一種快速鑒定大豆疫霉對(duì)烯酰嗎啉抗藥性的方法及專用引物對(duì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及大豆疫霉纖維素合酶相關(guān)基因CesA3的克隆及其在烯酰嗎啉抗性檢測(cè)及監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，具體公開(kāi)了一種鑒定大豆疫霉對(duì)烯酰嗎啉抗藥性的分子檢測(cè)方法及專用引物對(duì)。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。該引物對(duì)由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示DNA分子組成，其PCR退火溫度為61℃。本發(fā)明提供的檢測(cè)大豆疫霉對(duì)烯酰嗎啉產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的方法，具有靈敏度高、簡(jiǎn)捷快速、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可以用于快速、靈敏地檢測(cè)田間大豆疫霉對(duì)烯酰嗎啉的抗性發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)，對(duì)于病原菌抗性發(fā)生的早期預(yù)警具有重要意義，以達(dá)到指導(dǎo)并及時(shí)調(diào)整病害防治策略，有效控制病原菌抗藥性發(fā)展以及延長(zhǎng)殺菌劑市場(chǎng)壽命的目的。
【專利說(shuō)明】
-種快速鑒定大豆疫霉對(duì)稀醜嗎嘟抗藥性的方法及專用引 物對(duì)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及大豆疫霉纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3的克隆及其在締酷嗎嘟抗性檢測(cè) 及監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用，具體公開(kāi)一種快速鑒定大豆疫霉CesA3基因的核巧酸點(diǎn)突變及其對(duì)締酷 嗎嘟抗藥性的分子檢測(cè)方法及專用引物。屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆疫病是由大豆疫霉（Phyto曲thora sojae Kaufmann&Gerdemann)引起的一種 具有危險(xiǎn)性、毀滅性的卵菌病害。其在大豆各生育期均可發(fā)病，其中感病品種一般減產(chǎn)25% ~50%，高感品種可達(dá)90% W上，甚至絕收;并且巧粒蛋白含量明顯下降，使用價(jià)值受到影 響。該病害自1948年在美國(guó)印第安納州東北部首次被發(fā)現(xiàn)后，迅速擴(kuò)展到己西、阿根廷等20 多個(gè)國(guó)家;在我國(guó)則主要發(fā)生在黑龍江、安徽、福建等省，為重要的外檢和內(nèi)檢病害。
[0003] 大豆疫霉為同宗配合的卵菌，自然條件下即可發(fā)生有性生殖，加速了基因的重組 與交換，使得田間大豆疫霉菌株的遺傳多樣性越來(lái)越豐富；而且大豆疫霉生理小種毒性變 異明顯，新小種層出不窮，許多大豆抗性基因已被新的小種所克服，抗病資源失去效用。而 化學(xué)防治的快速有效，使之成為該病害防治中較為重要的措施。但目前國(guó)內(nèi)外?？谟糜诼?菌病害防治的殺菌劑種類較少，其中最具有代表性的是W甲霜靈為代表的苯酷胺類殺菌 劑，是第一代專口用于防治卵菌病害的一大類重要的內(nèi)吸性殺菌劑。然而，由于該類殺菌劑 的作用位點(diǎn)較為單一，而且大面積廣泛使用，致使病原菌對(duì)該類藥劑的抗藥性接遲而至，并 且發(fā)展迅速。目前病原菌對(duì)甲霜靈的抗性問(wèn)題已尤為嚴(yán)重，但抗性分子機(jī)制暫未有確切的 報(bào)道。簇酸酷胺類殺菌劑(化rboxylic acid amide,CAAs)是一類目前用于卵菌病害防治的 主要?dú)⒕鷦渲兄饕碛芯喛釂徉?、氣嗎嘟、雙烘酷菌胺W及異丙菌胺等。然而在使用 該類殺菌劑若干年之后，已經(jīng)在田間采集的葡萄霜霉病菌(Plasmopara Viticola) W及黃 瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)中檢測(cè)到對(duì)CAA類殺菌劑產(chǎn)生抗性的群體。
[0004] 植物病原菌抗藥性檢測(cè)或監(jiān)測(cè)中常見(jiàn)的兩種方法分為傳統(tǒng)生物學(xué)方法和分子生 物學(xué)方法。傳統(tǒng)生物學(xué)方法，包括菌落生長(zhǎng)測(cè)定法、菌絲干重測(cè)定法、抱子萌發(fā)測(cè)定法，還有 瓊脂展布法、抑菌圈測(cè)定法等。運(yùn)些方法是通過(guò)測(cè)定藥劑對(duì)病原菌的ECsoW區(qū)分敏感和抗性 菌株，通常需要多個(gè)藥劑處理，多次重復(fù)，因此就導(dǎo)致了運(yùn)種方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大、消 耗的人力資源和材料較多；而且運(yùn)種方法檢測(cè)靈敏度低，要求抗藥性菌株的突變頻率在1 % W上。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展與進(jìn)步，分子技術(shù)已在病原菌抗藥性檢測(cè)W及監(jiān)測(cè) 化agment Length Polymo巧hism)。而且，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較，分子生物學(xué)方法從提DNA 到特異性PCR或酶切分析，檢測(cè)所需時(shí)間短、檢測(cè)的靈敏度高，檢測(cè)頻率在1(T5~1(T4,更適 用于檢測(cè)低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3是否 存在抗締酷嗎嘟突變位點(diǎn)的方法及其專用引物對(duì)，W期能提供一種簡(jiǎn)單快速、高靈敏度的 分子檢測(cè)方法W用于締酷嗎嘟抗性菌株的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，W便及時(shí)了解抗藥性發(fā)生動(dòng)態(tài)。運(yùn) 對(duì)制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發(fā)展具有重要的意義。
[0006] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3是否存在 突變位點(diǎn)的引物對(duì)如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示DNA分子組成。
[0007] 本發(fā)明所提供的檢測(cè)或輔助檢測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3是否存在 抗締酷嗎嘟突變位點(diǎn)的方法如下：
[000引 W待測(cè)大豆疫霉的基因組DNA為模板，若用SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2扣L擴(kuò)增體系為：1化模板DNA(30-50ng)，每條引物（IOiiM)化L，12.5化2 X Taq Mix(購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司），9.5化（1加20。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94°C 4111111;941：303,611：303,721：303,30個(gè)循環(huán);最后72°(：下延伸10111111。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂 糖凝膠中電泳檢測(cè)。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為383bp的片段，則所述待測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相 關(guān)基因 CesA3存在或候選存在突變位點(diǎn)；所述突變位點(diǎn)是指大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基 因 CesA3的序列自5'末端起第3070位核巧酸為C，即是指SEQ ID N0:3中自5'末端起第3070 位核巧酸。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3W及對(duì)應(yīng)蛋白 的突變位點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明所提供的大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3的一個(gè)突變位點(diǎn)，為大豆 疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3基因組序列自5 '末端起第3070位核巧酸為C，即SEQ ID NO: 3中自5 '末端起的第3070位核巧酸。
[0011] 本發(fā)明所提供的大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)蛋白CesA3的一個(gè)突變位點(diǎn)，為大豆 疫霉中纖維素合酶相關(guān)蛋白CesA3自N端起第1024位氨基酸為亮氨酸，即是指SEQ ID N0:4 中自5 '末端起的第1024位氨基酸。
[0012] W上任一所述突變位點(diǎn)在鑒定大豆疫霉抗藥性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。所述抗藥性為抗締酷嗎嘟的抗藥性。
[0013] 上述應(yīng)用中，存在所述突變位點(diǎn)的大豆疫霉具有或候選具有對(duì)締酷嗎嘟的抗藥 性。
[0014] SEQ ID N0:3所示基因或SEQ ID N0:4所示蛋白也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明提供的檢測(cè)大豆疫霉對(duì)締酷嗎嘟產(chǎn)生抗藥性的點(diǎn)突變的方法，可W用于快 速、靈敏地檢測(cè)田間大豆疫霉對(duì)締酷嗎嘟的抗性發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)，W便及時(shí)調(diào)整病害防治策 略，W延緩和控制抗藥性的進(jìn)一步發(fā)展。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為對(duì)締酷嗎嘟表現(xiàn)抗性和敏感的大豆疫霉菌株纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3全 序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的一個(gè)堿基突變位點(diǎn)。其中，Ps6、Psl3和PsJMS2為敏感菌 株，RX9-1及RX9-2為抗性菌株。
[0017] 圖2為對(duì)締酷嗎嘟表現(xiàn)抗性和敏感的大豆疫霉菌株纖維素合酶相關(guān)蛋白CesA3全 序列比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的一個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)。其中，Ps6、Psl3和PsJMS2為敏感菌 株，RX9-1及RX9-2為抗性菌株。
[0018] 圖3為采用不同AS-PCR引物對(duì)進(jìn)行溫度梯度PCR擴(kuò)增電泳圖。S:敏感菌株;R:抗性 菌株；由上至下正向引物依次為Ps3070A.R、Ps3070T.R、Ps3070G.R、Ps3070C.R，正向引物均 為PS3070F。
[0019] 圖4為采用特異性引物對(duì)Ps3070F-Ps3070T.R擴(kuò)增對(duì)締酷嗎嘟表現(xiàn)敏感和抗性的 大豆疫霉菌株的AS-PCR電泳圖。Marker:Trans2K Plus DNA Marker;RX9-1 及RX9-2為抗性 菌株;Ps6、Ps 13和Ps JMS2為敏感菌株;CK為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0021] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022] 文中"抗性菌株"均指對(duì)締酷嗎嘟抗性的大豆疫霉菌株；"敏感菌株"均指對(duì)締酷嗎 嘟敏感的大豆疫霉菌株。
[0023] 下述實(shí)施例中使用的大豆疫霉菌株：RX9-1及RX9-2為抗性菌株；Ps6、Psl3和 PsJMS2為敏感菌株。
[0024] 上述菌株P(guān)s6和Psl3均采自于中國(guó)福建地區(qū)，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳福如研究員 饋贈(zèng)；PsJMS2采自于中國(guó)黑龍江地區(qū)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱振東研究員饋贈(zèng)?？剐跃?RRX9-1及RX9-2均通過(guò)締酷嗎嘟藥劑馴化的方法獲得，親本菌株均為Ps6dW上各菌株均經(jīng) 過(guò)現(xiàn)有的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為大豆疫霉菌株。上述各菌株均經(jīng)過(guò)菌落生長(zhǎng)速率 法進(jìn)行敏感性測(cè)定和抗藥性驗(yàn)證。
[0025] 實(shí)施例1、大豆疫霉對(duì)締酷嗎嘟的敏感性測(cè)定
[00%] 3株敏感菌株P(guān)s6、Ps 13和Ps JMS2; 2株抗性菌株RX9-1及RX9-2。
[0027] 胡蘿h培養(yǎng)基：胡蘿h200g，棒汁，4層紗布過(guò)濾，蒸饋水定容至lL，12rC濕熱滅菌 20min〇
[0028] 1、實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0029] 1)將締酷嗎嘟用二甲基亞諷(DMSO)配成5Xl〇Vg/ml的母液。對(duì)于3株大豆疫霉敏 感菌株的敏感性測(cè)定，將締酷嗎嘟稀釋成80yg/mL、lOOiig/mL、120蛇/血、140yg/mL、16化邑/ mU 18化g/mL和20化g/mL的濃度梯度。對(duì)于2株大豆疫霉抗性菌株的敏感性測(cè)定，締酷嗎嘟 被逐級(jí)稀釋成5 X l〇3yg/mL、1 X lOVg/mL、1.5 X l〇Vg/mL、2 X lOVg/mL和2.5 X lOVg/mL的 濃度梯度。
[0030] 2)按由低到高的順序，用移液槍吸取各個(gè)濃度梯度的藥液48化L加入已滅菌的冷 卻至45°C的480mL胡蘿h培養(yǎng)基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培養(yǎng)基倒入直徑為9cm 的培養(yǎng)皿中，W只加48化L DMSO的處理為空白對(duì)照。每個(gè)濃度重復(fù)3次。
[0031] 3)取25°C下黑暗培養(yǎng)4天后的大豆疫霉菌株，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為 0.5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對(duì)照平板中，置于25°C培養(yǎng)箱中黑暗培 養(yǎng)，4d后測(cè)量菌落直徑。
[0032] 4)十字交叉法測(cè)量菌落直徑，根據(jù)菌落平均直徑值計(jì)算出各個(gè)濃度下對(duì)供試菌株 的菌絲生長(zhǎng)的抑制率。然后將抑制率轉(zhuǎn)化成機(jī)率值(Y)，藥劑濃度轉(zhuǎn)換成WlO為底的對(duì)數(shù)值 (X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，分別求出各個(gè)供試大豆疫霉菌株對(duì)締酷嗎嘟的毒 力回歸曲線方程Y = a+bX，W及相關(guān)系數(shù)r和有效抑制中濃度ECso值。
[0033]
[0034] 2.結(jié)果
[0035] 表1 3株大豆疫霉敏感菌株和4株大豆疫霉抗性菌株對(duì)4中締酷嗎嘟的敏感性 [00361
[0037] 敏感性測(cè)定結(jié)果表明，締酷嗎嘟對(duì)敏感菌株P(guān)s6、Psl3和PsJMS2的ECsq均小于化g/ mL，而對(duì)抗性菌株RX9-1及RX9-2的ECsq均大于lOiig/mL，有的甚至大于25 yg/mL，抗性倍數(shù)均 在100倍W上。
[0038] 實(shí)施例2、大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3及其對(duì)應(yīng)蛋白突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)
[0039] 1、菌株:抗性菌株RX9-1及RX9-2，敏感菌株P(guān)s6、Ps 13和Ps JMS2。
[0040] 2、方法：
[0041 ] 1)模板:分別W抗性菌株和敏感菌株的基因組DNA及CDNA為模板。
[0042] 2)纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3全序列的PCR擴(kuò)增
[0043] 引物（表2):口8 06343尸（5'-67^61'〔6176〇：7^4〇：-3'）
[0044] Ps CesA3R(5'-TACTGCCTTCCCGTTTCCT-3'）
[0045] 采用北京全式金生物技術(shù)有限公司試劑，5化L反應(yīng)體系中包括1化模板DNA(30-50ng)，化L10mMdNTP，化L10X擴(kuò)增緩沖液（含20mMMg 2+)，l化l'aqDNA聚合酶（5UA^L)， 每條引物（IOyM)化L，3化L d地2〇,反應(yīng)體系根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)需要進(jìn)行成倍增減。反應(yīng)程序?yàn)椋?預(yù)變性 941：4111111;941：3〇3,581：3〇3,721：31111113〇3,35個(gè)循環(huán)；最后72°(：下延伸1〇111111。擴(kuò)增 產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。
[0046] 3)測(cè)序
[0047] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物見(jiàn)表2。W基因組DNA為模板時(shí)，抗性菌株的纖維素 合酶相關(guān)基因 CesA3全序列共3165bp，序列如SEQ ID N0:3所示，無(wú)內(nèi)含子序列，共編碼1054 個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID NO:4所示。
[004引 4)序列比對(duì)
[0049]分別將抗性菌株RX9-1及RX9-2,與敏感菌株P(guān)s6、Psl3和PsJMS2的纖維素合酶相關(guān) 基因 CesA3全序列進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)DANMAN軟件分析序列結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在如下突變位點(diǎn)：與敏 感菌株相比，抗性菌株RX9-1和RX9-2的纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3自5'末端起在基因序列 的第3070位核巧酸由G突變?yōu)镃(圖1)，該位點(diǎn)堿基突變導(dǎo)致氨基酸序列在第1024位發(fā)生突 變，由鄉(xiāng)氨酸(化1，V)突變?yōu)榱涟彼峄痚u，L)(圖2)。
[0050] 實(shí)施例3、檢測(cè)大豆疫霉中突變位點(diǎn)的方法
[0051] 1、引物設(shè)計(jì)
[0052] 菌株為實(shí)施例1中所用菌株P(guān)s6、RX2-l和RX9-1。
[0053] 根據(jù)突變體RX9-1纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3的序列設(shè)計(jì)AS-PCR引物。引物對(duì) Ps3070F-Ps3070A/T/C/G.R用于檢測(cè)G3070C的突變位點(diǎn)。其中，反向引物PS3070A.R的3'-端 最后一個(gè)堿基為突變后的堿基，正向引物為PS3070F(表2)。為了增加引物的特異性，在反向 引物3 ' -端第二個(gè)堿基引入錯(cuò)配堿基(表2，引物PS3070T/C/G. R)。
[0054] 表2檢測(cè)對(duì)締酷嗎嘟表現(xiàn)抗性的大豆疫霉菌株所使用的PCR引物 [00551
[0056]具體反應(yīng)體系與實(shí)施例2中相同，對(duì)引物進(jìn)行不同退火溫度的溫度梯度PCR，確定 特異性高的退火溫度。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94 °C 4min; 94 °C 30 s，50-68 °C 30 s，72 °C 30 s，35個(gè) 循環(huán);最后72°C下延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。
[0化7] 結(jié)果如圖3所示，引物對(duì)Ps3070F-Ps3070A. R在50-6rC的退火溫度下均能從敏感 菌株和抗性菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出383bp的片段，不能很好地將之區(qū)分開(kāi)。在64.4°C的 退火溫度下，雖然引物對(duì)Ps3070F-Ps3070A. R僅能從抗性菌株中擴(kuò)增出目的片段，但條帶亮 度較弱，擴(kuò)增效率不高。當(dāng)退火溫度為ere時(shí)，引物對(duì)Ps3070F-Ps3070T/G/C.R能夠從抗性 菌株RX9-1的基因組DNA中擴(kuò)增出383bp的片段，而不能從敏感菌株中擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。其 中Ps3070F-Ps3070T引物對(duì)的PCR條帶亮度最強(qiáng)，特異性最強(qiáng)。因此選擇Ps3070F-Ps3070T引 物對(duì)作為AS-PCR引物用來(lái)檢測(cè)G3070C的突變位點(diǎn)，退火溫度為ere。將引物對(duì)PS3070F-?330701'.1?對(duì)抗性菌株1?9-1的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果?0?產(chǎn)物序列為569 10^:3中自5' 末端起第2711至3093位核巧酸序列。
[005引 2、檢測(cè)突變位點(diǎn)
[0059] W待測(cè)大豆疫霉？36、？313、？3廁52、1?9-1和1?9-2的基因組0魁為模板，采用引物 對(duì)Ps3070F-Ps3070T.R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若得到383bp的片段，則判定所檢測(cè)的大豆疫霉基因組 中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3自5'末端起第3070位核巧酸為C(即SEQ ID N0:3中自5'末端 起第3070位核巧酸為C)，進(jìn)一步判定所述菌株為締酷嗎嘟抗性菌株。
[0060] PCR反應(yīng)體系如下：
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]
[0(?日]結(jié)果如圖4所示，引物對(duì)Ps3070F-Ps3070T.R能夠從對(duì)締酷嗎嘟表現(xiàn)抗性的大豆疫 霉菌株RX9-1和RX9-2中擴(kuò)增出特異性片段，而在敏感菌株P(guān)s6、Psl3和PsJMS2中均未擴(kuò)增出 任何條帶，表明該對(duì)引物可W用于特異性檢測(cè)大豆疫霉是否對(duì)締酷嗎嘟產(chǎn)生了抗性。











【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3或?qū)?yīng)蛋白是否存在位 點(diǎn)突變的方法，步驟如下： 以待測(cè)大豆疫霉的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。若PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為383bp的片段，則所述待測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3存在或候選存在突變位點(diǎn)G3070C，且所述突變位點(diǎn)是指大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān) 基因 CesA3的基因組序列自5 '末端起第3070位核苷酸為C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示引物 對(duì)的PCR擴(kuò)增中，退火溫度為61°C。3. -種檢測(cè)或輔助檢測(cè)大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3是否存在突變位點(diǎn)的引 物對(duì)，由SEQ ID N0:1和SEQ ID從)：2所示0嫩分子組成。4. 大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)基因 CesA3的一個(gè)突變位點(diǎn)，為大豆疫霉中纖維素合酶 相關(guān)基因 CesA3的基因組序列自5 '末端起第3070位核苷酸為C。5. 大豆疫霉中纖維素合酶相關(guān)蛋白CesA3的一個(gè)突變位點(diǎn)，為大豆疫霉中纖維素合酶 相關(guān)蛋白CesA3自N端起第1024位氨基酸為亮氨酸(Leu，L)。6. 權(quán)利要求4或5所述突變位點(diǎn)在鑒定大豆疫霉抗藥性中的應(yīng)用;所述抗藥性是指對(duì)烯 酰嗎啉的抗藥性。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:存在所述突變位點(diǎn)的大豆疫霉具有或候選 具有對(duì)烯酰嗎啉的抗藥性。 8.SEQ ID NO:3所示基因。 9.SEQ ID NO:4所示蛋白。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861655SQ201610220525
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月11日
【發(fā)明人】劉西莉, 蔡萌, 林東, 苗建強(qiáng), 陳磊, 畢揚(yáng), 宋晰, 李健強(qiáng), 劉鵬飛, 張文華
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)