次，正常栽培管理。
[0040] 在拔節(jié)期(次年3月上旬），用消毒綴子夾取有菌牙簽，將攜帶菌絲一端輕輕地嵌入 麥苗基部第1~2葉銷之間（未攜帶菌絲的牙簽丟棄不用），每個葉銷嵌入一個有菌牙簽，每 行接種30個莖桿。接種后，立即采取彌霧噴灑措施對接種材料基部進行保濕，每天噴水一 次，連續(xù)噴水7d，然后對接種材料進行正常的田間管理。
[0041] 在乳熟期(約接種后60d)，對上述試驗材料進行紋枯病病情調(diào)查，并依據(jù)本發(fā)明所 述的抗性分級標準計算病情指數(shù)。
[0042] 結(jié)果表明：S個抗性對照品種(揚麥158、寧麥9號和Niavtl4)的平均病情指數(shù)在不 同的年份有所變化，但總體趨勢一致(表1)，運與小麥紋枯病在生產(chǎn)上的實際發(fā)生情況相符 厶 1=1 O
[0043] 表1參試材料不同年份的紋枯病抗性鑒定與評價
[0044]
[0045]
[0046] 巧2011、2012和2014平的成巧期紋巧病巧巧鑒足中，參巧巧料的病情指數(shù)變化范 圍較大，分別介于21.05%~75.88%、25.63%~69%和29.9%~63.33%之間，表明本發(fā)明 所述的方法能夠提供紋枯病發(fā)病所需的適宜條件，保證感病品種的充分發(fā)病。進一步對其 年份間的病情指數(shù)進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)其年份間的相關程度很高，它們的相關系數(shù)介于 0.74~0.87之間(表2)，表明該方法的鑒定結(jié)果在不同年份間具有較好的一致性與重復性。
[0047] 表2 26份參試材料年份間紋枯病病情指數(shù)的相關性
Luu-r'」 氣 ?把口口/十、處叩]巧| 乂口JXIU 工刀結(jié)^小1忙 tA/X]八I 工八J ；V^、口PMT口J I 舊]日莫義？ 對26份參試材料分別進行了成株期紋枯病的抗性評價，結(jié)果列于表1。
[0050]由表1可見，參試材料的抗性評價在不同年份間具有較好的一致性。如CI12633在 2011年抗性評價為中抗，在另外兩個年份均評價為抗，而ARz在=年的抗性評價中均為中 抗;徐州25在S年的抗性評價均為中感，而SN931則在2014年評價為中感，另外兩年均評價 為感病。運與它們在已有報道的抗性程度相吻合。綜上所述，本發(fā)明所述的方法可W有效地 應用在小麥成株期紋枯病抗性鑒定研究中，且具備重復性好、可靠度高等優(yōu)點，值得進一步 推廣應用。
【主權(quán)項】
1. 一種成株期小麥紋枯病的鑒定評價方法，其步驟為： (1) 將代表性強致病力小麥紋枯病菌(1^1丨23〇1：011丨3〇6代31丨8)菌種在超凈工作臺上于 PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，獲得菌絲； (2) 將木質(zhì)牙簽浸泡24小時，對折，牙簽尖頭朝上直立整齊放入不銹鋼飯盒中，配制TOA 培養(yǎng)基，將牙簽與培養(yǎng)基常規(guī)高壓蒸氣滅菌后，在超凈工作臺上將滅菌后未冷卻的PDA培養(yǎng) 基倒入飯盒，使其將牙簽1/2浸沒，待浸沒牙簽的PDA培養(yǎng)基冷卻后，將事先在培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 好的小麥紋枯病菌菌株無菌操作移入含牙簽的PDA固體培養(yǎng)基中，每個飯盒移入大小為lcm X lcm的布滿菌絲的培養(yǎng)基塊5塊，5塊帶菌培養(yǎng)基在含牙簽的TOA固體培養(yǎng)基中均勻分布， 接種后用封口膜封住飯盒，再放入25°C恒溫箱中培養(yǎng)14d~21d，培養(yǎng)過程中每隔7d在超凈 工作臺上查看菌絲生長情況，待菌絲長滿牙簽后形成有菌牙簽備用； (3) 同時種植待鑒定材料和對照品種，對照品種選用揚麥158為感病對照(Sd〇,寧麥9號 為中抗對照(MRd〇，Niavtl4為抗病對照(Rd〇，在小麥拔節(jié)期，用消毒鑷子夾取有菌牙簽，將 牙簽攜帶菌絲的尖頭一端輕輕地嵌入麥苗基部第1~2葉鞘之間，每個葉鞘嵌入一個有菌牙 簽，每份待鑒定材料接種30個莖桿，接種后，通過彌霧噴灑接種材料基部進行保濕，每天噴 水一次，連續(xù)噴水7d，然后對幼苗進行正常生長管理； (4) 在接種材料乳熟期，調(diào)查嵌有接菌牙簽莖桿的紋枯病病害等級，紋枯病田間病情分 級標準如下： 0級:全株無??； 1級:葉鞘有典型的紋枯病病斑，但不侵莖； 2級:病菌侵入莖桿，但病斑寬度不超過莖桿周長的1/4; 3級:病菌侵入莖桿，病斑寬度占莖桿周長的1/4~1/2; 4級:病菌侵入莖桿，病斑寬度占莖桿周長的1/2~3/4; 5級：病菌侵入莖桿，病斑寬度超過莖桿周長的3/4，或莖桿已軟腐、出現(xiàn)枯孕穗或枯白 穗； (5) 計算對照品種和待評價材料的紋枯病病情指數(shù)，式中Χι、X2、x3、X4、X5分別表示紋枯病1級、2級、3級、4級、5級莖桿數(shù)； (6) 根據(jù)病情指數(shù)對參試材料的成株期紋枯病抗性進行評價， 抗性分級標準： 抗病(R) :DI〈DIck-r; 中抗(MR) :DIck-r < DKDIck-mr; 中感(MS) :DIck-mr < DKDIck-s; 感病（S) :DI 2 DIck-s。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥紋枯病成株期抗性鑒定評價的方法，其特征在于，將待鑒 定的小麥品種或品系的種子按照（3)步驟~（5)步驟在同一環(huán)境下至少再進行一次重復鑒 定，計算平均值，通過與對照品種的平均病情指數(shù)進行比較，來評價待鑒定材料的紋枯病抗 性差異。
【文檔編號】C12Q1/18GK105861618SQ201610211553
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月6日
【發(fā)明人】張巧鳳, 吳紀中, 蔡士賓, 付必勝, 吳小有
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學院