一種熒光定量pcr熱循環(huán)儀的pcr預(yù)混液及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液及其制備方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該PCR預(yù)混液是以DNA雙鏈嵌入SYTO13為熒光標(biāo)記物，以染料CXR為參比熒光。本發(fā)明專為熒光定量PCR熱循環(huán)儀研制，該預(yù)混液在熒光定量PCR儀器中應(yīng)用效果穩(wěn)定。本發(fā)明以SYTO13為熒光標(biāo)記物，該染料對PCR反應(yīng)無抑制，熒光強度更高，與雙鏈結(jié)合更具特異性；添加適宜濃度的參比熒光染料CXR，可與熒光定量PCR儀匹配；選用熱啟動Taq DNA聚合酶，避免常溫下引物與模板發(fā)生反應(yīng)的同時降低PCR實驗時間，提高PCR反應(yīng)效率和特異性。
【專利說明】
-種黃光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種巧光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液及其制備方法與應(yīng)用，屬于生 物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧光定量PCR是在普通的PCR反應(yīng)中添加巧光標(biāo)記物，在PCR反應(yīng)的每一個循環(huán)退 火或延伸階段收集巧光信號，通過巧光信號的變化來實時監(jiān)測PCR反應(yīng)情況并對初始模板 進行定量的技術(shù)。該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、可實時監(jiān)測反應(yīng)進程、可對初始模板進 行定量分析、無需后續(xù)操作、環(huán)境污染風(fēng)險低、分析時間短等諸多優(yōu)點，在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和 食品科學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用。從標(biāo)記方式來分類，巧光定量PCR主要分為染色標(biāo)記法和探針 標(biāo)記法兩種。探針法巧光定量PCR可W同時標(biāo)記并定量多種特異性產(chǎn)物，但探針合成價格十 分昂貴，在大量分析樣本的實驗中應(yīng)用受到限制，而染色法巧光定量PCR價格相對便宜，可 W通過溶解曲線對擴增產(chǎn)物進行鑒別，可根據(jù)解鏈溫度差異同時鑒別3種不同的特異性產(chǎn) 物。
[0003] 目前市面上主流染色法巧光定量PCR試劑盒均W綠色巧光DNA雙鏈嵌入染料SYBR GreenI為巧光標(biāo)記物，巧光染料通過靜電，范德華力，疏水性和空間相互作用與DNA結(jié)合，運 些相互作用都受到染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)影響。經(jīng)過國內(nèi)外大量實驗研究證實，SYBR GreenI具有 諸多缺點，如染料濃度較高時對PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制、濃度低時巧光強度太低影響PCR結(jié)果分 析、對初始模板GC含量要求較高、反應(yīng)過程中易出現(xiàn)假陽性擴增和生成引物二聚體等。而其 他染料為標(biāo)記物如EvaGreen和BYRT的巧光定量PCR試劑盒，大部分由國外試劑廠家生產(chǎn)，價 格昂貴。
[0004] 關(guān)于DNA聚合酶和緩沖液，為了控制成本，大多數(shù)巧光定量PCR預(yù)混液中的普通DNA 聚合酶在室溫下也具有活性，因此預(yù)混液要嚴(yán)格進行冷凍儲存，在預(yù)混液的使用過程中，必 須要求進行冰上操作W防止DNA聚合酶催化體系反應(yīng)，影響分析效果，同時采取較為復(fù)雜的 預(yù)熱步驟，增加巧光定量PCR反應(yīng)的時間的同時，也帶來了DNA酶、模板、引物降解的風(fēng)險和 引物二聚體生成的風(fēng)險。
[0005] 實時巧光PCR熱循環(huán)儀在我國各科研單位普及率較高，在各種研究中應(yīng)用廣泛，國 內(nèi)沒有關(guān)于SYT013在巧光定量PCR中應(yīng)用的研究。SYT013在巧光定量PCR中的應(yīng)用優(yōu)勢明 顯，但目前尚沒有WSYT013為巧光標(biāo)記物的適用于巧光定量PCR熱循環(huán)儀的預(yù)混液的相關(guān) 發(fā)明。因此，建立一種巧光強度較高、與雙鏈DNA結(jié)合特異性更強、價格相對合理、可W廣泛 應(yīng)用于巧光定量PCR熱循環(huán)儀的預(yù)混液，具有重要的創(chuàng)新實驗意義和經(jīng)濟學(xué)價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種巧光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液及 其制備方法與應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種巧光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液，該預(yù)混液是W DNA雙鏈嵌入SYTOl3為巧光標(biāo)記物，W染料CXR為參比巧光。
[000引優(yōu)選地，每ImL所述PCR預(yù)混液中含有扣mol~20WHO1染料SYT013和30pmol~ 120pmol參比巧光CXR。
[0009] 優(yōu)選地，每ImL所述PCR預(yù)混液包含：染料SYT013 Swiiol~20郵1〇1，參比巧光CXR 30pmol~120pmol、DNA聚合酶40U~100U、（NH4)2S04 0~4皿〇1、丙S醇0-80化和DMSO 0-100 化。
[0010] 優(yōu)選地，每ImL所述PCR預(yù)混液包含：染料SYT013 Swiiol~20郵1〇1，參比巧光CXR 30pmol~120pmol、熱啟動DNA聚合酶40U~100U、（NH4)2S04 0~化mol、丙S醇0-80iiL、DMS0 0-100jiL、KCl 40皿〇1 ~80皿oUTris 10皿〇1 ~30皿oUMgCb 2皿〇1 ~4皿oUdNTPs 1.8]i mol ~3皿〇1。
[0011 ] 更優(yōu)選地，每1血所述PCR預(yù)混液包含:染料SYTO13 10皿01~15皿01，參比巧光CXR 45pmol~90pmol、熱啟動DNA聚合酶4抓~65U、（NH4)2S04 1皿〇1~化mol、丙S醇55化-7扣L、 DMSO 60化-90化、KCl 50皿〇1 ~70皿oUTris 20皿〇1 ~30]imol、MgCl2 2.5皿〇1 ~3.扣mol、 dNTPs 2.1 皿〇1 ~2.7皿〇1。
[0012] 最優(yōu)選地，每ImL所述PCR預(yù)混液包含：染料SYT013 12皿〇1，參比巧光CXR eOpmol、 熱啟動DNA聚合酶50U、（NH4)2S04 化mol、丙S醇60化、DMSO 70化、KCl 6〇Miol、Tris 2化 mol、MgCl2 3皿oUdNTPs 2.4皿〇1，其余組成為雙蒸水。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種上述任一 PCR預(yù)混液的制備方法，其特征在于，步驟如下：
[0014] 1)分別制備KCl溶液、Tris溶液、（NH4)2S04溶液、MgCb溶解，震蕩混勻，4°C膽存?zhèn)?用；
[00巧]2)然后分別將無菌雙蒸水，與步驟1)制備的KCl溶液，his溶液，（畑4佔〇4溶液，和 MgCb溶液預(yù)混于滅菌膽存管中，調(diào)節(jié)溶液pH至8.5，混勻后滅菌，獲得預(yù)處理混合液;所述 KCl含量為40皿〇1~SOwnol;所述(NH4)2S化含量為0-4皿〇1;所述化is溶液含量為lOwnol~ 30皿01;所述MgCl 2含量為2皿01~4皿01;
[0016] 3)向步驟2)所得預(yù)處理混合液中依次加入1.如mo 1~化mo 1 dNTPs、40U~IOOU DNA聚合酶、5皿01 ~20皿01 染料SYTO13、30pmo 1 ~120pmo 1 參比巧光CXR、0-100化 DMSO和0-8化L丙S醇，混勻后離屯、，最后加入無菌雙蒸水至ImL,混勻后離屯、，上清液即為PCR預(yù)混液；
[0017] 4)將步驟3)獲得的PCR預(yù)混液包裝后獲得成品，于-20°C避光保存。
[0018] 優(yōu)選地，步驟2)所述預(yù)混，是在環(huán)境溫度4 °C下完成;步驟2)所述滅菌，條件為126 °C, ISmin O
[0019] 優(yōu)選地，所述混勻，為2500r/min下縱滿震蕩30s;所述離屯、，條件為4000 X g，30s。
[0020] W上所述任一方法在巧光定量PCR檢測中的應(yīng)用。
[0021] W上所述任一方法在配備適用于巧光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液及巧光定量 PCR檢測中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明通過自主探索巧光定量PCR預(yù)混液的各組分及比例，直接W原料進行預(yù)混 液的配制，獲得與商業(yè)試劑盒類似或者更優(yōu)的實驗結(jié)果，并大大降低了巧光定量PCR實驗的 成本。
[0023] 本發(fā)明W雙鏈DNA小溝嵌入巧光染料SYT013為巧光標(biāo)記物，SYTO系列巧光染料依 賴電荷與DNA結(jié)合，比其他花青染料疏水性更強，并主要結(jié)合DNA雙鏈螺旋小溝，避免了假陽 性結(jié)果的產(chǎn)生。經(jīng)研究證實，綠色巧光染料SYT013在巧光定量PCR中的應(yīng)用效果要優(yōu)于SYBR GreenLSYTOl3在應(yīng)用于巧光定量PCR的過程中，具有較高的巧光強度，更易識別，染料濃度 對PCR反應(yīng)無抑制、對GC含量高的模板結(jié)合能力不受影響。
[0024] 本發(fā)明在預(yù)混液中添加了適宜濃度的參比巧光染料CXR(carboxy-X-rhodamine)， 該巧光染料具有與ROX相似的特性，在實驗中發(fā)現(xiàn)，CXR與SYT013配伍的效果要優(yōu)于R0X，故 Wcxr為參比巧光，用W校正孔板間加樣差距。
[0025] 本發(fā)明中采用熱啟動DNA聚合酶，該酶在室溫的條件下，活性會被抗體阻斷，從而 降低非特異性反應(yīng)發(fā)生的幾率，熱啟動DNA聚合酶在95°C加熱2min時可完全激活，大大降低 預(yù)反應(yīng)時間，減少底物降解和非特異性擴增的風(fēng)險。
[0026] 本發(fā)明特別在預(yù)混液中添加了（畑4)2S〇4、丙立醇和DMSO(二甲基亞諷）。（NH4)2S化 的作用在于可W釋放錠離子，使PCR體系中非特異性產(chǎn)物雙鏈解開，提高特異性，降低非特 異性產(chǎn)物產(chǎn)生的幾率，同時使適宜退火溫度范圍增大，可W廣泛適用于不同模板的擴增； DMSO的作用是可W促進引物和模板的解鏈，適當(dāng)降低退火溫度，降低引物二聚體和模板之 間復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)生成的幾率;丙S醇的作用是保護化q酶，增加酶的穩(wěn)定性，W提高產(chǎn)量，同 時由于丙S醇具有一定粘稠性，在配制PCR預(yù)混液時加入丙S醇，可W適當(dāng)降低預(yù)混液的流 動性，使預(yù)混液各組分不至飛瓣和掛壁，有利于各組分總量的穩(wěn)定和充分混勻。
[0027] 本發(fā)明有益效果：
[00%] 1、本發(fā)明專為巧光定量PCR熱循環(huán)儀研制，經(jīng)證實，該預(yù)混液在巧光定量PCR儀器 中應(yīng)用效果穩(wěn)定。本發(fā)明W具有細胞膜穿透特性的DNA雙鏈小溝嵌入染料SYT013為巧光標(biāo) 記物，該染料對PCR反應(yīng)無抑制，巧光強度更高，與雙鏈結(jié)合更具特異性;添加適宜濃度的參 比巧光染料CXR，可與巧光定量PCR儀匹配;選用熱啟動化q DNA聚合酶，避免常溫下引物與 模板發(fā)生反應(yīng)的同時，降低PCR實驗時間，提高PCR反應(yīng)效率和特異性;在預(yù)混液中添加適當(dāng) 比例的（畑4) 2S〇4、丙S醇和DMSO，有利于保護DNA聚合酶、降低退火溫度、提高PCR特異性和 產(chǎn)物量。
[0029] 2、本發(fā)明預(yù)混液操作簡便，節(jié)約時間，成本低廉，特異性強，靈敏度高。經(jīng)驗證通過 該預(yù)混液進行巧光定量PCR擴增，高于市售巧光定量PCR預(yù)混液，靈敏度高于市售巧光定量 PCR預(yù)混液，并能產(chǎn)生更低Ct值和更強的巧光信號。
[0030] 3、本發(fā)明相比于現(xiàn)有市售巧光定量PCR預(yù)混液技術(shù)，選擇了對PCR反應(yīng)無抑制的、 可穿透細胞膜的SYT013 DNA嵌入巧光染料，W及化學(xué)性質(zhì)、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的C邸參比巧光， 并特別添加了熱啟動DNA聚合酶，解決了現(xiàn)有預(yù)混液價格昂貴、容易產(chǎn)生PCR抑制、預(yù)變性時 間長、易產(chǎn)生非特異性擴增、巧光信號不強等缺點，本發(fā)明取得了擴增效率接近100%的優(yōu) 良效果。
【附圖說明】
[0031] 圖1預(yù)混液I n和虹中染料巧光強度；
[0032] (A，預(yù)混液I中染料巧光強度;B，預(yù)混液n中染料巧光強度;C，預(yù)混液虹中染料巧 光強度）。
[0033] 圖2預(yù)混液V靈敏度的判定。
【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0035] 本發(fā)明所用試劑、材料、方法和儀器，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑、材料、 方法和儀器，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0036] 所述預(yù)混液的制備方法如下：
[0037] 1)分別制備KCl溶液、Tris溶液、（NH4)2S04溶液、MgCb溶解，震蕩混勻，4°C膽存?zhèn)?用；
[0038] 2)然后分別將無菌雙蒸水，與步驟1)制備的KCl溶液，Tris溶液，（NH4)2S化溶液，和 MgCb溶液預(yù)混于滅菌膽存管中，調(diào)節(jié)溶液pH至8.5，混勻后滅菌，獲得預(yù)處理混合液;所述 KCl含量為40皿〇1~SOwnol;所述(NH4)2S化含量為0-4皿〇1;所述化is溶液含量為lOwnol~ 30皿〇1;所述MgCb含量為2皿〇1~4皿〇1;
[0039] 3)向步驟2)所得預(yù)處理混合液中依次加入1.如mo 1~化mo 1 dNTPs、40U~IOOU DNA聚合酶、5皿01 ~20皿01 染料SYTO13、30pmo 1 ~120pmo 1 參比巧光CXR、0-100化 DMSO和0-8化L丙S醇，混勻后離屯、，最后加入無菌雙蒸水至ImL,混勻后離屯、，上清液即為PCR預(yù)混液；
[0040] 4)將步驟3)獲得的PCR預(yù)混液包裝后獲得成品，于-20°C避光保存。
[0041 ] 實施例1:
[0042] DNA嵌入巧光染料SYTOl 3 (5mM)添加化L，參比巧光染料CXR( 30皿01) 1化，KCl溶液 (lmol/L)80化，丙S醇80化，DMSO 60化，Tris溶液（lmol/L)10iiL，MgCl2溶液（0.1mol/L)20y L，dNTPs溶液侶化，熱啟動DNA聚合酶(2.抓/化)添加16化
[0043] 配制工序：
[0044] 設(shè)備、耗材的滅菌一一無機化合物KCl、Tris、MgCb溶液的配制一一無機化合物溶 液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1 (依次加入20化L雙蒸水、KCl 溶液、Tris溶液、MgCb溶液)一一高濃度肥1調(diào)節(jié)溶液抑至8.5--25(K)r/min縱滿震蕩30s， 4000 X g離屯、時間30s-一無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min) -一冷卻膽存(4 °0--配料2 (依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYTOl 3、丙S醇、DMSO)--2500r/min縱滿 震蕩30s，4000 X g離屯、時間30s--2500r/min縱滿震蕩30s，混勻組分后靜置--避光包 裝---20°C冷凍儲存。
[0045] 實施例2
[0046] DNA嵌入巧光染料SYT013(5mM)添加2.4化，參比巧光染料〔乂3(30皿〇1)2化，1((：1溶 液（Imo 1 /L) 80化，丙S醇80化，DMSO 100化，Tri S溶液（Imo 1 /L) 25化，MgCl2 (0.1 mo 1 /L)溶液 30化，dNTPs溶液60化，熱啟動DNA聚合酶(2.抓/化)添加20化
[0047] 配制工序：
[004引設(shè)備、耗材的滅菌一一無機化合物KCl、Tris、MgCb溶液的配制一一無機化合物溶 液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1 (依次加入20化L雙蒸水、KCl 溶液、Tris溶液、MgCb溶液)一一高濃度肥1調(diào)節(jié)溶液抑至8.5--25(K)r/min縱滿震蕩30s， 4000 X g離屯、時間30s-一無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min) -一冷卻膽存(4 °0--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYT013、參比巧光CXR、丙S醇、DMSO)-- 2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--2500r/min縱滿震蕩30s，混勻組分后靜 置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[0049] 實施例3:
[00加]DNA嵌入巧光染料SYT013(5mM)添加化L，參比巧光染料CXR(30皿〇1)4化，KCl溶液 (lmol/L)80 化，丙 S醇 80 化，DMSO 100化，化18(1111〇1/1)溶液30化，]\%(：12溶液（0.1111〇1/1)40 化，dNTPs溶液，熱啟動DNA聚合酶(2.抓/化)添加40化 [0化1] 配制工序：
[0052]設(shè)備、耗材的滅菌一一無機化合物KCl、Tris、MgCb溶液的配制一一無機化合物溶 液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1 (依次加入20化L雙蒸水、KCl 溶液、Tris溶液、MgCb溶液)一一高濃度肥1調(diào)節(jié)溶液抑至8.5--25(K)r/min縱滿震蕩30s， 4000 X g離屯、時間30s-一無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min) -一冷卻膽存(4 °0--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYT013、參比巧光CXR、丙S醇、DMSO)-- 2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--2500r/min縱滿震蕩30s，混勻組分后靜 置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[0化3] 實施例4:
[0054] DNA嵌入巧光染料SYTOl3 (5mM)添加2.4化，參比巧光染料CXR( 30WI101) 2化，KCl (Imol/L)溶液70化，丙S醇55化，DMSO 70化，（NH4)2S04溶液（0.1mol/L)10化，Tris溶液 (lmol/L)20 化，MgCb 溶液（0.1mol/L)25 化，dNTPs 溶液 52.扣 L，熱啟動 DNA 聚合酶（2.511/化） 添加1祉L
[0化5] 配制工序：
[0056]設(shè)備、耗材的滅菌--無機化合物KC1、化is、（NH4)2S〇4、MgCl2溶液的配制--無 機化合物溶液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1(依次加入20化L 雙蒸水、KC1溶液、Tr i S溶液、（NH4)2S〇4溶液、MgC 12溶液）--高濃度HC1調(diào)節(jié)溶液pH至 8.5- -2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min)--冷卻膽存(4°C)--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYT013、參 比巧光CXR、DMS0、丙S醇)--2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、30s--2500r/min 縱 滿震蕩30s，混勻組分后靜置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[0化7] 實施例5:
[0化引 DNA嵌入巧光染料SYT013(5mM)添加2.4化，參比巧光染料〔乂3(30皿01)2化，1((：1溶 液（lmol/L)60化，丙S醇60化，DMSO 70化，（NH4)2S04溶液（0.1mol/L)20化，Tris溶液（lmol/ L) ，MgCl2溶液(0.1 mo 1 /L) 30化，dNTPs溶液60化，熱啟動DNA聚合酶(2.511/化)添加20化
[0化9] 配制工序：
[0060] 設(shè)備、耗材的滅菌--無機化合物KC1、化is、（NH4)2S〇4、MgCl2溶液的配制--無 機化合物溶液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1(依次加入20化L 雙蒸水、KC1溶液、Tr i S溶液、（NH4)2S〇4溶液、MgC 12溶液）--高濃度HC1調(diào)節(jié)溶液pH至 8.5- -2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min)--冷卻膽存(4°C)--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYT013、參 比巧光CXR、DMS0、丙S醇）--2500r/min縱滿震蕩30s，4000 X g離屯、時間30s--2500r/ min縱滿震蕩30s，混勻組分后靜置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[0061] 實施例6:
[0062] DNA嵌入巧光染料SYT013(5mM)添加2.4化，參比巧光染料〔乂3(30皿〇1)2化，1((：1溶 液（lmol/L)40化，丙S醇75化，DMSO 70化，（NH4)2S04溶液（0.1mol/L)40化，Tris溶液（lmol/ U25化，MgCb溶液(0. lmol/L)35化，dNTPs溶液67.5化，熱啟動DNA聚合酶（2.511/化)添加26 化
[0063] 配制工序：
[0064] 設(shè)備、耗材的滅菌--無機化合物KC1、化is、（NH4)2S〇4、MgCl2溶液的配制--無 機化合物溶液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1(依次加入20化L 雙蒸水、KC1溶液、Tr i S溶液、（NH4)2S〇4溶液、MgC 12溶液）--高濃度HC1調(diào)節(jié)溶液pH至 8.5- -2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min)--冷卻膽存(4°C)--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYT013、參 比巧光CXR、DMS0、丙S醇）--2500r/min縱滿震蕩30s，4000 X g離屯、時間30s--2500r/ min縱滿震蕩30s，混勻組分后靜置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[00化]實施例7:
[0066] DNA嵌入巧光染料SYT013(5mM)添加化L，參比巧光染料CXR(30皿〇1)1.5化，KCl溶 液（Imo 1 /L) 60化，丙S醇化L，DMSO 90化，（畑4) 2S〇4溶液（0.1 mo 1 /L) 20化，化i S溶液（Imo 1 / L) ，MgCl2溶液(0.1 mo 1 /L) 30化，dNTPs溶液60化，熱啟動DNA聚合酶(2.511/化)添加20化
[0067] 配制工序：
[006引設(shè)備、耗材的滅菌--無機化合物KC1、化is、（NH4)2S04、MgCl2溶液的配制--無 機化合物溶液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1(依次加入20化L 雙蒸水、KC1溶液、Tr i S溶液、（NH4)2S04溶液、MgC 12溶液）--高濃度HC1調(diào)節(jié)溶液pH至 8.5- -2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--無機化合物溶液滅菌(溫度126 °C，殺菌15min)--冷卻膽存(4°C)--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料SYT013、參 比巧光CXR、DMS0)--2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--2500r/min縱滿震 蕩30s，混勻組分后靜置--避光包裝---20 °C冷凍儲存。
[0069] 實施例8:
[0070] DNA嵌入巧光染料SYT013(5mM)添加2.4化，參比巧光染料〔乂3(30皿〇1)2化，1((：1溶 液（lmol/L)60化，丙S醇60化，DMSO 0化，（NH4)2S04溶液（0.1mol/L)20化，Tris溶液（lmol/ L) 20化，MgCl2溶液(0.1 mo 1 /L) 30化，dNTPs溶液60化，熱啟動DNA聚合酶(2.511/化)添加20化
[0071] 配制工序：
[0072] 設(shè)備、耗材的滅菌--無機化合物KCl、Tr i S、（NH4) 2S〇4、MgCl2溶液溶液的配 制一一無機化合物溶液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1(依次 加入20化L雙蒸水、KCl溶液、Tri S溶液、（畑4) 2S化溶液、MgCl2溶液)一一高濃度肥1調(diào)節(jié)溶液 抑至8.5--2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--無機化合物溶液滅菌(溫度 126°(：，殺菌15111111)--冷卻膽存（4°C)--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料 8￥1'013、參比巧光〔乂1?、丙^醇）--2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s-- 250化/min縱滿震蕩30s，混勻組分后靜置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[0073] 實施例9:
[0074] DNA嵌入巧光染料SYTOl 3 (5mM)添加化L，參比巧光染料CXR( 30皿01) 3化，KCl溶液 (lmol/L)50化，丙S醇化UDMSO 0化，（NH4)2S04溶液（0.1mol/L)30化，IYis溶液（lmol/L)25 化，MgCl2溶液(O. Imo I/L) 30化，dNTPs溶液60化，熱啟動DNA聚合酶(2.5UAiL)添加20化 [00巧]配制工序：
[0076] 設(shè)備、耗材的滅菌--無機化合物KCl、Tr i S、（NH4) 2S〇4、MgCl2溶液溶液的配 制一一無機化合物溶液滅菌(溫度126°C，時間15min)-一冷卻膽存(4°C)一一配料1(依次 加入20化L雙蒸水、KCl溶液、Tri S溶液、（畑4) 2S化溶液、MgCl2溶液)一一高濃度肥1調(diào)節(jié)溶液 抑至8.5--2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--無機化合物溶液滅菌(溫度 126°(：，殺菌15111111)--冷卻膽存（4°C)--配料2(依次加入dNTPs、DNA聚合酶、染料 SYT013、參比巧光CXR)--2500r/min縱滿震蕩30s，4000Xg離屯、時間30s--2500r/min縱 滿震蕩30s，混勻組分后靜置一一避光包裝---20°C冷凍儲存。
[0077] 實施例10:預(yù)混液(2X)的應(yīng)用效果評價。
[007引 1.實驗材料；
[00巧]DSYTOl 3巧光定量PCR預(yù)混液配方
[0080] W每 1000化計，預(yù)混液KSYT013 5皿ol，C邸 30pmol，KCl 80皿〇1，丙S醇80化、 DMS060化，不含（NH4)2S〇4，Tris 10皿ol，MgCl2 化mol，dNTPs 1.如mol,熱啟動DNA聚合酶 40U);預(yù)混液n(SYT013 12皿ol，CXR 60pmol，KCl 80皿〇1，丙S醇80化、DMSO 100化，不含 (NH4)2S〇4，Tris 2化mol，MgCl2 化mol，dNTPs 2.4皿〇1，熱啟動DNA聚合酶50U);預(yù)混液虹 (SYT013 20皿ol，CXR 120pmol，KCl 80皿〇1，丙S醇80化、DMSO 100化，不含（NH4)2S〇4，Tris 30皿ol，MgCl2 4wiiol，dNTPs 3皿〇1，熱啟動DNA聚合酶 100U);預(yù)混液IV(SYT013 12皿〇1， C邸 60pmol，KCl 70皿〇1，丙S醇55化、DMSO 70化，（NH4)2S04 1 皿ol，Tris 20皿ol，MgCl2 2.5皿〇1，(1^?3 2.1皿〇1，熱啟動0魁聚合酶451]);預(yù)混液￥(5￥1'013 12皿〇1，〔乂1?6化111〇1， 雌160皿〇1，丙^醇60化，015070化，（畑4)2504 2皿〇1，化18 2扣111〇1，1邑(：12：3皿〇1，(1腳口8 2.4皿〇1，熱啟動0臟聚合酶5011);預(yù)混液￥1(5￥1'013 12皿〇1，〔乂1?609111〇1，1((：140皿〇1，丙^ 醇75化，DMS070化，（NH4)2S04 4皿ol，Tris 25皿ol，MgCl2 3.5皿ol，dNTPs 2.化mol,熱啟動 DNA聚合酶65U);預(yù)混液VH(SYT013 10皿ol，CXR 45pmol，KCl 60皿〇1，不含丙S醇，DMS090y L，（NH4)2S04 2皿ol，Tris 25皿ol，MgCl2 3皿ol，dNTPs 2.4皿〇1，熱啟動DNA聚合酶50U);預(yù) 混液Vni(SYT013 12皿ol，CXR 60pmol，KCl 60皿〇1，丙S醇60化，不含DMS0，（NH4)2S04 化 mol，Tris 25皿ol，MgCl2 3皿ol，dNTPs 2.4皿〇1，熱啟動DNA聚合酶50U);預(yù)混液K(SYT013 15皿ol，CXR 90pmol，KCl 50皿〇1，不含丙S醇和DMS0，（NH4)2S04 3皿ol，Tris 25皿〇1， MgCl2 3皿ol，dNTPs 2.4皿〇1，熱啟動DNA聚合酶50U);
[0081] 2)豬背最長肌，購自哈爾濱市香坊區(qū)大潤發(fā)超市；
[0082] 3)實驗試劑：
[0083] 血液、細胞和動物組織的基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京）有限公 司；引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；染料SYT013購自美國Invi化Ogen 公司；染料CXR購自美國Promega公司；熱啟動DNA聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公 司；dNTPs混合液購自美國Promega公司；
[0084] 4)實驗儀器：
[0085] 巧光定量PCR儀AB 口 500，美國ABI公司；紫外分光光度計，日本島津公司；高速冷凍 離屯、機，美國Sigma公司；GI54DWS型高壓滅菌器，美國Zealway公司；QT-I縱滿混合器，上海 琪特分析儀器有限公司。
[00化]2.實驗方法：
[0087] 1)樣品DNA的提取與濃度、純度的計算
[00則分別稱取25mg豬肉組織按照試劑盒說明書操作提取基因組DNA，總DNA溶解于10化 L的TE緩沖液中。于260nm和280nm處的吸光度值，計算DNA濃度和純度。
[0089] 2)引物的選擇及驗證
[0090] 引物序列、擴增產(chǎn)物見表1。委托Invi化Ogen生物技術(shù)(上海)有限公司合成。盛裝 引物的離屯、管于12,000巧m(~13,400Xg)下離屯、30s，WTE緩沖液溶解至濃度為100曲lol的 引物儲備液，-20°C下避光保存直至使用。
[0091] 表1引物序列及擴增產(chǎn)物長度
[0092]
[0093] 3)SYT013巧光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
[0094] 反應(yīng)體系：包括SYT013巧光定量PCR預(yù)混液（2 X ) ^化；上、下游引物各1.化L(化 mol);豬DNA模板化L無菌雙蒸水5.化L。
[0095] 反應(yīng)條件:95°(：預(yù)變性4111111;95°(：變性153,61°(：退火延伸1111111，40循環(huán);溶解曲線 分析。
[0096] 4)商業(yè)試劑盒巧光定量PCR對照反應(yīng)體系及反應(yīng)條件
[0097] 反應(yīng)體系：商業(yè)巧光定量PCR預(yù)混液（2 X ) ^化;上、下游引物各1.2化(5皿〇1);豬 DNA模板化L無菌雙蒸水5.化L。
[009引反應(yīng)條件:95°(：預(yù)變性3111111;95°(：變性153,60°(：退火延伸1111111，40循環(huán);溶解曲線 分析。
[0099] 5)巧光染料5￥1'013、（畑4)25〇4、丙；醇和DMSO添加量對巧光定量PCR Ct值的影響
[0100] 豬DNA模板20ng，分別按所述實施例1~9配制預(yù)混液，編號I~K，通過AB口500巧 光定量PCR儀按照前述反應(yīng)條件進行擴增，選擇Ct值在15~20之間的預(yù)混液進入復(fù)篩步驟， 每種預(yù)混液重復(fù)3次，W商業(yè)巧光定量PC時式劑盒作為對照。
[0101] 按照巧光定量PCR儀器系統(tǒng)內(nèi)設(shè)程序?qū)U增產(chǎn)物進行解鏈曲線分析，W商業(yè)巧光 定量PC時式劑盒作為對照，從65°C到95°C，每一溫度持續(xù)Imin。通過解鏈曲線得出產(chǎn)物Tm值， 并判斷系統(tǒng)內(nèi)是否有二聚體生成。
[0102] 6)靈敏度實驗
[0103]將DNA模板分別稀釋至0. lng/]iL、10pg/iiL、lpg/iiL、0.1 pg/jiL和IOfg/化，進行巧光 定量PCR反應(yīng)，W商業(yè)巧光定量PC時式劑盒作為對照，根據(jù)MI犯指導(dǎo)要求，選擇擴增結(jié)果陽性 率超過95%的最低濃度，視為巧光定量PCR反應(yīng)的檢出限L0D，藉此判斷靈敏度。通過濃度梯 度PCR擴增圖，選擇具有特異性擴增的最后兩個模板濃度，每種預(yù)混液每個濃度做20次平行 實驗，當(dāng)陽性樣本含19個時，該濃度可作為檢出限。
[0104] 7)重復(fù)性實驗
[0105] W檢出限濃度的上一濃度梯度進行10次試驗，判斷初篩預(yù)混液配方的重復(fù)性，W 商業(yè)巧光定量PCR試劑盒作為對照，計算Ct值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，當(dāng)RSD ^ 5 %時，認為重復(fù)性 良好。
[0106] 8)預(yù)混液配方的復(fù)篩一一擴增效率計算
[0107] W商業(yè)巧光定量PCR試劑盒作為對照，對模板濃度分別為lOng/化、IngAiUO. Ing/ 化、lOpg/化、IpgAiUO. lpg/化的DNA樣本進行巧光定量PCR擴增，計算Ct值與Log(模板質(zhì) 量)的關(guān)系，應(yīng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，總結(jié)線性相關(guān)系數(shù)R 2和斜率，按照公式(1)計算擴增效率。
[010引 E = IQ-I/解-1 公式(1)
[0109] 3.實驗結(jié)果
[0110] 1)巧光染料5￥1'013、（畑4)25〇4、丙；醇和DMSO添加量對巧光定量PCR Ct值的影響
[0111] SYT013濃度對Ct值的影響：由表2可知，預(yù)混液I n和虹中SYT013添加量為12皿〇1 時，Ct值最低，可知，每1血預(yù)混液中，SYT013最適添加濃度為12皿〇1，相對應(yīng)CXR添加濃度為 60pM。通過巧光定量PCR儀分析體系組分，當(dāng)CXR添加濃度為60pM時，巧光染料和參比巧光之 間的比例與商業(yè)試劑盒類似。圖1中A、B、C分別是預(yù)混液in和虹中染料巧光強度。
[0112] 關(guān)于PCR效果增強劑DMSO和(NH4)2S化對PCR產(chǎn)物特異性的影響，通過對20ng DNA模 板擴增后產(chǎn)物的溶解曲線判斷。結(jié)果表明，在未添加(nh4)2S化的預(yù)混液I n和m中，（畑4) 2S〇4添加量少（1皿Ol)的IV號預(yù)混液，均存在非特異性擴增，說明（馳)2S0河增強PCR反應(yīng)的 特異性;在有(畑4佔0廟在的情況下，未添加 DMSO的VI和K號PCR產(chǎn)物溶解曲線均可見非特 異性擴增產(chǎn)生，說明（畑4) 2S化和DMSO有增強PCR特異性的協(xié)同作用。
[0113] 關(guān)于丙S醇對PCR反應(yīng)的影響，在其他組分不變的情況下，通過預(yù)混液VK添加丙 S醇）和K(不添加丙S醇）的Ct值可W看出，添加丙S醇的樣本，可W產(chǎn)生相對較低的Ct 值，說明丙S醇的存在有利于PCR反應(yīng)的進行，既往的研究表明，丙S醇具有保護DNA聚合酶 的作用，我們的實驗結(jié)果證實了運一點。
[0114] 由表2中也可W看出，預(yù)混液V和VI擴增產(chǎn)物Tm值高達79.7°C，與商業(yè)試劑盒類 似，在化值相對較高時，體系更適用于擴增產(chǎn)物鑒別和解鏈曲線分析。
[0115] 表2 SYT013巧光定量PCR預(yù)混液與商業(yè)試劑盒擴增效果比較 「01161
[0117] 2.靈敏度驗證
[011引由表3可知，預(yù)混液V和預(yù)混液VI檢出限低至lOfg，與商業(yè)試劑盒的檢出限相同。 同時添加了（NH4)2S04、DMS0和丙S醇的預(yù)混液檢出限比其他預(yù)混液要低，PCR擴增更加靈 敏，如預(yù)混液IV、V和VI。而未添加 DMSO和丙S醇的預(yù)混液K，檢出限高至IOpg，靈敏度太低 不適用于進行巧光定量PCR反應(yīng)。
[0119] 表3各預(yù)混液特異性擴增豬DNA檢出限判定(n = 20)
[0120]
[
[0122] 圖2是W預(yù)混液V梯度擴增豬DNA的曲線，圖中可W清晰看出，當(dāng)豬DNA起始質(zhì)量 20fg時，豬特異性模板還可W穩(wěn)定擴增，并與陰性對照明顯區(qū)分開來，靈敏度高，檢出限低， 適宜進行巧光定量PCR反應(yīng)。
[0123] 3.重復(fù)性驗證
[0124] 重復(fù)性驗證結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，預(yù)混液n、虹、IV、V和VI的6次獨立重復(fù)實驗Ct 值的標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.5,檢測穩(wěn)定性好，各預(yù)混液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于設(shè)定的5%標(biāo)準(zhǔn)，其中 預(yù)混液n、iv、V和VI相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.5%，說明檢測結(jié)果重復(fù)性好，可用于巧光定量 PCR擴增。
[0125] 表4重復(fù)性驗證結(jié)果(n = 6) 「01
L0127J 4.擴增效率必線性相關(guān)性
[0128] 表5總結(jié)了 10種預(yù)混液的擴增效率及線性相關(guān)性。從表5中可W看出，預(yù)混液n、 虹、IV、V和VI的擴增效率均高于95%，其中預(yù)混液IV、V和VI擴增效率接近于100 %，與商 業(yè)預(yù)混液類似，提示該預(yù)混液對PCR反應(yīng)無抑制，且線性相關(guān)系數(shù)R2高于99 %，具有良好的 線性相關(guān)性，可滿足巧光定量PCR要求。
[0129] 表5不同預(yù)混液巧光定量PCR反應(yīng)的R2、斜率和擴增效率 「01301
[0132] 鑒于W上實驗結(jié)果，本發(fā)明適用于巧光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液，能夠產(chǎn)生 更強的巧光信號，較早產(chǎn)生Ct值，使巧光定量PCR擴增模板范圍更寬；產(chǎn)物具有較高解鏈溫 度Tm,有利于基因分型和物種鑒別等工作;經(jīng)添加 PCR增強劑DMSO、（N也)2S化和丙S醇后，體 系內(nèi)無非特異性擴增出現(xiàn);具有與商業(yè)試劑盒相似的高靈敏度，對基因組DNA擴增模板濃度 可低至20fg;其重復(fù)性和擴增效率優(yōu)于商業(yè)試劑盒，并且具有良好的線性相關(guān)性，在 ABI7500實時巧光PCR熱循環(huán)儀上應(yīng)用效果良好，與進口商業(yè)試劑盒具有相似的效果，卻可 W降低實驗成本，具有經(jīng)濟價值和實用價值。
[0133] 雖然本發(fā)明已W較佳的實施例公開如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此 技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可W做各種的改動與修飾，因此，本發(fā)明的保 護范圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種熒光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液，其特征在于，以DNA雙鏈嵌入SYT013為熒光 標(biāo)記物，以染料CXR為參比熒光。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述PCR預(yù)混液，其特征在于，每lmL所述PCR預(yù)混液中含有5μπιο 1~20 μπιο 1 染料 SYTO13和30pmo 1 ~120pmo 1 參比熒光 CXR。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述PCR預(yù)混液，每lmL所述PCR預(yù)混液包含:染料SYT013 5μπιο1~20μ mol，參比熒光CXR 30pmol~120pmol、DNA聚合酶40U~100U、（NH4)2S〇4 0~4ymol、丙三醇0-80yL和DMSO 0-100yL。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述PCR預(yù)混液，其特征在于，每lmL所述PCR預(yù)混液包含：染料 SYT0135ymol~20μπιο1，參比熒光CXR 30pmol~120pmol、熱啟動DNA聚合酶40U~100U、 (NH4)2S〇4 0~4ymol、丙三醇0-80yL、DMS0 0-100yL、KCl 40ymol~80ymol、Tris ΙΟμ mol~ 30ymol、MgCl2 2ymol~4ymol、dNTPs 1·8μηιο1 ~3ymol。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述Ρ C R預(yù)混液，其特征在于，每1 m L所述Ρ C R預(yù)混液包含：染料 SYT01310ymol~15ymol，參比熒光CXR 45pmol~90pmol、熱啟動DNA聚合酶45U~65U、（NH4) 2SO4IW110I~3ymol、丙三醇55yL_75yL、DMS0 60yL_90yL、KCl 50ymol~70ymol、Tris 20ymol ~30ymol、MgCl2 2·5μηιο1 ~3.5ymol、dNTPs 2·1μηιο1 ~2·7μηιο1。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述Ρ C R預(yù)混液，其特征在于，每1 m L所述Ρ C R預(yù)混液包含：染料 SYTO 1312μπιο 1，參比熒光CXR 60pmo 1、熱啟動DNA聚合酶50U、（順4) 2S〇4 2μπιο 1、丙三醇60yL、 DMSO 70yL、KCl 60ymol、Tris 25ymol、MgCl2 3ymol、dNTPs 2·4μπιο1，其余組成為雙蒸水。7. -種如權(quán)利要求1-6所述任一 PCR預(yù)混液的制備方法，其特征在于，步驟如下： 1) 分別制備KC1溶液、Tris溶液、(順)2S〇4溶液、MgCl2溶解，震蕩混勻，4°C貯存?zhèn)溆茫? 2) 然后分別將無菌雙蒸水，與步驟1)制備的KC1溶液，Tris溶液，（NH4)2S〇4溶液，和MgCl2 溶液預(yù)混于滅菌貯存管中，調(diào)節(jié)溶液pH至8.5，混勻后滅菌，獲得預(yù)處理混合液;所述KC1含 量為40μπιο1~80μπιο1;所述(NH4) 2S〇4含量為0-4μπιο1;所述Tris溶液含量為ΙΟμ mol~30μ mol;所述MgCl2含量為2μηιο1 ~4μηιο1; 3) 向步驟2)所得預(yù)處理混合液中依次加入1.8ymol~3μπιο1 dNTPs、40U~100U DNA聚 合酶、5ymol~20ymol染料SYT013、30pmol~120pmol參比熒光CXR、0-100yL DMS0和0-80yL 丙三醇，混勻后離心，最后加入無菌雙蒸水至lmL，混勻后離心，上清液即為PCR預(yù)混液； 4) 將步驟3)獲得的PCR預(yù)混液包裝后獲得成品，于-20 °C避光保存。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)所述預(yù)混，是在環(huán)境溫度4°C下完 成； 步驟2)所述滅菌，條件為126°C，15min。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述混勻，為2500r/min下漩渦震蕩30s;所 述離心，條件為4000 X g，30s。10. 權(quán)利要求7-9所述任一方法在配備適用于熒光定量PCR熱循環(huán)儀的PCR預(yù)混液及熒 光定量PCR檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861715SQ201610347461
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】劉寧, 楊艷, 王桂姬
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)