一種團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA及其應用，屬于水產(chǎn)動物分子營養(yǎng)代謝技術領域。其通過高通量測序和物信息學分析，篩選到調控團頭魴肝臟SIRT1基因的一個microRNA，所述的microRNA為miR?34a。還進行了分子生物學驗證，結果顯示miR?34a能有效促進團頭魴肝臟SIRT1基因的表達。本發(fā)明公開的miR?34a可以作為團頭魴糖代謝相關的分子標記，在團頭魴飼料糖利用和代謝調控中具有重要的實際應用價值。
【專利說明】
-種團頭紡飼料糖利用和代謝調控分子標巧mi RNA及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種團頭妨飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA及其應用，屬于水 產(chǎn)動物分子營養(yǎng)代謝技術領域。
【背景技術】
[0002] 團頭妨(Megalobrama amblyce地ala)是一種重要的經(jīng)濟魚類，在中國淡水養(yǎng)殖系 統(tǒng)中，它具有重要的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。根據(jù)最新糧農(nóng)組織漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖統(tǒng)計，我國團 頭妨總產(chǎn)量于2014年已經(jīng)達到78.3萬噸。
[0003] 糖是有機體重要的能源和碳源，它能分解產(chǎn)生能量，供有機體生命活動需要，其代 謝的中間產(chǎn)物又可W轉變?yōu)槠渌蓟衔锶绨被帷⒅?、核巧酸等，為動物提供營養(yǎng)物 質。但相較哺乳動物，魚類對糖的耐受能力相對較弱，攝食高糖飼料不利于魚類的生長和對 飼料的利用。發(fā)明人在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，翅嘴紅銷、異育銀娜、團頭妨、青魚長期攝食高水 平碳水化合物日糧會出現(xiàn)糖代謝酶活性下降、血糖持續(xù)偏高、應激蛋白表達上升等高糖不 耐受現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)肝細胞腫大甚至病變等癥狀，引發(fā)營養(yǎng)代謝綜合癥。
[0004] MicroRNA(miRNA)是近年來在真核生物體內發(fā)現(xiàn)的長度約為22個核巧酸的內源性 小型非編碼RNA，能夠識別特定的目標mRNA，并在轉錄組后水平通過促進祀mRNA的降解或抑 制翻譯過程而發(fā)揮調控基因表達的作用。近年，隨著高通量測序技術和分子生物學技術的 發(fā)展，microRNAs(miRNAs)在哺乳動物膜島素分泌、血糖水平和糖代謝中的調控作用逐漸被 確定。如，miR-144可W通過抑制IRSl(膜島素受體基質1)的表達破壞膜島素信號造成膜島 素抵抗。miR-1加表達量的上升與血糖含量和膜島素抵抗程度呈正相關。miR-30d也能夠通 過祀向MAP4K4W及MAFA兩個膜島素轉錄抑制調控子，進而提高膜島素的合成。miR-29a和 miR-29b通過減少MCTl的表達量，從而降低線粒體內的ATP與AW比例而導致膜島素釋放降 低。miR-96則能夠直接抑制分泌顆粒的表達，從而減少膜島素的釋放。在哺乳動物II型糖尿 病模型研究中，基于組織和基于物種的兩種不同方法篩選，通過功能聚類分析發(fā)現(xiàn)miR-34a 與膜島素的釋放不足、膜島素抵抗W及細胞損傷有關，推測miR-34a可能對推進動物高糖代 謝具有重要作用。
[0005] 由于團頭妨的基因組和轉錄組信息尚不完全清楚，因而其miRNA研究也很少。近五 年，不斷有研究發(fā)現(xiàn)與團頭妨生長發(fā)育、肌間骨生長、脂肪代謝等相關miRNAs，可見，miRNA 可能在團頭妨的生長發(fā)育和營養(yǎng)調控過程中發(fā)揮了重要作用。在哺乳動物中，發(fā)現(xiàn)miR-34a 能夠勒!向SIRTl(Silent Information Regulation 1)，通過對關鍵因子的憐酸化/去憐酸 化、乙酷化/去乙酷化的表觀修飾，誘導或抑制膜島素敏感組織中與代謝相關基因的表達， 是糖代謝的中屯、調節(jié)因子。
[0006] 本發(fā)明通過對團頭妨肝臟組織進行高通量miRNA測序，篩選與團頭妨肝臟糖代謝 相關的分子標記，經(jīng)過生物信息學差異基因表達分析初步選定了調控SIRTl基因的 microRNA，命名為miR-Wa。進一步進行了分子生物學實驗，驗證結果顯示本發(fā)明所述的 microRNA可W作為團頭妨肝臟糖代謝調控的microRNA分子標記。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種團頭妨飼料糖利用和代謝調控分 子標記miRNA及其應用。
[0008] 按照本發(fā)明提供的技術方案，一種團頭妨飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA， 所述miRNA為miR-34a，具體序列如沈Q ID N0:1所示。
[0009] 所述miRNA的祀標基因是SIRTl，其為團頭妨肝臟糖代謝關鍵基因，具體序列如SEQ ID NO: 2所示。通過巧光定量PCR法檢測祀標基因 SIRTl，從而判斷糖代謝程度。
[0010] PCR檢測時，采用的特異性上游引物化rward primer如SEQ ID NO: 6所示；下游引 物Reverse primer如SEQ ID N0:7所示；所用的內參為團頭妨0-actin，上游引物F'orward primer如沈Q ID NO:8所示；下游引物Reverse primer如沈Q ID NO:9所示。
[0011] 所述miR-34a在團頭妨攝食高糖飼料后肝臟組織中高表達。采用實時巧光定量PCR 法檢測團頭妨肝臟組織中miRNA的表達。具體步驟為：（1)提取團頭妨肝臟組織總RNA; (2)依 次連接上3'接頭和5'RNA接頭，RT-PCR反轉錄成單鏈CDNA; (3)采用巧光定量PCR試劑盒進行 miR-34a的擴增。
[0012] 所述巧光定量PC時式劑盒，具體包括:反轉錄試劑、反轉錄引物、特異性引物、內參 (團頭妨5s rRNA)、巧光定量PCR反應液。
[OOK] PCR檢測時，所采用的引物對如下：反轉錄引物RT primer的序列如SEQ ID N0:3所 示；上游引物F'orward primer序列如SEQ ID NO: 4所示；下游引物Reverse primer序列如 沈Q ID NO:5所示。
[0014] 上述的試劑盒應用于團頭妨肝臟組織中miR-34a的定量檢測。
[0015] 本發(fā)明首先選取攝食高糖日糧和適宜糖日糧的團頭妨各3尾，送往測序公司進行 高通量small RNA測序，對測序結果進行數(shù)據(jù)分析，得到新的miRNAW及已知的miRNA,并對 所有的miRNA進行差異分析，對差異的miRNA進行祀基因預測，并對運些祀基因進行G0，KEGG 分析。結合研究目的，選擇與糖代謝相關的miRNA進行qPCR驗證，采用edgeR進行差異表達 miRNA表達分析，經(jīng)過篩選，miR-34a作為其中的一個已知miRNA進行驗證，序列為SEQ ID NOl，進一步WmiR-34a為研究對象，通過捜索miRanda，!"argetScan，RNAhybrid數(shù)據(jù)庫，預測 出miR-34a調控的祀基因--SIRTl。
[0016] 根據(jù)上述的miRNA的序列和SIRTl的序列設計引物序列。
[0017] 采用RT-PCR方法檢測5尾攝食高糖日糧團頭妨、5尾攝食適宜糖日糧的團頭妨肝臟 組織中miR-34a及SIRTl的表達情況，結果顯示攝食高糖日糧團頭妨肝臟組織中miR-34a的 表達明顯高于攝食適宜糖日糧的團頭妨肝臟組織，前者是后者的近4.29倍；同樣，攝食高糖 日糧團頭妨肝臟組織中SIRTl的表達明顯高于攝食適宜糖日糧的團頭妨肝臟組織，前者是 后者的近3.11倍。
[001引 miRNA對SIRTl基因表達的調控實驗結果顯示，miR-34a能很好的正調控基因 SIRTl。表明miR-34a可單獨作為標志物應用于團頭妨日糧高糖代謝的調控。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的團頭妨肝臟組織miR-34a的莖環(huán)結構，可用于魚 類miR-34a祀標基因的生物信息學分析。團頭妨肝臟組織SIRTl基因序列，可用于魚類SIRTl 基因的生物信息學分析及定量分析。miR-34a與團頭妨日糧高糖代謝的分子調控有很好的 相關性，可用于團頭妨日糧高糖利用相關的分子營養(yǎng)學中。本發(fā)明檢測miR-34a表達水平的 巧光定量PC時式劑盒包含了從RNA提取到巧光定量實驗所用的整套試劑，既方便使用，又保 證了結果的一致性。
【附圖說明】
[0020] 圖1是團頭妨肝臟組織中miR-34a的莖環(huán)結構圖。
[0021] 圖2是Real-time PCR檢測團頭妨肝臟組織中miR-34a的相對表達量。
[0022] 圖3是Real-time PCR檢測團頭妨肝臟組織中SIRTl的相對表達量。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1高通量轉錄組測序尋找團頭妨肝臟組織中差異表達的microRNA
[0024] 選攝食高糖日糧（可消化糖為51%)和適宜糖日糧（可消化糖為34%)團頭妨各3 尾，無菌條件下分別取他們的肝臟組織，取出后速凍于液氮30min，然后儲存于-80°C冰箱， 樣本提取總RNA后依次連接上3 '接頭和5 ' RNA接頭，RT-PCR反轉錄成單鏈CDNA，進行PCR擴 增，篩選長度在140-15化P的片段構建Illumina測序文庫，文庫檢測合格后，采用高通量測 序法進行團頭妨肝臟組織小RNA測序。對獲得的小RNA的Rawdata文庫數(shù)據(jù)運用化St-QC 化1：化：//\￥麗.13；[0；[址01'1]1日1：；[。3.6日131'址日111.日。.址/91'0^'6。13/化319。/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質 量進行整體評估，并過濾低質量序列。miRNA前體的標志性發(fā)夾結構，能夠用來預測新的 HiiRNAo
[0025] 通過對截取一定長度SRNA比對上的基因組序列，探尋其二級結構及Dicer酶切位 點信息、能量等特征，使用11111?麻預測軟件組'日日9化1:19://3〇111'。日'〇'旨日.]1日1:/91'〇^'日。13/ mireap/)，獲得miR-34a的莖環(huán)結構(具體如圖1所示）。
[00%]由于每個樣本存在測序量的差異，首先需要歸一化每個樣本中表達的miRNA tag 數(shù)(公式：歸一化的表達量(TPM) =HiiRNA比對tag數(shù)/樣品總測序量(M))，采用edgeR對兩樣 本進行差異分析，判斷miRNA表達在兩組樣本中是否存在顯著差異，基于檢驗結果選取FDR <0.05的miRNA為顯著差異表達miRNA。通過分析最終挑選出表達差異明顯的miR-34a，序列 為沈Q ID NO: 1，通過捜miRanda JargetScan,RNAhybrid數(shù)據(jù)庫，預測出他調控的祀基因為 SIRTl，具體序列如沈Q ID NO: 2所示。
[0027] 實施例2Rea^time PCR檢測團頭妨肝臟組織中miR-34a的表達 [00%]隨機選取攝食高糖日糧(可消化糖水平為51% )、攝食適宜糖日糧(可消化糖水平 為34%)的團頭妨各5尾，無菌條件下分別取他們的肝臟組織，取出后速凍于液氮30min。取 肝臟樣品50-100mg，按照RNAiso Plus法（TaKaRa公司）抽提總RNA，WDNAase I酶處理過的 RNA W及RT液為模板，按照W下步驟完成miRNA定量PCR。
[00巧](DmiRNA反轉錄
[0030] 反應體系：在0.2mlPCR反應管中加入：
[0031] RT Primer
[0032] Total RNA(終濃度50化g)化L(根據(jù)濃度計算出X的具體數(shù)值）
[0033] 反應條件：
[0034] S化ge 1:將混勻的反應溶液置于65°C加熱5min，之后放入冰中2min。
[0035] 在上述溶液中加入：
[0036]
[0037] 反應條件：Sl:age 2:16°C30min，42°C60min，85°C，5min。
[0038] (2)miRNA 實時巧光定量 qRT-PCR
[0039] 應用SYBR染料法，對miRNA采用實時定量檢測。用團頭妨5s rRNA作為定量內參。
[0040] 反應體系參照SYBR?Premix Ex TaqTME (Perfect Real Time)說明書，總反應 體系為25化：
[0041]
[0042] Real Time PCR反應程序：951：5111111;40循環(huán)：951：53,601：308
[0043] 最后，利用相對定量算法，按照目的基因的相對表達量計算公式為：Rel.Exp = 2 -A AU，獲得miRNA相對表達量。
[0044] 具體對比數(shù)據(jù)如圖2所示。
[0045] 表1團頭妨肝臟miRNA-34a基因巧光定量PCR引物 [00461
[0047] 實施例3Rea^time PCR檢測團頭妨肝臟組織中SIRTl的表達 [004引隨機選取攝食高糖日糧(可消化糖水平為51% )、攝食適宜糖日糧(可消化糖水平 為34%)的團頭妨各5尾，無菌條件下分別取他們的肝臟組織，取出后速凍于液氮30min，取 肝臟樣品50-100mg，按照RNAiso Plus法（TaKaRa公司）抽提總RNA，WDNAase I酶處理過的 RNAW及RT液為模板，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with 神NA Eraser Prime Scripl般RT reagent Kit(大連!"aKaRa公司）使用說明中SY服Green Assay用的操作方法， 進行RT反應，得到下一步反應所需cDNA。
[0049]團頭妨肝臟SIRTlmRNA相對量采用SYBG't Primix Ex TaqTM II(Tli 腳aseH Plus化it(大連hkara公司），按照SYBR Green I嵌合巧光法進行Real Time PCR擴增反應 (ABI 7500巧光定量PCR，USA)，Real Time PCR反應體系為20化，反應條件為：Holding 31曰邑6(50°[2111；[]1;95°[3111；[]1);切。1;[叫31日邑6(95°[153;60°[603，循環(huán)40次）；1611:0111'￥6 stage(95°C15s，6(TC60s);Date collection(95°C30s，6(TC 15s)。團頭妨肝臟SIRTlmRNA表 達水平計算W團頭妨e-actin為內參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，應用各自的標 準曲線方法確定其相對水平。
[0050]具體對比數(shù)據(jù)如圖3所示。
[0051 ]表2團頭妨肝臟SIRTl基因巧光定量PCR引物 「nnco1
【主權項】
1. 一種團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA，其特征是：所述miRNA為miR-34a，具體序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 如權利要求1所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA，其特征是：所述 miRNA的靶標基因是SIRT1，其為團頭魴肝臟糖代謝關鍵基因，具體序列如SEQ ID N0:2所 不。3. 如權利要求1所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA，其特征是:通過熒 光定量PCR法檢測靶標基因 SIRT1，從而判斷糖代謝程度。4. 如權利要求3所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA，其特征是:PCR檢測 時，采用的特異性上游引物Forward primer如SEQ ID N0:6所示；下游引物Reverse primer 如SEQ ID NO :7所示；所用的內參為團頭魴β-actin，上游引物Forward primer如SEQ ID N0:8所不；下游引物Reverse primer如SEQ ID N0:9所不。5. 如權利要求1所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA，其特征是：所述 miR-34a在團頭魴攝食高糖飼料后肝臟組織中高表達。6. 權利要求1所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA的應用，其特征是:采 用實時熒光定量PCR法檢測團頭魴肝臟組織中miRNA的表達。7. 如權利要求6所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA的應用，其特征是具 體步驟為：（1)提取團頭魴肝臟組織總RNA; (2 )依次連接上3 '接頭和5 ' RNA接頭，RT-PCR反轉 錄成單鏈cDNA;(3)采用熒光定量PCR試劑盒進行miR-34a的擴增。8. 如權利要求7所述團頭魴飼料糖利用和代謝調控分子標記miRNA的應用，其特征是所 述熒光定量PCR試劑盒具體包括:反轉錄試劑、反轉錄引物、特異性引物、內參，即團頭魴5s rRNA、熒光定量PCR反應液； 具體引物對如下：反轉錄引物RT primer的序列如SEQ ID N0:3所示；上游引物Forward primer序列如SEQ ID N0:4所示；下游引物Reverse primer序列如SEQ ID N0:5所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861730SQ201610415841
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】繆凌鴻, 戈賢平, 劉波, 任鳴春, 孫盛明, 周群蘭
【申請人】中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心