循環(huán)miRNA作為年齡相關(guān)黃斑變性診斷標志物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及循環(huán)miRNA作為年齡相關(guān)黃斑變性診斷標志物中的應(yīng)用。通過miRNA表達芯片檢測新生血管性AMD患者、白內(nèi)障患者之間miRNA的表達差異，從所有差異表達的miRNA中選取10個進行驗證，然后擴大樣本，通過熒光定量PCR的方法進行特異miRNA的表達，比較差異miRNA在AMD患者及對照組中的含量，驗證其作為診斷標志物的可行性。ROC曲線分析顯示：miR?27a?3p，miR?29b?3p和miR?195?5p的AUC分別為79.1％、72.7％和70.7％。這說明miR?27a?3p，miR?29b?3p及miR?195?5p可以作為年齡相關(guān)黃斑變性診斷標志物。
【專利說明】
循環(huán)mi RNA作為年齡相關(guān)黃斑變性診斷標志物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)的臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是循環(huán)miRNA作為 年齡相關(guān)黃斑變性診斷標志物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD)是導(dǎo)致50歲W 上老年人不可逆失明的最重要原因之一。美國調(diào)查顯示，超過40歲人群中AMD患病率為9%。 而在中國耶鄰及北京進行的流行病學(xué)調(diào)查顯示，老年人中AMD患病率分別為3.1%及5.5%。 年齡的增長、種族差異、遺傳及吸煙史是AMD發(fā)生相關(guān)的危險因素，其他因素如肥胖、屯、臟疾 病與AMD發(fā)病關(guān)系報道不一致。盡管有飲食及生活方式干預(yù)，W及應(yīng)用抗氧化藥物、玻璃體 內(nèi)藥物注射、激光光凝及光動力治療等手段，目前對AMD的治療尚無有效的治愈手段。
[0003] AMD最早的病理變化是出現(xiàn)玻璃體痛，運是AMD的標志性改變，即多形態(tài)的無細胞 碎片在視網(wǎng)膜色素上層細胞(retinal pigment巧itheli皿，RPE)及化Uch ' S膜之間的病灶 沉積。玻璃體痛根據(jù)大小分為小(<63wii)、中（63-124WI1)、大(〉124曲1)=種;根據(jù)玻璃體痛邊 緣形態(tài)還分為硬性及軟性玻璃體痛。RPE細胞的損傷及慢性炎癥反應(yīng)異?？蓪?dǎo)致大片區(qū)域 的視網(wǎng)膜萎縮或新生血管因子如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)的異常，且二者可同時出現(xiàn)。在部分患者中，在化uch's膜、外層視網(wǎng)膜及脈絡(luò) 膜中膠原蛋白或彈性蛋白的異常也是AMD的病理改變。脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)展與血管滲透 率及脆性增加相關(guān)，而CNV與視網(wǎng)膜下出血、液體滲出、脂質(zhì)沉積、WE及脈絡(luò)膜脫離密切相 關(guān)。AMD分為干性AMD及濕性AMD，脈絡(luò)膜新生血管是濕性AMD的重要標志。目前認為，AMD是基 因遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的，炎癥反應(yīng)、細胞調(diào)亡、膽固醇代謝改變、血管新生及氧 化應(yīng)激反應(yīng)相互影響的復(fù)雜過程。
[0004] 目前，AMD的分型及分期仍通過眼底檢查結(jié)果:根據(jù)有無滲出分為干性、濕性AMD; 根據(jù)玻璃體痛情況分為早期及晚期AMD。然而，一旦發(fā)現(xiàn)，即使為早期AMD,目前仍無確切的 干預(yù)手段來阻止疾病的進展。因此，臨床上迫切需要尋找有效敏感且特異的生物標志物，即 一種客觀的、早于臨床表現(xiàn)的指標，將高危人群分離出來，及早給予干預(yù)。然而，疾病分子標 志物的驗證研究是一個復(fù)雜過程，一般通常包括五個階段:首先是臨床前期的發(fā)現(xiàn)和驗證； 其次是臨床實驗驗證;第=是在一個完整的臨床實驗中評價其敏感性和特異性;第四是前 瞻性評估典型疾病的大小樣本分析，判定其假陽性率;最后是在疾病控制方面，發(fā)現(xiàn)分子標 志物對疾病發(fā)生或減輕所做的貢獻。疾病的生物標志物的獲得通常經(jīng)過漫長的過程。
[0005] 微小核巧核酸(micro r;Lbonucleic acids,miRNA)是長度為21-25個核巧酸的非 編碼核巧酸（ribonucleic acid, RNA )，它通過結(jié)合在祀信使核巧核酸（message r;LbonucleiC acid,mRNA)3'非翻譯區(qū)（3'untranslated region,3'UTR)誘導(dǎo)mRNA降解或阻 止其翻譯進行，從而對基因表達進行調(diào)控。研究表明，miRNAs在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、血 管發(fā)生、腫瘤生長等過程中起著重要作用，部分miRNAs是重要的癌基因或抑癌基因。血清中 miRNA-21及miRNA-221、miRNA-376c和miRNA-744可分別作為肝癌及胃癌的生物標志物，而 在腫瘤及屯、血管疾病中，miRNAs作為新的治療祀點而受到關(guān)注。miR-27a，是一個位于 19pl3.13的miRNA，它在腫瘤形成，細胞增殖，細胞調(diào)亡及分化中起著重要的作用。有報道稱 miR-27a可W通過抑制調(diào)亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activatin奸actor-l， APAF-I)，調(diào)控腦部細胞對調(diào)亡的敏感性，從而影響腦部的發(fā)育。miR-29b-3p及miR-195-5p 分別位于18及17號染色體，二者在細胞分化，腫瘤形成中起著重要作用，二者還是多種疾病 的診斷及預(yù)后的重要因素。
[0006] 中國專利2010101627286提供了檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，包括任選的用 于檢測CFH基因 9號外顯子的rsl061170變異、15號內(nèi)含子的rsl329428變異、2號外顯子的 rs800292變異和/或5'非編碼區(qū)的rs3753394變異用于AMD篩選診斷的相關(guān)試劑。通過檢測 W上位點是否存在變異，檢測老年黃斑變性疾病的患病風險，與AMD的關(guān)聯(lián)度高?？捎糜谠?期監(jiān)控和檢巧UAMD高危人群，實施早期預(yù)防和治療，減少其視力損害。中國專利 2007101628662提供了檢測老年黃斑變性疾病的試劑盒，可用于早期監(jiān)控和檢測AMD高危人 群，實施早期預(yù)防和治療，減少其視力損害。WHTRAl基因 512G^A突變及其相關(guān)位點/基因 為目標，與AMD的關(guān)聯(lián)度高，協(xié)同CHF基因突變的分析，更可提高檢測的準確性。然而關(guān)于本 發(fā)明的循環(huán)miRNA作為新生血管性年齡相關(guān)黃斑變性診斷標志物中的應(yīng)用，目前還未見報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷的 標志物。
[000引本發(fā)明的再一的目的是，提供如上所述miRNA標志物的用途。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0010] -種年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷的標志物，所述標志物為循環(huán)miRNA標志物，選自 W 下miRNA 中的任意一種或多種：hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p 或]ias-miR-29b-3p。
[0011 ]所述 hsa-miR-195-5p 的序列為 uagcagcacagaaauauuggc，所述 hsa-miR-27a-3p 的 序列為uucacaguggcuaaguuccgc，戶Zf 述 has-miR-29b-3p 的序列為 uagcaccauuugaaaucaguguu。所述hsa-miR-195-5p的核巧酸序列如沈Q ID NO. 1 所示；所述 hsa-miR-27a-3p的核巧酸序列如沈Q ID NO.2所示；所述has-miR-29b-3p的核巧酸序列如 沈Q ID NO.3。
[0012] 所述年齡相關(guān)黃斑變性為干性老年黃斑變性或濕性老年黃斑變性。
[0013] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0014] 如上所述的miRNA標志物的用途，用于制備檢測年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷試劑 或試劑盒。
[0015] 所述miRNA標志物選自W下miRNA中的一種或多種：hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-化或 has-miR-29b-3p 。
[0016] 所述檢測為血漿檢測。
[0017] 所述 hsa-miR-195-5p 的序列為uagcagcacagaaauauuggc，所述 hsa-miR-27a-3p 的 序列為uucacaguggcuaaguuccgc，戶Zf 述 has-miR-29b-3p 的序列為 uagcaccauuugaaaucaguguu。所述hsa-miR-195-5p的核巧酸序列如沈Q ID NO. 1 所示；所述 hsa-miR-27a-3p的核巧酸序列如沈Q ID NO.2所示；所述has-miR-29b-3p的核巧酸序列如 沈Q ID NO.3。
[0018] 所述診斷試劑或試劑盒包括:對 hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p、has-miR-29b-化中的一種或兩種W上具有檢測特異性的探針、基因忍片，或PCR引物。所述hsa-miR-195-5p定量PCR引物序列如SEQ ID ^).4-5所示；所述113曰-11111?-27曰-3口定量口〇?引物序列如560 ID NO.6-7所示;所述has-miR-29b-化定量PCR引物序列如沈Q ID NO.8-9所示。
[0019] 所述年齡相關(guān)黃斑變性為干性老年黃斑變性或濕性老年黃斑變性。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0021] 本發(fā)明通過miRNA表達忍片檢測新生血管性AMD患者、白內(nèi)障患者之間miRNA的表 達差異，從所有差異表達的miRNA中選取10個進行驗證，然后擴大樣本，通過巧光定量PCR的 方法進行特異miRNA的表達，比較差異miRNA在AMD患者及對照組中的含量，驗證其作為診斷 標志物的可行性。ROC曲線分析顯示:miR-27a-3p，miR-29b-化和miR-195-5p的AUC分別為 79.1 %、72.7%和70.7%。運說明miR-27a-：3p，miR-29b-3p及miR-195-5p可 W作為年齡相關(guān) 黃斑變性診斷標志物。
【附圖說明】
[0022] 附圖1為CNV性AMD的眼底照，OCT及FFA結(jié)果。
[0023] 附圖2為凝膠電泳檢測樣本RNA提取質(zhì)量。
[0024] 附圖3為相關(guān)miRNA表達聚類分析。
[0025] 附圖4為忍片結(jié)果GO分析結(jié)果。
[0026] 附圖5為AMD發(fā)病相關(guān)主要信號通路。
[0027] 附圖6為miRNA祀基因關(guān)系圖。
[002引附圖7為miR-27a-化的祀基因。miR-27a-化主要與細胞分化，調(diào)亡，增殖，遷移及侵 襲相關(guān)。miR-27a-3p重要的祀基因包括Apaf-l，Hspll0，Hsp90，sFRP等基因，在諸多疾病的 發(fā)展中產(chǎn)生作用。
[00巧]附圖8為miR-29a-3p的祀基因。miR-29b-3p主要與細胞調(diào)亡，增殖，血管形成及纖 維化相關(guān)。miR29b-化重要的祀基因包括 Smad3，MCkl，VEGFA，ELN，F(xiàn)BNl，C0LlAl，C0LlA2， C0L3A1等基因，在諸多疾病的發(fā)展中產(chǎn)生作用。VEGFA與血管形成顯著相關(guān)，而COLlAl， C0L1A2則與纖維化及細胞外基質(zhì)形成密切聯(lián)系。
[0030] 附圖9為miR-195-化的祀基因。miR-195-化主要與細胞周期，腫瘤的生長及侵襲密 切相關(guān)。miR-195-化重要的祀基因包括Bcl-W,P肺636,抓NF等基因，在諸多疾病的發(fā)展中產(chǎn) 生作用。
[0031] 附圖10為干性AMD的眼底照，OCT及FFA結(jié)果。
[0032] 附圖11為AMD組與對照組各miRNA差異。
[0033] 附圖12為不同類型AMD差異表達的miRNA差異。
[0034] 附圖 13 為 miR-27a-：3p、miR-29b-3p 和 miR-195-5p的 ROC曲線，ROC曲線下面積 AUC 分 別為79.1%(95%(：1 = 71.4%-86.8%)，72.7%(95%(：1 = 64.1%-80.0%)和70.7%(95% CI = 61.7%-79.7%)。
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合【具體實施方式】，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可W對本發(fā)明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0036] 實施例1 CNV性AMD患者循環(huán)miRNA表達譜忍片分析
[0037] -、材料與方法
[0038] 1.研究對象
[0039] 所有的研究對象均來自2012年6月-2012年7月于同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科 就診的患者，所有入選患者簽署知情同意書。
[0040] 1.1實驗組(CNV性AMD患者）
[0041 ] 1.1.1入選標準
[0042] 通過眼底照相（funds曲Otogra地y,FP)，光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomogra地y,OCT)，巧光血管造影（（fluorescein fundus angiogra地y,FFA)檢查，結(jié)合視 力改變，診斷為CNV性年齡相關(guān)黃斑變性的患者。
[0043] CNV性AMD診斷標準：
[0044] (1)矯正視力<0.5，可有視物變形，眼前有注視性暗影。
[0045] (2)眼底照相:有融合的邊界不清的玻璃痛，黃斑區(qū)視網(wǎng)膜下出血。
[0046] (3)0CT:表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮/脈絡(luò)膜毛細血管層的紅色反射光帶，局限性增 厚。CNV是較大范圍的不規(guī)則增厚，同時伴有視網(wǎng)膜色素上皮/脈絡(luò)膜毛細血管層的變形，境 界清楚。
[0047] (4)眼底巧光血管造影(FFA):呈現(xiàn)透見巧光時，表現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮萎縮，色素沉 著處可有遮蔽巧光，后期有巧光素滲漏。
[004引圖1為CNV性AMD的眼底照(A) ,OCT(B)及FFA(C)結(jié)果。
[0049] 1.1.2排除標準
[0050] (1)眼前節(jié)的炎癥，如活動性結(jié)膜炎、角膜炎、葡萄膜炎等；
[0051] (2)患有AMDW外的眼底病變，如黃斑裂孔、黃斑水腫、高度近視、視網(wǎng)膜血管阻塞、 中屯、性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等眼底疾??；
[0052] (3)全身疾病糖尿病、惡性腫瘤、阿茲海默病、腦卒中W及自身免疫系統(tǒng)疾病等器 質(zhì)性疾?。?br>[0053] (4)其他原因的無法完成相關(guān)檢查和研究的。
[0化4] 1.2對照組
[0055] 1.2.1納入標準
[0056] (1)來醫(yī)就診的白內(nèi)障摘除術(shù)后患者。
[0057] (2)年齡、性別與實驗組患者匹配。
[0化引 1.2.2排除標準
[0059] (1)眼前節(jié)的炎癥，如活動性結(jié)膜炎、角膜炎、葡萄膜炎等；
[0060] (2)患有AMDW外的眼底病變，如黃斑裂孔、黃斑水腫、高度近視、視網(wǎng)膜血管阻塞、 中屯、性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等眼底疾??；
[0061] (3)全身疾病糖尿病、惡性腫瘤、阿茲海默病、腦卒中W及自身免疫系統(tǒng)疾病等器 質(zhì)性疾??；
[0062] (4)其他原因的無法完成相關(guān)檢查和研究的。
[0063] 1.3納入對象一般情況
[0064] 實驗組及對照組各有6位患者，在年齡及性別上午統(tǒng)計學(xué)差異(P〉0.05)。具體情況 見下表。 「OOASl
[0069] 3.研究方法
[0070] 3.1標本采集，存儲及運輸
[0071] 研究對象抽取全血2ml，置于5ml邸TA抗凝真空管內(nèi)保存。樣本分裝，400~500ul/ 管。短期保存，放入-80°C冰箱。運輸過程使用足量干冰保證始終低溫。
[0072] 3.2RNA分離和鑒定
[0073] 采用TRIZ化從全血中抽提RNA，具體步驟如下：
[0074] 1、加入0.2ml全血到0.75ml TRI Reagent BD，每0.2ml全血或血漿添加20ul 5N醋 酸，充分混勻。
[0075] 2、將裂解液室溫放置5min，使得核蛋白復(fù)合物充分解離。接下來，每0.75ml裂解液 中添加 O. Iml漠氯丙烷或者0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，劇烈晃動15s?；旌弦菏覝胤胖?~5min， 12,000邑，4°(：離屯、15111111。離屯、后，混合物分為下部褐色的酪-氯仿相、中間相和上部無色的 水相。RNA保留在水相中，DNA和蛋白分別在中間相和有機相中。
[0076] 3、RNA沉淀：將水相層轉(zhuǎn)移到新的離屯、管中，中間相和有機相儲存在4°C W備后續(xù) 實驗用。向水相中加入異丙醇混勻，沉淀RNA。每0.75ml TRI Reagent抓分離得到的水相中 加入0.5ml異丙醇。室溫放置5-lOmin，12，OOOg，4~25 °C離屯、Smin eRNA沉淀在管底呈現(xiàn)為膠 狀或白色沉淀塊。
[0077] 4、清洗RNA :吸掉上清，加入7 5 %乙醇，滿旋振蕩重懸RNA沉淀。每 0.75mlTRIreagent抓試劑抽提得到的RNA用lml75%乙醇清洗。若前面的分離步驟在大離 屯、管(〉2ml)中進行的話，則將RNA-乙醇懸液轉(zhuǎn)移到小離屯、管中。轉(zhuǎn)移時使用口徑處減掉2~ 3mm的Iml槍頭7,500g，4~25°C離屯、5min。如果RNA沉淀在管壁上或者不能貼壁，那么使用 12 ,OOOg 離屯、。
[007引 5、溶解RNA:吸掉乙醇，將RNA沉淀自然風干5min。注意避免RNA徹底干燥，否則會降 低RNA的可溶性。同時避免采用真空裝置離屯、干燥RNA。用FORMAzo 1 (cat. no. FOl 21 )、水或者 用槍頭吹打混勻配制而成的0.5%SDS溶液溶解RNA，55~60°C溫育10~15min。用于溶解RNA 的水或者SDS溶液必須先用DEPC處理。
[0079] 6、RNA質(zhì)控：用邸染瓊脂糖凝膠電泳分離的RNA，或者用亞甲基蘭染轉(zhuǎn)移到雜交膜 上的RNA，可W看到兩條主帶，分別為化b和化b的rRNA，另外還有一條0.1~0.3kb的小分子 量的RNA。提取總RNA之后質(zhì)量檢測標準:A260/A230值為大于2.0，A260/A280值為介于1.8-2.0之間提示RNA質(zhì)量好。
[0080] 3.3miRNA表達譜研究
[0081 ] 3.3.1表達譜操作及數(shù)據(jù)分析
[00劇通過miRCURY?Hy3?/Hy5?標記試劑盒將經(jīng)過質(zhì)量檢測的12例樣本全血總RNA進行 祀標制備，與miRCURY?鎖核巧酸忍片（V. 18.0)進行忍片雜交，忍片清洗染色后通過Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀掃描后，應(yīng)用miRNA忍片分析系統(tǒng)(GenePix Pro 6.0軟件， Axon)篩選出在兩組循環(huán)中表達有差異的miRNA。我們選取一批次實驗中在每張忍片上修正 值都含30的非control探針做標準化，W運部分探針中值(median)作為標準化因子對整張 忍片的點做標準化處理，即各個miRNA修正值/Inedian = Normalized Data(標準值）。
[0083] 我們采用Differentially Expressed miRNAs(F*ass Volcano Plot)的miRNA的標 準值進行聚類分析化ierarchical clustering)，關(guān)系近的樣本或miRNA會聚到一起。相關(guān) 系數(shù)R(Correlation coefficient R-value)表明重復(fù)樣本之間相關(guān)性的高低或者是不同 組的樣本間的差別大小，重復(fù)性越好R值越大，差異越大R值越小。Scatter PlotW圖形方 式，表明了兩樣本之間miRNA表達差別。兩樣本差異越大，其散點圖距離X = Y運條直線越遠， 分散程度越大。
[0084] 3.3.2生物信息學(xué)分析
[0085] (1)預(yù)測數(shù)據(jù)來源和策略
[00化]采用mirbase ,miranda和targetscanS個數(shù)據(jù)庫的預(yù)測信息。預(yù)測最終結(jié)果取其 中的重疊部分，通常情況下取3個數(shù)據(jù)預(yù)測結(jié)果的重疊部分。
[0087] (2)數(shù)據(jù)庫信息
[0088] Microcosm:http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/ v5/
[0089] Miranda: http://www.microrna.org/microrna/home. do
[0090] Targetscan: the taregetscan version 6.2(http://www.targetscan.org/ ve;rt_60/)
[0091] hg 19，mm9，RN34的祀基因信息來自運S個
[0092] 4.統(tǒng)計學(xué)處理
[0093] 根據(jù)實驗設(shè)計分別采取兩獨立樣本t檢驗（Independent sample t test)、單因素 方差分析(one-way ANOVA)，卡方分析（chi-square analysis)進行統(tǒng)計學(xué)分析，LSD、SNK法 進行組間差異比較，利用SPSS19.0軟件進行上述統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意 義。每組實驗重復(fù)=次，取平均值進行計算處理。
[0094] 5.結(jié)果
[0095] 5. IRNA提取質(zhì)量檢測及鑒定
[0096] 共計12個樣本用于循環(huán)miRNA表達譜分析，所有的樣本均通過Trizol提取，并通過 檢測RNA溶液的吸光度及RNA的凝膠電泳來檢測RNA的完整性及質(zhì)量。從表1的結(jié)果可W發(fā) 現(xiàn)，所W樣本0D260/A280均在1.82至1.91之間，而0D260/230都超過1.8,提示RNA提取質(zhì)量 好，可W用于進一步的實驗。各種RNA提取濃度在200ngAU，也適合進一步實驗。凝膠電泳 (圖2)顯示8S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利，條帶的邊緣清晰，可W認為RNA的質(zhì)量較好。
[0097] 表1吸光度檢測樣本RNA提取質(zhì)量 [009引 Luuyyj b. Z定井巧店miKlNA分機
[0100]圖3顯示了忍片結(jié)果提供的聚類分析結(jié)果。經(jīng)過處理背景信號、平衡忍片之間差異 后，檢測結(jié)果顯示，從循環(huán)miRNA中共檢測到216種差異表達的miRNAs(其中，表達增高有111 種，表達降低有105種）。
[0101] 因為差異表達miRNAs數(shù)量較大，我們對候選miRNAs組間差異P值<0.05,標準化信 號強度差異變化幅度^ 2倍W上者作為進一步研究的候選miRNAs。共檢測到35種miRNAs，其 中表達上調(diào)(倍數(shù)>2.0)有15種，表達下調(diào)(倍數(shù)<0.5)有20種，見表2。
[0102] 表2忍片分析顯示上調(diào)及下調(diào)的各miRNAs
[0104] 5.3.生物信息學(xué)分析
[0105] 5.3.1 GO 分類
[0106] GO分析結(jié)果顯示，AMD患者的miRNAs的GO分類中，前立位分別是細胞進程 (cellular process ,656)、生物調(diào)節(jié)（biological regulation ,498)，代謝進程(metabotiC process, 490)的相關(guān)基因改變較顯著（圖4)。
[0107] 5.3.2與miRNAs相關(guān)祀基因基因在信號通路分布
[010引為了解與miRNAs相關(guān)祀基因基因在信號通路分布情況，我們對信號通路進行信息 學(xué)分析，結(jié)果顯示，設(shè)及到AMD進展的前3位的信號通路為細胞周期(Cell cycle)相關(guān)通路， 其次為細胞外基質(zhì)受體相互關(guān)系化CM-receptor interaction)及腫瘤信號通路(Pathways in cancer)改變（圖5)。由此可見，細胞周期改變在AMD發(fā)生及進展機制中起重要作用，具體 內(nèi)容需本研究進一步進行。
[0109] 5.3.3祀基因預(yù)測
[0110] 考慮到候選miRNAs可能的祀基因較多，我們將miRNAs預(yù)測出的祀基因及其相互關(guān) 系作圖，得出了 10個最重要節(jié)點，其相應(yīng)miRNAs分別為:miR-152，miR-27a-3p，miR-28-5p， miR-195-5p，miR-559，miR-328，miR-25-3p，miR-29b-：3p，has-let-7c，miR-584-5p。圖 6顯示 了miRNA祀基因的關(guān)系圖，各miRNA均在圖中標示。圖7-9顯示了miR-27a-：3p，miR-29b-3p及 miR-195-5p的祀基因。
[0111] 實施例2差異循環(huán)miRNA的驗證研究
[0112] -、材料與方法 [011引 1.研究方法
[0114]所有的研究對象均來自2012年6月-2012年9月于同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科 就診的患者，均簽署知情同意書。
[011引1.1臨床樣本選擇 [0116] 1.1.1 實驗組
[0117] 納入標準：通過眼底照相（funds地OtOgraphy ,FP)，光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomo邑raphy,OCT)，巧光血管造景多（（fluorescein fundus an邑io邑raphy,FFA)檢 查，結(jié)合視力改變，診斷為CNV性年齡相關(guān)黃斑變性的患者。新生血管性AMD納入標準同實施 例1，干性AMD入選標準如下：
[011引（1)視力無顯著影響，所有患者中屯、視力均>0.4。
[0119] (2)眼底表現(xiàn):可見黃斑區(qū)色素素亂，中屯、凹反光不清，有散在的玻璃痛。
[0120] (3)0CT:可見小丘狀中強反射隆起的病灶，伴有或不伴有RPE反射帶和視網(wǎng)膜內(nèi)外 節(jié)發(fā)射帶異常。
[0121 ] (4)眼底巧光血管造影:呈現(xiàn)透見巧光時，表現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮萎縮，色素沉著處 可有遮蔽巧光，有花邊狀或網(wǎng)狀新生血管。
[01剖圖10為干性AMD的眼底照(A) ,OCT(B)及FFA(C)結(jié)果。
[0123] 排除標準同實施例1。
[0124] 1.1.2對照組納入標準及排除標準同實施例1。
[0125] 1.2納入對象一般情況
[01%] 在擴大樣本的對照研究中，共125位參與者(65例實驗組及60例對照組樣本，包括 忍片表達譜樣本)納入了研究。二組之間年齡及性別無統(tǒng)計學(xué)差異(P〉〇.05)。實驗組中，干 性AMD42人，濕性AMD23人。對照組W老年性白內(nèi)障病人為主。 rni97i
[012引2.主要實驗設(shè)備與試劑 [0129]
[i
[0131] 3.研究方法
[0132] 3.1標本采集，存儲及運輸
[0133] 研究對象抽取全血2ml，置于5ml抓TA抗凝真空管內(nèi)保存，混勻，防止凝血。將樣本 分裝，400~500ul/管，放入-80 °C冰箱。
[0134] 3.2RNA分離和鑒定
[0135] 采用miRcute miRNA提取分離試劑盒(天根有限公司）進行RNA提取，用于擴大樣本 驗證忍片結(jié)果，操作如下：
[0136] (1)樣品處理:每200ul全血中加入等體積裂解液MZ，振蕩器振蕩混勻30s。
[0137] (2)室溫放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
[0138] (3)室溫12,OOOrpm(~13,400 Xg)離屯、IOmin，取上清，轉(zhuǎn)入一個新的無 RNase的離 屯、管中。
[0139] (4)加入20化I氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置5min。
[0140] (5)室溫12,000rpm(~13,400Xg)離屯、15min，樣品會分成S層:黃色的有機相，中 間層和無色的水相，RNA主要在水相中，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進行下一步操作。
[0141] (6)量取轉(zhuǎn)移液的體積，緩慢加入轉(zhuǎn)移液體積1/3體積的無水乙醇，混勻。將得到的 溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱miRspin，室溫放置2min，室溫12，000巧m(~13，400 X g)離屯、 30s，離屯、后棄掉吸附柱miRspin，保留流出液。
[0142] (7)量取流出液的體積，緩慢加入流出液體積2/3體積的無水乙醇，混勻(此時可能 會出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱miRelute，室溫放置2min，室溫12， 000巧m(~13,400 Xg)離屯、30s，離屯、后棄掉流出液，保留吸附柱miRelute。
[0143] (8)向吸附柱11111?611116中加入50化1去蛋白液1畑，室溫靜置2111111，室溫12,000巧111 (~13,400 Xg)離屯、30s，棄廢液。
[0144] (9)向吸附柱miRelute中加入60化1漂洗液RW，室溫靜置2min，室溫12,000^m(~ 13，400 X g)離屯、30s，棄廢液。重復(fù)一次。
[0145] (10)將吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室溫12,000巧m(~13,400Xg)離屯、 Imin,去除殘余液體。此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離屯、后將吸附柱 miRelute在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺上通風片刻，W充分驚干。如果有漂洗液殘 留，可能會影響后續(xù)的RT等實驗操作。
[0146] (11)將吸附柱11111?611116轉(zhuǎn)入一個新的1.51111離屯、管中，加15-3〇41腳日36-杜66 d地2〇，室溫放置2min，室溫12，000巧m(~13，400 X g)離屯、2min。
[0147] 3.3質(zhì)量檢測
[0148] 提取總RNA之后質(zhì)量檢測標準:A260/A230值為大于2.0，A260/A280值為介于1.8-2.0之間提示RNA質(zhì)量好。
[0149] 4.統(tǒng)計學(xué)處理
[0150] 根據(jù)實驗設(shè)計分別采取兩獨立樣本t檢驗（Independent sample t test)、單因素 方差分析(one-way ANOVA)，卡方分析（chi-square analysis)進行統(tǒng)計學(xué)分析，LSD、SNK法 進行組間差異比較，利用SPSS19.0軟件進行上述統(tǒng)計學(xué)分析，圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差 (mean±SD)，R0C(Receive;r Operating 化aracteristic)用于特異度及敏感度的分析。P< 0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。每組實驗重復(fù)=次，取平均值進行計算處理。
[0151] 5.結(jié)果
[0152] 5.1差異循環(huán)miRNA在AMD患者及對照組的表達
[0153] 選取65例AMD患者（其中42例干性AMD及23例濕性AMD患者）及60例對照組。在所有 的miRNA表達忍片篩選出的差異表達miRNA中，我們檢測了共計10個篩選出的miRNA(其中上 調(diào)的有 8個：miR-152，miR-27a-3p，miR-28-5p，miR-195-5p，miR-559 ,miR-25-化，miR-29b-3p，has-let-7c;下調(diào)的有2個：miR-328，miR-584-5p)。通過實時巧光定量PCR反應(yīng)化3日-miR-195-5p:F cgcagtagcagcacaga,R tccagtttttttttttttttgcca、hsa-miR-27a-3p:F cagttcacagtggctaagttc，R cagtttttttttttttttgcggaa、has-miR-29b-3p:F cagtagcaccatttgaaatcagt，R ggtccagtttttttttttttttaacact)，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相tk， miR-27a-3p，miR-29b-3p及miR-195-5p的表達顯著增加，其增加倍數(shù)分別為2.76 ± 1.78， 3.04 ± 1.97及4.13 ± 4.00倍。而其他各miRNA的變化無顯著差異（圖11)。
[0154] 5.2S種特異miRNA在不同類型AMD中的差異表達
[0巧日]通過分析驗證得到的3個差異表達miRNA(miR-27a-：3p，miR-29b-3p及miR-195-5p) 在不同類型AMD患者全血中的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)巧中miRNA在干性AMD及濕性AMD中的表達 均顯著高于對照組含量，與之前結(jié)果一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)對于miR-27a，與干性AMD患者相 tt，濕性AMD患者的含量更低（21.2 ± 7.9vs 32.0 ± 8.8，P = 0.009)，而miR-29b-3p及miR-195-5P在不同類型的AMD中則無顯著的差異(P〉0.05)(圖12)。
[0156] 5.3S種特異miRNA作為AMD分子標志物的檢驗效能分析
[0157] 我們進一步通過ROC分析了S種差異表達的miRNA作為miRNA診斷標志物的可能 性。經(jīng)過ROC曲線分析，我們發(fā)現(xiàn)，3種miRNA均可W作為AMD的診斷標志物。結(jié)果顯示miR-27a-3p (圖 13.A)，miR-29b-3p(圖 13.B)和 miR-195-5p(圖 13.C)R0C曲線下面積（areas under curve，AUC)分別為79.1 % (95%CI = 71.4%-86.8% ),72.7% (95%CI = 64.1%-80.0%)和70.7%(95%(：1 = 61.7%-79.7%)。當1111尺-27曰-化>11.2，敏感度為83.7%，特異 度為67.3%。當miR-29b-3p > 9.18，敏感度為62.1 %，特異度為75.3% ;當miR-195-5p > 8.32，敏感度為75.0 %，特異度為53.9 %。
[015引 6.討論
[0159] miRNA表達譜忍片研究中，對循環(huán)miRNA患者及對照組直接循環(huán)miRNAs差異研究發(fā) 現(xiàn)，W差異變化幅度^ 2倍W上者作為標準發(fā)現(xiàn)，共檢測到35種miRNAs(15種表達上調(diào)，20種 表達下調(diào)）。運提示AMD患者中循環(huán)的miRNA含量的發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生了一定的變化。選取 miRNA 忍片確認的 10 個差異表達的 miRNA(miR-152，miR-27a-3p，miR-28-5p，miR-195-5p， miR-559，miR-25-3p，miR-29b-：3p，has-let-7c，miR-328 及 miR-584-5p)來進行進一步驗證， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與忍片結(jié)果一致，其中8個miRNA是上調(diào)的，而2個miRNA是下調(diào)的，也證明了忍片檢 測結(jié)果的可信性。在10個miRNA中，只有3個miRNA的變化有差異，miR-27a-3p，miR-29b-化及 miR-195-5p的分別增加了2.76，3.04及4.13倍。而在干性AMD與濕性AMD組之間，僅miR-27a-化的含量有顯著差異，濕性AMD患者的循環(huán)miR-27a-化含量較干性AMD患者更高，提示了進 一步研究miR-27a-3p作為AMD進展標志物的潛力。對3個miRNA的ROC曲線下面積均大于 50%，說明運巧巾miRNA可作為AMD的診斷標志物。
[0160] 本發(fā)明中，敏感度最好的為miR-27a-化，為83.7 %，而特異度最好的為miR-29b-3p，特異度為75.3%，特異性及敏感性之和最高的為11111?-273-39，提示著將不同的11111?^八聯(lián) 合使用，用于AMD的診斷，可W提高診斷的敏感度及特異度。
[0161] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可W做出若干改進和補充，運些改進和補充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷的標志物，其特征在于，所述標志物為循環(huán)miRNA標 志物，選自如下miRNA中的任意一種或多種:hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a_3p或has-miR-29b _3p 〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷的標志物，其特征在于，所述hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示;所述hsa-miR-27a-3p的核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示;所述has-miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQIDN0.3。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷的標志物，其特征在于，所述年齡 相關(guān)黃斑變性為干性老年黃斑變性。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的年齡相關(guān)黃斑變性早期診斷的標志物，其特征在于，所述年齡 相關(guān)黃斑變性為濕性老年黃斑變性。5. 權(quán)利要求1所述的miRNA標志物的用途，其特征在于，用于制備檢測年齡相關(guān)黃斑變 性早期診斷試劑或試劑盒。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述miRNA標志物選自如下miRNA中的一種 或多種:hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a_3p 或 has-miR-29b_3p〇7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述檢測為血漿檢測。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示;所述hsa-miR-27a-3p的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示 ；所述has-miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述診斷試劑或試劑盒包括:對!!％-!^!?-195-5p、hsa-miR-27a-3p、has-miR-29b-3p中的一種或兩種以上具有檢測特異性的探針、基 因芯片，或PCR引物；所述hsa-miR-195-5p定量PCR引物序列如SEQ ID NO. 4-5所示；所述 hsa-miR-27a-3p定量PCR引物序列如SEQ ID腸.6-7所示;所述1^81^1?-2%-3口定量?0?引 物序列如SEQ ID NO.8-9所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述年齡相關(guān)黃斑變性為干性老年黃斑 變性或濕性老年黃斑變性。
【文檔編號】C12N15/11GK105861728SQ201610405838
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】于靖, 吳巖, 任成達, 何夢梅, 危清泉
【申請人】上海市第十人民醫(yī)院