一種離體莖測定煙草疫霉致病力的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，包括以下步驟：（1）煙草疫霉菌絲塊制備；（2）離體莖制備；（3）接種；（4）致病力測定與評價。本發(fā)明方法簡便易行，病原菌致病性表現(xiàn)穩(wěn)定，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可準確地反映煙草疫霉的致病力及其致病強度；在實際操作中，可批量進行，具有占用空間小、節(jié)約勞動成本、縮短實驗周期的優(yōu)點。因此，本發(fā)明方法適合推廣應(yīng)用。
【專利說明】
-種離體莖測定煙草疫霉致病力的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種離體莖測定煙草疫霉致病力的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草疫霉(Phyto地thora nicotianae)是導(dǎo)致煙草黑腔病的一種致病性卵菌，對 煙草生產(chǎn)危害嚴重，是影響煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病原菌之一。目前，關(guān)于煙草疫霉致病力 的測定主要存在如下=種方法:（1)創(chuàng)傷和非創(chuàng)傷煙苗莖基部貼接菌絲塊法測定致病力(王 革，鄭小波，陸家云等.云南省煙草黑腔病菌致病力分化的研究，南京農(nóng)業(yè)大學學報.1997， 20(4): 30-35.); (2)菌谷/游動抱子接種煙苗測定致病力(YC/T 41-1996煙草品種抗病性 鑒定;梁元存，劉延榮，王玉軍等.煙草黑腔病菌致病性分化和煙草品種的抗病性差異，植 物保護學報.2003, 30(2): 143-147.); (3)菌絲塊創(chuàng)傷貼接活體或離體葉片測定致病力 (馬國勝.煙草黑腔病菌生理生態(tài)及對甲霜靈抗性監(jiān)測與遺傳研究.安徽.安徽農(nóng)業(yè)大學 碩±論文.2002)。由于菌絲塊接種葉片發(fā)病快，比較適合測定病菌的致病力，而不能區(qū)分 病菌的致病強度，不適合于同時測定病菌的致病力及其致病強度。另外兩種方法均利用盆 栽的活體煙苗測定，由于培育煙苗時間長、占用空間大，導(dǎo)致費工、費時、成本高，不利于大 規(guī)模實驗，并且煙苗在溫室中生長，溫濕度控制范圍相對較寬，環(huán)境因素造成發(fā)病輕重上的 一些波動，實驗穩(wěn)定性、重復(fù)性有待提高。因此，開發(fā)一種能縮短時間、節(jié)省空間的測定病菌 致病力及其致病強度的方法意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種離體莖測定煙草疫霉致病力的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是運樣實現(xiàn)的，包括煙草疫霉菌絲塊制備、離體莖制備、接種、致病 力測定與評價步驟，具體包括： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天，將平板菌絲切成菌絲塊； B、 離體莖制備:選取培育60~70天的煙苗或培育10~15天新長出的蔽芽，提前2~3天剪掉 煙苗或蔽芽的葉片和葉柄，W讓傷口自我修復(fù)，剪取煙草同一莖位的莖段，切口處用滅菌脫 脂棉包裹，均勻置于滅菌的培養(yǎng)床上； C、 接種:于莖段中部表皮處進行刺孔，將A步驟獲得的菌絲塊菌絲面緊貼于離體莖刺孔 中部位置； D、 致病力測定與評價:將接種后的離體莖于濕度80~85%、溫度25~28°C條件下黑暗培 養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，W病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。
[0005] 本發(fā)明方法簡便易行，病原菌致病性表現(xiàn)穩(wěn)定，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，可準確地反 映煙草疫霉的致病力及其致病強度;在實際操作中，可批量進行，具有占用空間小、節(jié)約勞 動成本、縮短實驗周期的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0006] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不W任何方式對本發(fā)明加 W限制， 基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0007] 本發(fā)明所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，包括煙草疫霉菌絲塊制備、離 體莖制備、接種、致病力測定與評價步驟，具體包括： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天，將平板菌絲切成菌絲塊； B、 離體莖制備:選取培育60~70天的煙苗或培育10~15天新長出的蔽芽，提前2~3天剪掉 煙苗或蔽芽的葉片和葉柄，W讓傷口自我修復(fù)，剪取煙草同一莖位的莖段，切口處用滅菌脫 脂棉包裹，均勻置于滅菌的培養(yǎng)床上； C、 接種:于莖段中部表皮處進行刺孔，將A步驟獲得的菌絲塊菌絲面緊貼于離體莖刺孔 中部位置； D、 致病力測定與評價:將接種后的離體莖于濕度80~85%、溫度25~28°C條件下黑暗培 養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，W病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。
[000引 A步驟中所述的菌絲塊的直徑或邊長為5~8mm。
[0009] B步驟中所述的莖段的大小為長34~5cm，莖圍^2cm。
[0010] B步驟中所述的培養(yǎng)床為培養(yǎng)皿上墊上海綿和濾紙得到。
[0011] C步驟中所述的刺孔為3-5號昆蟲針l-2mm間隔排列成2-4mmX2-4mm的見方，所刺 深度1-2mm。
[0012] C步驟還包括加的滅菌水至培養(yǎng)床底部W滲透、濕潤脫脂棉。
[0013] 本發(fā)明所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，具體操作如下： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天至菌絲長滿整個平板，將平板菌絲切成直徑或邊長5-8mm的菌絲塊； B、 離體莖制備:選取培育60-70天的煙苗或10-15天新長出的蔽芽，提前2-3天剪掉煙苗 或蔽芽的葉片和葉柄，讓傷口自我修復(fù)。取煙草同一莖位的莖段，剪取長度4-5 cm、莖圍1-2 cm的莖段，切口處滅菌脫脂棉包裹，均勻置于培養(yǎng)床(培養(yǎng)皿上墊海綿和濾紙)上，培養(yǎng)床底 部加入適量的滅菌水，滅菌水濕潤脫脂棉； C、 接種;針刺破莖中部表皮，取A步驟獲得的煙草疫霉菌絲塊菌絲面緊貼于離體莖的中 屯、，加適量的滅菌水至培養(yǎng)床底部，讓其滲透、濕潤培養(yǎng)床； D、 致病力測定與評價:接種后的離體莖在相對濕度80~85%、溫度25~28°C下黑暗培養(yǎng)， 每天觀察發(fā)病情況，W第2-3天病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。
[0014] 下面W具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明： 1、材料與方法 1.1煙草疫霉菌絲塊制備 將煙草疫霉接種至OA培養(yǎng)基平板，于25~28°C下黑暗培養(yǎng)7~10天至菌絲長滿整個平板， 用直徑為5 mm的打孔器分別從已培養(yǎng)好的菌落邊緣打取菌餅。
[0015] 1.2離體莖制備 選取培育60-70天的煙苗，提前2-3天剪掉煙苗的葉片，讓傷口自我修復(fù)。取煙草同一莖 位的莖段，75%酒精消毒的剪刀剪下長度4-5 cm、莖圍I.2-1.6 cm的莖段，切口處滅菌脫脂 棉包裹，均勻置于培養(yǎng)床(培養(yǎng)皿上墊海綿和濾紙)上，培養(yǎng)床底部加入適量的滅菌水，滅菌 水濕潤脫脂棉。
[0016] 1.3 接種 75 %酒精消毒的微量進樣器針刺破莖中部表皮，將含有煙草黑腔病菌菌餅的菌絲面分 別緊貼于離體莖的中屯、針刺點上接種，接種空白培養(yǎng)基餅片作為對照，每菌株接種討良離體 莖作為1個處理，重復(fù)3次，W接種同樣大小的空白培養(yǎng)基餅片作為對照。
[0017] 1.4致病力測定與評價 接種后的離體莖在相對濕度80~85%、溫度25~28°C下黑暗培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，W 第3天病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。實驗數(shù)據(jù)WExcel進行常規(guī)計算，方差分析則采 用DPS 7.05軟件分析。
[〇〇1引2、結(jié)果與分析 實驗表明，隨機取來自云南10個縣的煙草黑腔病菌菌株均能侵染紅大煙苗莖桿引起發(fā) 病，發(fā)病率達到100 %。病斑初期從菌餅處開始出現(xiàn)水潰狀暗綠色，隨之會向周圍擴展，病 斑顏色也逐漸轉(zhuǎn)為黑褐色。表1觀察發(fā)現(xiàn)，病斑長度從30.00-51.67 mm不等，根據(jù)病斑長度 及LSD多重比較結(jié)果可將10個菌株分為3類:第1類致病強度較強包含4個菌株(Pn26、化20、 Pn23、化11);第2類病強度中等包含5個菌株(？1125、？1116、？118、化13、？116);第3類致病強度弱 包含1個菌株(Pnl5)。觀察聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南煙草黑腔病菌對煙苗致病力的分化與菌株所 處地理位置無明顯的相關(guān)性，不同地區(qū)的不同菌株之間對紅大煙苗的致病力會表現(xiàn)出不 同，地理分布較近的菌株對煙苗的致病力也會有顯著性差異現(xiàn)象。 「00191 親1末同他反棚直麗腔痛商創(chuàng)傷巧釉奸十品釉前痛九的比妖
注:表中"±"前面的數(shù)字表示病斑長度平均值，后面的數(shù)字代表標準差； 小寫字母表示P<〇.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示P<0.Ol水平上的差異顯著 性。
【主權(quán)項】
1. 一種離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于包括煙草疫霉菌絲塊制備、離 體莖制備、接種、致病力測定與評價步驟，具體包括： A、 煙草疫霉菌絲塊制備:將煙草疫霉接種至0A培養(yǎng)基平板，于25~28 °C下黑暗培養(yǎng)7~10 天，將平板菌絲切成菌絲塊； B、 離體莖制備:選取培育60~70天的煙苗或培育10~15天新長出的腋芽，提前2~3天剪掉 煙苗或腋芽的葉片和葉柄，以讓傷口自我修復(fù)，剪取煙草同一莖位的莖段，切口處用滅菌脫 脂棉包裹，均勻置于滅菌的培養(yǎng)床上； C、 接種:于莖段中部表皮處進行刺孔，將A步驟獲得的菌絲塊菌絲面緊貼于離體莖刺孔 中部位置； D、 致病力測定與評價：將接種后的離體莖于濕度80~85%、溫度25~28°C條件下黑暗培 養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況，以病斑長度區(qū)分致病力及其致病強度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于A步驟中所述 的菌絲塊的直徑或邊長為5~8mm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于B步驟中所述 的莖段的大小為長3~5cm，莖圍1~2cm〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于B步驟中所述 的培養(yǎng)床為培養(yǎng)皿上墊上海綿和濾紙得到。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于C步驟中所述 的刺孔為3-5號昆蟲針l-2mm間隔排列成2-4_X2-4mm的見方，所刺深度1~2_。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體莖測定煙草疫霉致病力的方法，其特征在于C步驟還包括 加1~8ml的滅菌水至培養(yǎng)床底部以滲透、濕潤脫脂棉。
【文檔編號】C12R1/645GK105861619SQ201610276468
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】方敦煌, 肖炳光, 劉萍花, 張誼寒, 陳學軍, 曾建敏
【申請人】云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院