一種食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法。1.本方法所涉及到的生化反應(yīng)與目前市場(chǎng)上常見的數(shù)值鑒定系統(tǒng)的生化反應(yīng)不同，結(jié)合不同李斯特菌的特異性基因進(jìn)行驗(yàn)證，優(yōu)化和確證了本方法的可行性和確信度。2.作為細(xì)菌數(shù)值鑒定法中最為關(guān)鍵的部分，該方法中菌株對(duì)不同生化試驗(yàn)的陽(yáng)性反應(yīng)率數(shù)據(jù)庫(kù)(data)是通過對(duì)全國(guó)各地分離到的近2000株菌株進(jìn)行生化反應(yīng)后得到的，符合該菌屬在中國(guó)的實(shí)際情況。3.對(duì)部分MID?67鑒定結(jié)果不好但分子方法可鑒定出來的菌株，通過本方法可以得到較好的鑒定結(jié)果，鑒定百分比可以達(dá)到90％以上。
【專利說明】
-種食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物鑒定領(lǐng)域，具體設(shè)及一種食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定 方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著國(guó)內(nèi)外人民物質(zhì)生活水平的不斷提高，食品安全問題已成為全人類關(guān)注的焦 點(diǎn)。物理因素、化學(xué)因素、生物因素是引起食品安全的=大因素，其中食源性致病微生物尤 為關(guān)鍵。美國(guó)CDC發(fā)布數(shù)據(jù)表明，1998-2008年間95 %食源性中毒事件由食源性致病微生物 引起;據(jù)中國(guó)CDC統(tǒng)計(jì)表明，2005-2011年由微生物引起的食物中毒比例占74%。食品安全是 關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的頭等大事，我國(guó)當(dāng)前食品安全形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻，食品中毒事件頻頻發(fā)生， 所造成的損失和負(fù)面影響巨大。
[0003] 就檢測(cè)手段而言，目前國(guó)家現(xiàn)行的許多檢測(cè)方法都是非常耗時(shí)的經(jīng)典微生物學(xué)方 法，加之一味照搬國(guó)外模式，建立我國(guó)新型快速檢測(cè)體系相當(dāng)必要。細(xì)菌數(shù)值鑒定法是將數(shù) 學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理運(yùn)用到細(xì)菌的鑒定實(shí)驗(yàn)中，通過比較待測(cè)菌株與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株的 生化反應(yīng)的符合概率，迅速得到鑒定結(jié)果。運(yùn)種方法快速、鑒定率高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和商品 化，與雙岐索引法和診斷表法并稱為=大傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法。
[0004] 細(xì)菌數(shù)值鑒定法最初的理論來源于數(shù)值分類法，但運(yùn)種方法只適合對(duì)大量菌株進(jìn) 行分類，對(duì)于單個(gè)菌株的鑒定卻不適用。同時(shí)，也有另一種數(shù)值分類的方法可W對(duì)細(xì)菌進(jìn)行 鑒定，運(yùn)種方法將分支圖化ey)引入細(xì)菌分類，通過建立數(shù)學(xué)模型來決定最好的試驗(yàn)，然后 菌株通過常規(guī)方法得到試驗(yàn)結(jié)果，再進(jìn)行比較鑒定（Annali di Microbiologia ed Enzimologia, 1958,8(23): 1-239.)，相對(duì)于傳統(tǒng)的方法，運(yùn)種方法可W節(jié)省一些力氣，但跟 傳統(tǒng)的方法相比，也一樣不能解決由于一個(gè)或多個(gè)特征變異所帶來的鑒別困難。此時(shí)， Lockhad等在1962年提出的概率鑒定法引起了一些學(xué)者的興趣，運(yùn)種方法是通過對(duì)每一個(gè) 細(xì)菌條目的陽(yáng)性結(jié)果與實(shí)際的已知的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)從而得到可靠的鑒定（Journal Of General Microbiology, 1962,28,633-640) ePayne(1963)接受了運(yùn)一方法并與Dybowski和 Franklin-起制定了一個(gè)詳細(xì)的概率計(jì)算方法并應(yīng)用與腸桿科的鑒定中（World Medical Electronics,1963,2:6-11.；Journal of General Microbiology,1968,54(2):215-229)； 此后，Lapage等人在1973年通過該方法對(duì)1079株革蘭氏陰性菌株進(jìn)行了鑒定，發(fā)酵菌株和 非發(fā)酵菌株的符合率達(dá)到了 90.8%和82.1%，并正式建立了 Lapage細(xì)菌數(shù)值鑒定理論 (Journal of General Microbiology, 1973,77(2) :273-290)。基于運(yùn)一理論，法國(guó)生物-梅 里埃公司又提出了T值、R值和鑒定百分?jǐn)?shù)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(API ,1977)，進(jìn)一步完善了該理論。 Lapage數(shù)值鑒定理論的數(shù)據(jù)方法是基于計(jì)算機(jī)輔助鑒定下的貝葉斯理論，首先假設(shè)每一個(gè) 細(xì)菌條目所進(jìn)行的生化反應(yīng)都是獨(dú)立的，運(yùn)樣每一個(gè)細(xì)菌條目所出現(xiàn)的概率值也是相對(duì)獨(dú) 立的個(gè)體。通過不同細(xì)菌條目（Taxon)下進(jìn)行的生化試驗(yàn)(Text)所出現(xiàn)的陽(yáng)性或者陰性的 結(jié)果，轉(zhuǎn)換成概率值，再計(jì)算得到試驗(yàn)組合ti各個(gè)細(xì)菌條目下出現(xiàn)概率值，從而得到鑒定分 數(shù)（ID，identification Scores)。
[0005] 結(jié)合計(jì)算機(jī)技術(shù)，將此方法編碼成配套軟件，結(jié)合試驗(yàn)單元，可形成細(xì)菌數(shù)值鑒定 系統(tǒng)。國(guó)外在此方面的研究較早，先后開發(fā)出如:API(BioMerieux) ,Cobas IDA(Roche), Enterotube II(Roche),Micro-ID(REMEL),Spectrum 10(Austin Biological),Rap ID (Innovative Diag.),Microbact(Microgen),Raplianalyzer(Oxoid),BBLCrystal(BD)等 一系列W生化鑒定為主的細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)。運(yùn)些鑒定系統(tǒng)，都表現(xiàn)出了較高的專業(yè)化在、 自動(dòng)化和智能化水平，其中API是國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)鑒定系統(tǒng)。在我國(guó)，運(yùn)方面的研究從20世 紀(jì)90年代后才開始啟動(dòng)，起步相對(duì)較晚，如趙卓等人于1994年開發(fā)的應(yīng)用與腸桿菌科和弧 菌科的數(shù)值鑒定系統(tǒng)（中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1994，3:012.);趙貴陽(yáng)研發(fā)的腸桿菌科細(xì)菌微量 快速生化鑒定系統(tǒng)（中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2004,14(2) :142-144);張銀旺等開發(fā)的腸桿菌科 細(xì)菌生化鑒定系統(tǒng)(現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007,22(4) :9-11)。雖有報(bào)道，但目前，運(yùn)些鑒定系 統(tǒng)也只是文獻(xiàn)報(bào)道，且目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)基本被國(guó)外產(chǎn)品所占領(lǐng)，未見全面推廣。
[0006] 李斯特菌屬化isteria SPP.)為革蘭氏陽(yáng)性菌，兼性厭氧。目前國(guó)際上比較公認(rèn)的 主要包括W下幾種：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特菌化isteria mono巧togenes，LM)、英諾克李斯特 菌化isteria innocua,LIN)、綿羊李斯特菌化isteria ivanovii ,LIV)、西式李斯特菌 (Xisteria seeligeri ,LS)、威爾氏李斯特菌(Xisteria welshimeri ,LW)和格式李斯特菌 化 isteria grayi, LG) (Int.J.Med.Microbiol. ,2007,297(7-8) :541-557),運(yùn)些李斯特菌， 在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)的食品中都能找到。2010年至今，該屬又相繼報(bào)道了 10個(gè)新 種和2個(gè)新亞種，但運(yùn)些新種均分離自工業(yè)和淡水，對(duì)人體不致病。其中LIV和LM具有致病 性，但僅LM對(duì)人有致病性，能引起人和動(dòng)物患腦膜炎、腦炎、敗血癥、屯、內(nèi)膜炎、流產(chǎn)、脈腫和 局部的脈性損傷，造成孕婦流產(chǎn)、死胎等疾病，發(fā)病者死亡率可達(dá)20 %~70 % (Microbiological reviews,1991,55(3) :476)，被認(rèn)為是全球四大食源性致病菌之一。目 前，LM及其菌屬其他種的鑒定和區(qū)分主要通過對(duì)分離菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)、運(yùn)動(dòng)型和生化反應(yīng) 來實(shí)現(xiàn)。在李斯特菌的數(shù)值鑒定上，也有BioMerieux公司開發(fā)的API Listeria,REM化公司 的MID-67 ,Microgen公司開發(fā)的Microbact 1化等，運(yùn)些鑒定系統(tǒng)，都能較好的區(qū)分李斯特 菌，但是，不可否認(rèn)，運(yùn)些鑒定系統(tǒng)的價(jià)格都非常昂貴，一般從幾萬到幾十萬不等，在國(guó)內(nèi)并 不容易推廣應(yīng)用。此外，隨著地域限制、物種的進(jìn)化和新物種的發(fā)現(xiàn)，運(yùn)些細(xì)菌數(shù)值鑒定系 統(tǒng)中的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)也存在一定的缺陷，如生化反應(yīng)陽(yáng)性率不夠準(zhǔn)確，生化反應(yīng)的選擇存在一 定的局限性等，都將導(dǎo)致鑒定的錯(cuò)誤率提升，一定程度上影響了細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確性，因此， 自主開發(fā)具有中國(guó)特色的李斯特菌快速鑒定系統(tǒng)顯得非常重要。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0007] 本發(fā)明的目的是利用細(xì)菌數(shù)值鑒定的原理，提供一種食品中常見李斯特菌，如單 核細(xì)胞增生李斯特菌化isteria monocytogenes, LM)、英諾克李斯特菌化isteria innocua,LIN)、綿羊李斯特菌化i Steria ivanovii ,LIV)、西式李斯特菌化i Steria seeIigeri ,LS)、威爾氏李斯特菌(Xisteria weIshimeri ,LW)和格式李斯特菌(Xisteria grayi，LG)的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法。
[0008] 本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0009] a、確定李斯特菌包含的種類，所述的李斯特菌包括單核細(xì)胞增生李斯特菌 化isteria monocytogenes)、英諾克李斯特菌化isteria innocua)、綿羊李斯特菌 (Listeria ivanovii)、西式李其辦寺菌（Listeria seeligeri)、威爾氏李其辦寺菌（Listeria welshimeri)和格式李斯特菌化isteria grayi) W及11個(gè)生化反應(yīng)，所述的11個(gè)生化反應(yīng) 包括屯葉甘水解反應(yīng)，甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)，麥芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)，鼠李糖產(chǎn)酸反應(yīng)，塔格糖產(chǎn)酸反 應(yīng)，阿拉伯糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)，1-憐酸葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)，木糖產(chǎn)酸反應(yīng)，甲基甘露 醇產(chǎn)酸反應(yīng)和綿羊血紅細(xì)胞溶血反應(yīng)；
[0010] b、選擇步驟a中的11個(gè)生化實(shí)驗(yàn)作為數(shù)值法中所需要的生化反應(yīng)：
[0011] C、建立包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、西式李斯特 菌、威爾氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌屬的數(shù)據(jù)庫(kù)，確定數(shù)值法中計(jì)算方法:根據(jù) 選擇的分類單元與生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率，形成一個(gè)概率矩陣；
[0012] 按照細(xì)菌概率鑒定理論確定每一分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定 百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法，具體計(jì)算公式如下：
[0013] 每一分類單元的總出現(xiàn)頻率等于該分類單元對(duì)應(yīng)的每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率的 乘積；
[0014] 多項(xiàng)總發(fā)生頻率等于每一分類單元的總出現(xiàn)頻率的總和；
[0015] 鑒定百分?jǐn)?shù)等于每一分類單元總出現(xiàn)頻率除W多項(xiàng)總發(fā)生頻率再乘W100%，全 體鑒定百分?jǐn)?shù)之和應(yīng)等于100% ;
[0016] d、待測(cè)菌株純培養(yǎng)后，進(jìn)行步驟a的U種生化實(shí)驗(yàn)；
[0017] e、獲得待測(cè)菌株的11種生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，根據(jù)生化反應(yīng)的陰、陽(yáng)，按照計(jì)算方法對(duì) 數(shù)據(jù)庫(kù)中所有分類單元進(jìn)行計(jì)算，首先將生化實(shí)驗(yàn)值轉(zhuǎn)換成概率值，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性則 就是對(duì)應(yīng)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值;若為陰性則100%減去生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值，上述結(jié)果 若是0或100%，則用近似值1%或99%代替，再按照步驟C的計(jì)算方法計(jì)算每一個(gè)分類單元 的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)；
[0018] f、根據(jù)計(jì)算結(jié)果，對(duì)待測(cè)菌株鑒定結(jié)果進(jìn)行判定:根據(jù)鑒定百分?jǐn)?shù)的大小進(jìn)行排 序，鑒定百分?jǐn)?shù)最高相對(duì)應(yīng)的菌株即為待測(cè)菌株所屬的分類單元。
[0019] 本發(fā)明中，屯葉甘水解反應(yīng)，麥芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)，阿拉伯糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)可區(qū)分李斯特 菌屬與其他屬的菌。英諾克李斯特菌、威爾氏李斯特菌和格式李斯特菌為不溶血菌株，綿羊 血紅細(xì)胞溶血反應(yīng)將他們與單增李斯特菌，西式李斯特菌和格式李斯特菌進(jìn)行區(qū)分;木糖 產(chǎn)酸反應(yīng)可區(qū)分威爾氏李斯特菌和其他兩種不溶血菌株，甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)和鼠李糖產(chǎn)酸反 應(yīng)可區(qū)分格式李斯特菌和其他兩種不溶血菌株;溶血性菌株中，僅綿羊李斯特菌的1-憐酸 葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)為陽(yáng)性，其余菌株顯示為陰性;單增李斯特菌的木糖產(chǎn)酸反應(yīng)為陰性，西式 李斯特菌為陽(yáng)性。此外，塔格糖產(chǎn)酸反應(yīng)也可區(qū)別威爾氏李斯特菌和其他菌株，核糖產(chǎn)酸反 應(yīng)可區(qū)分格式李斯特菌和其他的李斯特菌株，甲基甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)將西式李斯特菌和綿羊 李斯特菌與其他菌株區(qū)分開。
[0020] 本方法與其他方法相比具有的優(yōu)勢(shì)：
[0021] 1.本方法所設(shè)及到的生化反應(yīng)與目前市場(chǎng)上常見的數(shù)值鑒定系統(tǒng)的生化反應(yīng)不 同，結(jié)合不同李斯特菌的特異性基因進(jìn)行驗(yàn)證，優(yōu)化和確證了本方法的可行性和確信度。
[0022] 2.作為細(xì)菌數(shù)值鑒定法中最為關(guān)鍵的部分，該方法中菌株對(duì)不同生化試驗(yàn)的陽(yáng)性 反應(yīng)率數(shù)據(jù)庫(kù)(data)是通過對(duì)全國(guó)各地分離到的近2000株菌株進(jìn)行生化反應(yīng)后得到的，符 合該菌屬在中國(guó)的實(shí)際情況。
[0023] 3.對(duì)部分MID-67鑒定結(jié)果不好但分子方法可鑒定出來的菌株，通過本方法可W得 到較好的鑒定結(jié)果，鑒定百分比可W達(dá)到90% W上。
【具體實(shí)施方式】：
[0024] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0025] -般來說，所有建立在細(xì)菌數(shù)值鑒定理論基礎(chǔ)上的方法都是從計(jì)算待測(cè)菌株的可 信度(1化ehoods)開始的。首先假設(shè)每一個(gè)細(xì)菌條目所進(jìn)行的生化反應(yīng)都是獨(dú)立的，運(yùn)樣每 一個(gè)細(xì)菌條目所出現(xiàn)的概率值也是相對(duì)獨(dú)立的個(gè)體。通過不同細(xì)菌條目（Taxon)下進(jìn)行的 生化試驗(yàn)(Test)所出現(xiàn)的陽(yáng)性或者陰性的結(jié)果，轉(zhuǎn)換成概率值，再計(jì)算得到試驗(yàn)組合ti各 個(gè)細(xì)菌條目下出現(xiàn)概率值，從而得到鑒定百分?jǐn)?shù)(ID,identification Scores)。
[0026] 計(jì)算單項(xiàng)生化反應(yīng)出現(xiàn)概率值公式如下：
[0027] P(ri|ti)( + )=P( + )(l-Pm)+P(-)Pm (1-1)
[002引 P(ri|ti)(-) = (l-P( + ))(l-Pm)+P( + )Pm (1-2)
[0029] 其中Pm為陽(yáng)性誤差率和陰性誤差率，對(duì)于陽(yáng)性反應(yīng)率為0或者100%的菌株，概率 值用近似值0.0 l或者0.99代替。
[0030] 得到單項(xiàng)生化反應(yīng)概率值后，再通過公式（1-3)計(jì)算不同細(xì)菌條目下生化試驗(yàn)組 合ti的總出現(xiàn)概率值P (RI ti)，如下：
[0031] p(R|ti)=P(；ri,r2,…|ti)=P(;ri|ti)P(r2|ti)..., (1-3)
[0032] 得到總出現(xiàn)概率值后，便可計(jì)算出鑒定百分?jǐn)?shù)（％)，即生化試驗(yàn)組合ti條件下各 細(xì)菌條目的出現(xiàn)概率值P( ti IR)，公式如下：
[0033]
(1-4)
[0034] 除鑒定分?jǐn)?shù)W外，也通過建立概率值的模式似然比值T值(Modal likelihood 打action)來加強(qiáng)鑒定結(jié)果的可信度，計(jì)算公式如下：
[0035]
(1-5)
[0036] 其中P0(P observed)代表不同細(xì)菌條目下生化試驗(yàn)組合ti的實(shí)際總出現(xiàn)概率值， PT(Ptypical)則是不同細(xì)菌條目下生化試驗(yàn)組合ti的最大總出現(xiàn)概率值。模式似然比值越 接近1，表明該菌株實(shí)際出現(xiàn)的概率和最可能的出現(xiàn)概率是等同的，也就表明鑒定價(jià)值是可 靠的。
[0037] 通過計(jì)算得到的鑒定百分?jǐn)?shù)和T值，即可對(duì)待測(cè)菌株的可信度進(jìn)行評(píng)價(jià)。一般來 說，分為極好的鑒定結(jié)果、好的鑒定結(jié)果、可W接受的鑒定結(jié)果和不可接受的鑒定結(jié)果等評(píng) 價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示：
[0038] 表1鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)
[0039]
[0040] 編寫軟件的計(jì)算機(jī)語(yǔ)言采用C++6.0,開發(fā)平臺(tái)為Visual Studio 2010。軟件編碼 中，具體計(jì)算得到試驗(yàn)組合ti各個(gè)細(xì)菌條目下出現(xiàn)概率值W及鑒定分?jǐn)?shù)（ID， identification Scores)和評(píng)價(jià)結(jié)果的方法和計(jì)算公式見上。
[0041] 本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法，其具體步驟如下：
[0042] a、確定李斯特菌包含的種類，本發(fā)明的李斯特菌包括單核細(xì)胞增生李斯特菌 化isteria monocytogenes)、英諾克李斯特菌化isteria innocua)、綿羊李斯特菌 (Listeria ivanovii)、西式李其辦寺菌（Listeria seeligeri)、威爾氏李其辦寺菌（Listeria welshimeri)和格式李斯特菌(Xisteria grayi)。
[0043] b、選擇數(shù)值法中所需要的生化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)建立分支圖的方法，并W最少的生化實(shí) 驗(yàn)?zāi)軌騾^(qū)分最多的分類單元的原則，選擇出11個(gè)生化實(shí)驗(yàn)。所述的11個(gè)生化反應(yīng)包括屯葉 甘水解反應(yīng)，甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)，麥芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)，鼠李糖產(chǎn)酸反應(yīng)，塔格糖產(chǎn)酸反應(yīng)，阿拉伯 糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)，1-憐酸葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)，木糖產(chǎn)酸反應(yīng)，甲基甘露醇產(chǎn)酸反 應(yīng)和綿羊血紅細(xì)胞溶血反應(yīng)；
[0044] C、建立包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、西式李斯特 菌、威爾氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌屬的數(shù)據(jù)庫(kù)，確定數(shù)值法中計(jì)算方法:根據(jù) 選擇的分類單元與生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率，形成一個(gè)概率矩陣；
[0045] 按照細(xì)菌概率鑒定理論確定每一分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定 百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法，具體計(jì)算公式如下：
[0046] 每一分類單元的總出現(xiàn)頻率等于該分類單元對(duì)應(yīng)的每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率的 乘積；
[0047] 多項(xiàng)總發(fā)生頻率等于每一分類單元的總出現(xiàn)頻率的總和；
[004引鑒定百分?jǐn)?shù)等于每一分類單元總出現(xiàn)頻率除W多項(xiàng)總發(fā)生頻率再乘W100%，全 體鑒定百分?jǐn)?shù)之和應(yīng)等于100% ;
[0049] d、待測(cè)菌株純培養(yǎng)后，進(jìn)行步驟b的11種生化實(shí)驗(yàn)，即進(jìn)行屯葉甘水解反應(yīng)，甘露 醇產(chǎn)酸反應(yīng)，麥芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)，鼠李糖產(chǎn)酸反應(yīng)，塔格糖產(chǎn)酸反應(yīng)，阿拉伯糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)，1-憐酸葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)，木糖產(chǎn)酸反應(yīng)，甲基甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)和綿羊血紅細(xì)胞 溶血反應(yīng);可W使用商品化的鑒定條，也可W購(gòu)買生化管或自行配制培養(yǎng)基進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。
[0050] e、獲得待測(cè)菌株的11種生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，根據(jù)生化反應(yīng)的陰、陽(yáng)，按照計(jì)算方法對(duì) 數(shù)據(jù)庫(kù)中所有分類單元進(jìn)行計(jì)算，首先將生化實(shí)驗(yàn)值轉(zhuǎn)換成概率值，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性則 就是對(duì)應(yīng)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值;若為陰性則100%減去生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值，上述結(jié)果 若是0或100%，則用近似值0.1或0.99代替，再按照步驟C的計(jì)算方法計(jì)算每一個(gè)分類單元 的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)；
[0051] f、根據(jù)計(jì)算結(jié)果，對(duì)待測(cè)菌株鑒定結(jié)果進(jìn)行判定:根據(jù)鑒定百分?jǐn)?shù)的大小進(jìn)行排 序，鑒定百分?jǐn)?shù)最高相對(duì)應(yīng)的菌株即為待測(cè)菌株所屬的分類單元。
[0化2] g、鑒定軟件采用C++語(yǔ)言編寫，開發(fā)平臺(tái)為Visual Studio 2010。為便于分析和軟 件開發(fā)，生化反應(yīng)譜的編碼采用了八進(jìn)制的方式進(jìn)行，1巧巾生化反應(yīng)如表3分成了 4組，分別 賦值為1、2、4,當(dāng)待測(cè)菌株生化反應(yīng)結(jié)果為陰性時(shí)一律為0。即當(dāng)?shù)谝粋€(gè)生化反應(yīng)為陽(yáng)性時(shí) 數(shù)值為1，第二位為陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)數(shù)值為2,第=位陽(yáng)性時(shí)則標(biāo)記為4,所有陰性反應(yīng)均為0。運(yùn) 種編碼方式是一種非常方便的查詢方法，目前API生化鑒定系統(tǒng)即采用的表2所示的編碼方 式：
[0化3] 表2 API數(shù)值編碼 [0化4]
[0055]本數(shù)值鑒定系統(tǒng)的生化反應(yīng)譜的編碼采用同樣的八進(jìn)制方式，11種生化反應(yīng)分成 了4組，分別賦值為1、2、4,當(dāng)待測(cè)菌株生化反應(yīng)結(jié)果為陰性時(shí)一律為0,如表3所示：
[0化6] 表3 「nnf；7l L0058J 下面由表4進(jìn)行舉例說明。
[0化9] 1、生化試驗(yàn)
[0060]首先將待測(cè)菌進(jìn)行屯葉甘水解反應(yīng)，甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)，麥芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)，鼠李糖產(chǎn) 酸反應(yīng)，塔格糖產(chǎn)酸反應(yīng)，阿拉伯糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)，1-憐酸葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)，木 糖產(chǎn)酸反應(yīng)，甲基甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)和綿羊血紅細(xì)胞溶血反應(yīng)11項(xiàng)生化試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。
[0061] 2、鑒定百分?jǐn)?shù)的計(jì)算
[0062] 得到生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，計(jì)算6個(gè)分類單元(單核細(xì)胞增生李斯特菌、英諾克李斯特 菌、綿羊李斯特菌、西式李斯特菌、威爾氏李斯特菌和格式李斯特菌）與待測(cè)菌的鑒定百分 數(shù)，由于限于篇幅無法將6個(gè)分類單元的陽(yáng)性概率悉數(shù)列出，所W W已知菌1、已知菌2、已知 菌3=個(gè)代稱，W及與其生化實(shí)驗(yàn)1、生化實(shí)驗(yàn)2、生化實(shí)驗(yàn)3舉例來進(jìn)行說明。
[0063] 待測(cè)菌生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和已知菌1、已知菌2、已知菌3 =種菌生化陽(yáng)性概率結(jié)果如表 4所示：
[0064] 表4待測(cè)菌的數(shù)值鑒定百分比計(jì)算例子
[00 化]
[0069] C:不同細(xì)菌條目下生化試驗(yàn)組合ti的總出現(xiàn)概率值
[0
[0
[0
[00701
[0
[0 1234 根據(jù)待測(cè)菌的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，=個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分別為+、-、+，因此按照前面所 述的計(jì)算方法，已知菌1的總出現(xiàn)頻率=98X (100-1) X90X ICT6 = O.911493;已知菌2的總 出現(xiàn)頻率=84 X (100-99) X 5 X 10-6 = 0.000420;已知菌3的總出現(xiàn)頻率=1 X (100-98) X 97 X 10-6 = 0.000194;多項(xiàng)總出現(xiàn)頻率=0.911493+0.000420+0.000194 = 0.912107;已知菌 1 的鑒定百分?jǐn)?shù)=(0.911493今0.912107 ) X 100 = 99.93% ;已知菌2的鑒定百分?jǐn)?shù)= (0.000420今0.912107) X 100 = 0.045%;已知菌3的鑒定百分?jǐn)?shù)=(0.000194今0.912107) X 100 = 0.021%。由于本發(fā)明包括的分類單元為6個(gè)及生化反應(yīng)為11個(gè)，每鑒定一株菌需要 對(duì)6個(gè)分類單元都進(jìn)行鑒定百分?jǐn)?shù)的計(jì)算，人工計(jì)算工作量大，工作進(jìn)程將會(huì)受到嚴(yán)重的影 響，因此，計(jì)算過程在相應(yīng)的配套軟件進(jìn)行。 2 于是我們可W推斷待測(cè)菌為已知菌1的概率最高，達(dá)到了 99.93%。 3 表5中所示的細(xì)菌條目的模式似然比值建立如表2-4所示： 4 表5模式似然比值的建立
[0077]
[0078] 根據(jù)鑒定百分?jǐn)?shù)和T值的臨界值可W對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行分類評(píng)價(jià)，可判斷出待測(cè)菌 為已知菌1的結(jié)果是極好的鑒定。
[0079] W下實(shí)施例是按照W上食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法進(jìn)行鑒定的，具 體如下：
[0080] 實(shí)施例1:
[0081 ] 基于本實(shí)驗(yàn)室分離到的2000多株李斯特菌(包括1627株LM，270株LIN，32株LW，29 株LG，9株LS和6株LIV)進(jìn)行11項(xiàng)生化反應(yīng)，即屯葉甘水解反應(yīng)（1)，甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)(2)，麥 芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)(3)，鼠李糖產(chǎn)酸反應(yīng)(4)，塔格糖產(chǎn)酸反應(yīng)(5)，阿拉伯糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)(6)，1-憐酸葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)(7)，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)(8)，木糖產(chǎn)酸反應(yīng)(9)，甲基甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)（10) 和綿羊血紅細(xì)胞溶血反應(yīng)(11)的結(jié)果，獲得本鑒定系統(tǒng)的生化反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0082] 具體如表6所示：
[0083] 表 6
[0084]
[0085] 對(duì)李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(如表8所示)按照上述食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定 方法進(jìn)行鑒定。
[0086] 對(duì)六種李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別進(jìn)行上述U種生化反應(yīng)后記錄結(jié)果，如表7所示：
[0087] 表7李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株各生化反應(yīng)結(jié)果 「mRRl
[0090] 注:LM為單增李斯特菌，LIN為英諾克李斯特菌，LW為威爾氏李斯特菌，LS為西式李 斯特菌，LIV為綿羊李斯特菌，LG為格式李斯特菌
[0091] 獲得11種生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，根據(jù)生化反應(yīng)的陰、陽(yáng)，按照計(jì)算方法對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有 分類單元進(jìn)行計(jì)算。首先將生化值轉(zhuǎn)換成概率值，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性則就是對(duì)應(yīng)生化實(shí)驗(yàn) 的陽(yáng)性概率值;若為陰性則100%減去生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值。上述結(jié)果若是0或100,則用 近似值0.01或0.99代替。再計(jì)算每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分 數(shù)。
[0092] 計(jì)算結(jié)果可知LM的讀數(shù)結(jié)果為5503,輸入結(jié)果后顯示:單增李斯特菌的鑒定百分 數(shù)為99.25%，T值為100%，判定為極好的鑒定。其他菌株的讀數(shù)分別為：英諾克李斯特菌 (5501)、威爾氏李斯特菌(5741)、西式李斯特菌(5442)、綿羊李斯特菌(5452)、格式李斯特 菌(7421)。鑒定出來的結(jié)果分別為:98.34%、99.99%、95.07%、98.08%和100%，T值分別 是:100%、100 %、100 %、100 %和100%，均為極好的鑒定結(jié)果。
[OOW]表 8
[0094]
[0095]
[0096] 實(shí)施例2:
[0097] 對(duì)本實(shí)驗(yàn)分離到的264株單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行MID鑒定，均顯示為單增李斯 特菌，鑒定百分比為99.92%，T值為1，結(jié)果判定為極好的鑒定結(jié)果。
[0098] 同時(shí)對(duì)上述264株單核細(xì)胞增生李斯特菌按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì) 菌數(shù)值鑒定方法進(jìn)行鑒定。首先對(duì)264株單核細(xì)胞增生李斯特菌分別進(jìn)行11項(xiàng)生化試驗(yàn)，具 體結(jié)果如表9所示，然后按照食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法中的計(jì)算方法，對(duì)照 其生化反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)據(jù)庫(kù)(表6)計(jì)算每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百 分?jǐn)?shù)。顯示數(shù)值5503,輸入結(jié)果后得到單增李斯特菌99.25%的鑒定百分比，T值為100%，判 定為極好的鑒定結(jié)果。表明本發(fā)明的鑒定結(jié)果與MIDW及分子鑒定的結(jié)果完全相符，表現(xiàn)出 較好的鑒定能力。
[0099] 表 9
[0100]
[0101] 實(shí)施例3:
[0102] 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離到的48株單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行MID鑒定作為對(duì)照。MID結(jié)果 顯示33株菌株鑒定百分比為99.41 %，T值為2.04%，判定為可接受的鑒定結(jié)果；1株分離菌 株顯示鑒定百分比為99.99%，T值3.04%，判定為可接受的鑒定結(jié)果;6株分離菌株顯示鑒 定百分比為99.84%，T值0.1%，判定為可接受的鑒定結(jié)果;8株分離菌株顯示鑒定百分比為 58.26%，T值<0.Ol %，判定為不可接受的鑒定結(jié)果。對(duì)運(yùn)些菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分子鑒定，結(jié) 果顯示均為單增李斯特菌。
[0103] 同時(shí)對(duì)上述48株單核細(xì)胞增生李斯特菌按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì) 菌數(shù)值鑒定方法進(jìn)行鑒定，首先對(duì)48株單核細(xì)胞增生李斯特菌分別進(jìn)行11項(xiàng)生化試驗(yàn)，具 體結(jié)果如表10所示，然后按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法中的計(jì)算 方法，對(duì)照其生化反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)據(jù)庫(kù)(表6)計(jì)算每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻 率、鑒定百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，其中6株菌為極好的鑒定結(jié)果，42株菌為可接受的鑒定結(jié)果。鑒 定百分比和 T 值分別為：99.25% (100% ),98.82% (2.04% ),95.24% (0.01 % ),99.59% (2.04% )。如表11所示：
[0104] 表10
[0105]
[i
[i
[i
[0109] 綜合分子鑒定結(jié)果，本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法表現(xiàn)出優(yōu) 于MID鑒定系統(tǒng)的鑒定水平和能力。
[0110] 實(shí)施例4:
[0111] 對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離到的265株英諾克李斯特菌分離株進(jìn)行MID鑒定，結(jié)果顯示227株 分離株為極好的鑒定結(jié)果，鑒定百分比為93.95%，T值為100% ; 29株分離株為好的鑒定結(jié) 果，鑒定百分比為97.86%，T值為42.86% ;2株分離株為可接受的鑒定結(jié)果，鑒定百分比為 92.90%，T值為0.10% ; 5株分離株為可疑的鑒定結(jié)果，鑒定百分比為66.73 %，T值為 0.04%。分子鑒定結(jié)果顯示，所有菌株均含有英諾克李斯特菌的特異性條帶。
[0112] 同時(shí)對(duì)上述265株英諾克李斯特菌按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值 鑒定方法進(jìn)行鑒定，首先對(duì)4265株英諾克李斯特菌分別進(jìn)行11項(xiàng)生化試驗(yàn)，具體結(jié)果如表 12所示，然后按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法中的計(jì)算方法，對(duì)照 其生化反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)據(jù)庫(kù)(表6)計(jì)算每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百 分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示（表13)227株分離株為極好的鑒定結(jié)果，鑒定百分比為98.31 %，T值為 100% ;34株為好的鑒定結(jié)果，鑒定百分比為99.70%，T值為42.86% ; 2株為可接受的鑒定結(jié) 果，鑒定百分比為94.53 %，T值為1.01 %。本實(shí)施例表明本發(fā)明表現(xiàn)出優(yōu)于MID鑒定系統(tǒng)的 鑒定水平和能力，可W更好的鑒定出英諾克李斯特菌。
[0113] 表12
[0114]
[(
[0116]表13英諾克李斯特菌分離株MID鑒定結(jié)果與本發(fā)明的結(jié)果比較
[01171
[011引實(shí)施例5:
[0119] 對(duì)本實(shí)驗(yàn)分離的28株格式李斯特菌分離株進(jìn)行MID鑒定，結(jié)果顯示均為可接受的 鑒定結(jié)果。同時(shí)對(duì)運(yùn)些菌株按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法行鑒 定，首先對(duì)28株格式李斯特菌分離株分別進(jìn)行11項(xiàng)生化試驗(yàn)，然后按照本發(fā)明的食品中常 見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法中的計(jì)算方法，對(duì)照其生化反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)據(jù)庫(kù)(表6)計(jì)算每 一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)。記錄結(jié)果，輸入軟件，顯示其中 27株為可接受的鑒定結(jié)果，1株分離株為可疑的鑒定結(jié)果。如表14所示：
[0120] 表14格式李斯特菌分離株MID鑒定結(jié)果與本發(fā)明的結(jié)果比較 [01211
[0122]
[0123] 實(shí)施例6:
[0124] 對(duì)本實(shí)驗(yàn)分離的6株西式李斯特菌分離株進(jìn)行MID鑒定，其中2株為極好的鑒定，4 株為可接受的鑒定結(jié)果。1株綿羊李斯特菌分離株MID鑒定結(jié)果為可接受的鑒定。同時(shí)對(duì)運(yùn) 些菌株按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法行鑒定，首先對(duì)運(yùn)些李斯特 菌分離株分別進(jìn)行11項(xiàng)生化試驗(yàn)，然后按照本發(fā)明的食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定 方法中的計(jì)算方法，對(duì)照其生化反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)據(jù)庫(kù)(表6)計(jì)算每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、 多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)。鑒定結(jié)果與MID相同。兩種鑒定系統(tǒng)的鑒定結(jié)果一樣，與分子 鑒定結(jié)果一致。具體鑒定結(jié)果如表15所示：
[0125] 表15西式李斯特菌分離株MID鑒定結(jié)果與本發(fā)明的結(jié)果比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種食品中常見李斯特菌的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 確定李斯特菌包含的種類，所述的李斯特菌包括單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、英諾克李斯特菌（Listeria innocua)、綿羊李斯特菌（Listeria ivanovii)、西式李斯特菌（Listeria seeligeri)、威爾氏李斯特菌（Listeria welshimeri)和格式李斯特菌(Listeria grayi)以及11個(gè)生化反應(yīng)，所述的11個(gè)生化反應(yīng) 包括七葉甘水解反應(yīng)，甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)，麥芽糖產(chǎn)酸反應(yīng)，鼠李糖產(chǎn)酸反應(yīng)，塔格糖產(chǎn)酸反 應(yīng)，阿拉伯糖醇產(chǎn)酸反應(yīng)，1-磷酸葡萄糖產(chǎn)酸反應(yīng)，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)，木糖產(chǎn)酸反應(yīng)，甲基甘露 醇產(chǎn)酸反應(yīng)和綿羊血紅細(xì)胞溶血反應(yīng)； b、 選擇步驟a中的11個(gè)生化實(shí)驗(yàn)作為數(shù)值法中所需要的生化反應(yīng)： c、 建立包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、西式李斯特菌、 威爾氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌屬的數(shù)據(jù)庫(kù)，確定數(shù)值法中計(jì)算方法:根據(jù)選 擇的分類單元與生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率，形成一個(gè)概率矩陣； 按照細(xì)菌概率鑒定理論確定每一分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分 數(shù)的計(jì)算方法，具體計(jì)算公式如下： 每一分類單元的總出現(xiàn)頻率等于該分類單元對(duì)應(yīng)的每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率的乘積； 多項(xiàng)總發(fā)生頻率等于每一分類單元的總出現(xiàn)頻率的總和； 鑒定百分?jǐn)?shù)等于每一分類單元的總出現(xiàn)頻率除以多項(xiàng)總發(fā)生頻率再乘以1〇〇%，全體 鑒定百分?jǐn)?shù)之和應(yīng)等于100% ; d、 待測(cè)菌株純培養(yǎng)后，進(jìn)行步驟a的11種生化實(shí)驗(yàn)； e、 獲得待測(cè)菌株的11種生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，根據(jù)生化反應(yīng)的陰、陽(yáng)，按照計(jì)算方法對(duì)數(shù)據(jù) 庫(kù)中所有分類單元進(jìn)行計(jì)算，首先將生化實(shí)驗(yàn)值轉(zhuǎn)換成概率值，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性則就是 對(duì)應(yīng)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值;若為陰性則100%減去生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值，上述結(jié)果若是 0或100%，則用近似值1%或99%代替，再按照步驟c的計(jì)算方法計(jì)算每一個(gè)分類單元的總 出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)； f、 根據(jù)計(jì)算結(jié)果，對(duì)待測(cè)菌株鑒定結(jié)果進(jìn)行判定:根據(jù)鑒定百分?jǐn)?shù)的大小進(jìn)行排序，鑒 定百分?jǐn)?shù)最高相對(duì)應(yīng)的菌株即為待測(cè)菌株所屬的分類單元。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法，其特征在于，所述的單核細(xì)胞增生李斯特 菌、英諾克李斯特菌、綿羊李斯特菌、西式李斯特菌、威爾氏李斯特菌和格式李斯特菌的李 斯特菌屬的數(shù)據(jù)庫(kù)如下表所示：3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌數(shù)值鑒定方法，其特征在于，所述的11種生化實(shí)驗(yàn)按照下 表分成了4組，分別賦值為1、2、4,當(dāng)待測(cè)菌株生化反應(yīng)結(jié)果為陰性時(shí)一律為0,由此形成生 化反應(yīng)譜；
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK105861621SQ201610423653
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】吳清平, 吳詩(shī), 葉青華, 張菊梅, 郭偉鵬, 蔡芷荷
【申請(qǐng)人】廣東省微生物研究所