Ablim3基因作為食管癌診治標(biāo)志物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于食管癌早期診斷的分子標(biāo)志物?ABLIM3基因及其表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明利用QPCR和Western blot方法證明ABLIM3基因在食管癌組織和正常食管組織中存在差異表達(dá)，可以作為早期診斷食管癌的指標(biāo)。另外，本發(fā)明還公開了ABLIM3基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為食管癌治療的靶標(biāo)，用于指導(dǎo)新藥的研發(fā)。
【專利說明】
ABLIM3基因作為食管癌診治標(biāo)志物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及ABLIM3基因在食管癌的診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是我國常見的惡性消化道腫瘤，在各種癌癥死亡率中居第6位。國際癥研究 署發(fā)布的2008年世界癌癥發(fā)病與死亡報(bào)告(Globocan 2008)報(bào)道，中國食管癌發(fā)病25.92萬 例，全球食管癌發(fā)病48.16萬例，占全球百分比超過一半高達(dá)53.82 %，同期全球死亡40.65 萬例，中國21.11萬例，占51.92%。且隨著生活水平提高與生活方式改變有逐年上漲的趨 勢(shì)。因此，對(duì)食管癌早期發(fā)現(xiàn)早期診治方面的研究，特別是實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)成為科研工作者義不 容辭的一項(xiàng)任務(wù)。食管癌與其他惡性腫瘤一樣，是在內(nèi)、外因素共同影響下發(fā)生的多基因表 達(dá)調(diào)控失調(diào)的一種個(gè)體化疾病。傳統(tǒng)治療方法W手術(shù)為主，放、化療為輔，盡管目前多種治 療技術(shù)的改進(jìn)，總體5年生存率仍然很低，尤其對(duì)于晚期食管癌效果不甚理想。食管癌的早 期發(fā)現(xiàn)和治療，將會(huì)大大提高患者的生存機(jī)率。因此尋找一種早期診斷食管癌的方法是亟 待解決的事情。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于食管癌早期診斷的 分子標(biāo)志物。使用基因標(biāo)志物來診斷食管癌具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾 病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明提供了檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應(yīng)用。
[0006] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)ABLIM3基因 mRNA水平的產(chǎn)品、 和/或檢測(cè)ABLIM3蛋白水平的產(chǎn)品。
[0007] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 、原位雜交或忍片檢測(cè)ABLIM3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平W診斷食管癌的產(chǎn)品。
[000引進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增ABLIM3基因的引 物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增ABLIM3基因的引物;所述 用免疫檢測(cè)診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與ABLIM3蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診 斷食管癌的產(chǎn)品包括:與ABLIM3基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管癌的產(chǎn) 品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與ABLIM3蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因 忍片包括與ABLIM3基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增ABLIM3基因的引 物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0010] 所述檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的產(chǎn)品可W是檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的試劑、也可W是包 含所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0011] 所述診斷食管癌的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高 通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷食管癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的 基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜， 容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知ABLIM3基因的異常與 食管癌相關(guān)也屬于ABLIM3基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種診斷食管癌的工具，所述工具包括檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的試 劑;所述試劑包括檢測(cè)ABLIM3基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)ABLIM3蛋白的抗體。
[0013] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0014] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測(cè)ABLIM3基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì) ABLIM3基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的ABLIM3 蛋白的特異性抗體;所述基因忍片可用于檢測(cè)包括ABLIM3基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與食 管癌相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測(cè)包括ABLIM3蛋白在內(nèi)的多 個(gè)蛋白質(zhì)(例如與食管癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與食管癌的標(biāo)志物同 時(shí)檢測(cè)，可大大提高食管癌診斷的準(zhǔn)確率。
[001引其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)ABLIM3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括ABLIM3蛋白 的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或忍 片方法檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)ABLIM3基 因的引物和/或探針。根據(jù)ABLIM3基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可W用于檢測(cè)ABLIM3 基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0016] 所述試紙包括檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的試劑。
[0017] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)的試劑。
[001引與ABLIM3基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié)合， 任何長度都可W。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述探針的 長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長度對(duì)雜 交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長一般不超 過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核巧酸序列互補(bǔ)的長度W15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序 列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，W免影響雜交效率。
[0019]進(jìn)一步，所述AMJM3蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述AMJM3 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如，，嵌合抗體、scFv、 化6、尸(曰6'）2、尸乂等。只要所述片段能夠保留與48^13蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水 平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可W使用任何方法來制備所述抗 體。
[0020] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)ABLIM3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。
[0021] 本發(fā)明還提供了 ABLIM3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑在制備治療食管癌的藥物 中的應(yīng)用。
[0022] 所述促進(jìn)劑包括促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)的試劑和促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑； 所述促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)的試劑包括促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的試劑、促進(jìn)基因翻譯的試劑、促進(jìn) ABLIM3蛋白含量的試劑;所述促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括促進(jìn)A化IM3基因表達(dá)產(chǎn) 物穩(wěn)定性的試劑、促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑、促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)產(chǎn)物功能的 試劑。
[0023] 具體地，所述促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)的試劑包括：含有ABLIM3基因的試劑、攜帶 ABLIM3基因的載體或宿主細(xì)胞所形成的試劑、含有ABLIM3蛋白質(zhì)的試劑。
[0024] 本發(fā)明的促進(jìn)劑一方面可W用于補(bǔ)充內(nèi)源性的ABLIM3蛋白的缺失或不足，通過提 局ABLIM3蛋白的表達(dá)，從而治療因 ABLIM3蛋白缺之導(dǎo)致的食管癌。另一方面可W用于促進(jìn) ABLIM3蛋白的活性或者功能，從而治療食管癌。
[0025] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、隧菌體、病毒等。
[0026] 在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如C冊(cè)細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種用于治療食管癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的ABLIM3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑。
[0028] 進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，運(yùn)類載體包括(但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、薦糖等;粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙締化咯燒酬;濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸巧和碳酸氨鋼;吸收促進(jìn)劑季錠 化合物;表面活性劑如十六燒醇;吸附載體如高嶺±和皂粘±;潤滑劑如滑石粉、硬脂酸巧 和儀、聚乙二醇等。
[0029] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可W分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方式 包括將含有ABLIM3基因的藥物或者含有ABLIM3蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植或 回輸?shù)襟w內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有ABLIM3基因的藥物或者含有ABLIM3蛋白質(zhì)的藥物注 入體內(nèi)組織中。
[0030] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療食管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可W大大提 到治療的成功率。
[0031] 在本發(fā)明的上下文中/'ABLIM3基卸'包括ABLIM3基因 W及ABLIM3基因的任何功能 等同物的多核巧酸。A化IM3基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中ABLIM3基 因（NC_000005.10)DNA序列具有70%W上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0032] 優(yōu)選地，ABLIM3基因的編碼序列包括W下任一一種DNA分子：
[0033] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0034] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0035] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90% W上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0036] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述ABLIM3基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0037] 在本發(fā)明的上下文中，A化IM3基因表達(dá)產(chǎn)物包括ABLIM3蛋白W及ABLIM3蛋白的部 分膚。所述ABLIM3蛋白的部分膚含有與食管癌相關(guān)的功能域。
[003引 "A化IM3蛋白"包括ABLIM3蛋白W及ABLIM3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同 物包括ABLIM3蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然 突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與ABLIM3的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0039] 優(yōu)選地，ABLIM3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0040] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0041] (2)將SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0042] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。
[0043] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述ABLIM3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)。
[0044] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0045] 通過添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是ABLIM3蛋白的融 合蛋白。對(duì)于與ABLIM3蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留 ABLIM3蛋白的生物學(xué)活性即可。
[0046] 本發(fā)明的ABLIM3蛋白也包括對(duì)SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只 要經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留ABLIM3蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突 變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[0047] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷食管癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有食管癌、也 包括判斷受試者是否存在患有食管癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0048] 在本發(fā)明的上下文中，"治療食管癌"從疾病的狀態(tài)變化來分，可W包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括對(duì)于疾病治療效果的評(píng)價(jià)。
[0049] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0050] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 ABLIM3基因表達(dá)與食管癌相關(guān)，通過檢測(cè)受試者食管組織中 ABLIM3的表達(dá)，可W判斷受試者是否患有食管癌、或者判斷受試者是否存在患有食管癌的 風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0051] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-A化IM3基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷 更及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)食管癌的早期診斷。
【附圖說明】
[0052] 圖1顯示利用QPCR檢測(cè)ABLIM3基因在食管癌組織和正常食管組織中的表達(dá)情況； [0化3] 圖2顯示利用Western blot檢測(cè)ABLIM3蛋白在食管癌組織和正常食管組織中的表 達(dá)情況；
[0054]圖3顯示利用QPCR在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)ABLIM3基因的過表達(dá)情況；
[0化5] 圖4顯示利用Western blot檢測(cè)ABLIM3蛋白的過表達(dá)情況；
[0056] 圖5顯示利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ABLIM3基因表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響。
[0057] 具體的實(shí)施方式
[0058] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。W下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0化9] 實(shí)施例1正常食管組織和食管癌組織中ABLIM3基因的表達(dá)差異 [0060] 1、實(shí)驗(yàn)材料；
[0061 ]食管癌組織為醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的標(biāo)本，正常組織為胃鏡室鏡下取出的標(biāo)本， 手術(shù)切除的食管腫瘤組織離體后立即取材，取材時(shí)均佩戴一次性無菌手套，應(yīng)用高壓滅菌 的手術(shù)刀片切取。
[0062] 所有病例均經(jīng)病理確診。包括食管癌組織40例，正常食管組織30例。其中食管鱗癌 34例，食管腺癌6例。W正常食管組織作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均病理證實(shí)，術(shù)前均未行放 療、化療等治療，且無其他部位的腫瘤等。所有組織均在手術(shù)半小時(shí)內(nèi)液氮保存后，移入-80 度冰箱凍存。
[0063] 2、在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)ABLIM3基因的差異表達(dá)
[0064] 2.1組織RNA的提取(利用No巧en RNA提取試劑盒）
[0065] 1)在較少RNase干擾的清潔區(qū)，使用含適量液氮的研鉢稱取離體組織樣本約20mg， 用巧棒研磨至粉末狀；
[0066] 2)將樣本轉(zhuǎn)移到一個(gè)不含RNA酶的2mL的離屯、管中；
[0067] 3)加入300化Lysis solution,置于勻漿器內(nèi)，充分研磨l-5min;
[0068] 4)12000旨，4°(：，離屯、10111111，轉(zhuǎn)移上清至新的1.51111的離屯、管中；
[0069] 5)加入60化1 RNase-Free Water,用縱滿器混勻；
[0070] 6)加入蛋白酶K，在55°C溫浴15min，不斷滿旋混勻；
[0071] 7)14000g，室溫，離屯、Imin,使細(xì)胞碎片沉淀于離屯、管底部，取上清轉(zhuǎn)移到另外一 個(gè)不含RNA酶1.5mL的離屯、管中；
[0072] 8)加入45化1的95%乙醇，滿旋混勻；
[0073] RNA吸附：
[0074] 9)取65化1含乙醇的裂解液加到離屯、柱中，14000g離屯、Imin;
[0075] 10)棄下層，重置收集管于柱上；
[0076] 11)依照裂解液的容量，重復(fù)9)~10)步；
[0077] 12)加入40化1 Wash solution,HOOOg離屯、2min;
[0078] 13)棄下層，將柱置于一新的收集管上；
[0079] DNase 處理：
[0080] 14)加入lOOul Enzyme Incubation Buffer和ISul DNase I，HOOOg離屯、Imin;
[0081 ] 15)將收集管中的溶液重新移入柱中；
[0082] 16)室溫放置 15min;
[0083] RNA 洗涂：
[0084] 17)加入400]il Wash solution, 14000g離屯、Imin，棄下層，重置收集管于柱上；
[00化]18)加入40化1 Wash solution,HOOOg離屯、2min，棄收集管；
[0086] RNA 洗脫：
[0087] 19)把柱子放入 1.7mL Elution管中；
[0088] 20)加入30iU Elution Buffer;
[0089] 21)200g離屯、2min，使溶液充分與柱結(jié)合，然后HOOOg離屯、Imin。
[0090] 2.2逆轉(zhuǎn)錄
[0091 ] 利用TAKARA公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
[0092] 2.3 QPCR
[0093] (1)引物設(shè)計(jì)
[0094] 根據(jù)Genbank中ABLIM3基因和GAPDH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[0095] ABLIM3 基因：
[0096] 正向引物為5'-GTATATCAGCAAGGATGGT-3'（SEQ ID N0.3);
[0097] 反向引物為5'-GGTCACAAGTCTCACATT-3'（沈Q ID N0.4),
[009引 GATOH基因：
[0099] 正向引物為5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0100] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0101] (2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0102] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購自Invitrogen公司。
[0103] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0104]
[0105]
[0106] (3 )PCR反應(yīng)條件：95°C IOmin，（95°C 15s，60°C40s)*45個(gè)循環(huán)。WSYBR Green作為 巧光標(biāo)記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，A A CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0107] 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0108] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，不同組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí) 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0109] 2.5 結(jié)果
[0110] 結(jié)果如圖1所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中ABLIM3基因的mRNA水平顯著 降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0111] 3、在蛋白水平上檢測(cè)ABLIM3基因的差異表達(dá)
[0112] 3.1提取組織總蛋白
[0113] 按照化i如化組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。
[0114] 3.2 Western blot檢測(cè)
[0115] 將提取的蛋白定量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗解育、二抗解育、 顯色。
[0116] 3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0117] 將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，We-actin為內(nèi)參，將目的白條 帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[011引 3.4結(jié)果
[0119] 結(jié)果如圖2所示，與正常食管組織相比，食管癌組織中ABLIM3蛋白含量降低，差異 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0120] 實(shí)施例2 ABLIM3基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0121] UABLIM3基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0122] 根據(jù)ABLIM3基因的編碼序列（如SEQ ID NO. 1所示)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。從成人胎腦的 cDNA文庫klontech公司，貨號(hào)：638831)中擴(kuò)增全長的ABLIM3基因的編碼序列，將上述cDNA 序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體PCDNA3.1中，連接獲得的重組載體PCDNA3.1-A化IM3用于后續(xù) 實(shí)驗(yàn)。
[0123] 2、食管癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0124] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0125] 食管癌細(xì)胞系ECA109接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中、將其放置于37 °C、5 % CO播養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80 %融合時(shí)，用0.化％膜蛋白酶消化傳代。
[0126] 2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0127] 將食管癌細(xì)胞按1 X 10^孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細(xì) 胞培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購自于Invitrogen公司）的說明書轉(zhuǎn)染，實(shí)實(shí)驗(yàn) 分為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染PCDNA3.1)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-AMJM3)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的工作濃度是0.5 μg/mlO
[012引3、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效果。
[0129] 3.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。
[0130] 3.2逆轉(zhuǎn)錄
[0131] 步驟同實(shí)施例1。
[0132] 3.3 QPCR
[0133] 步驟同實(shí)施例1。
[0134] 3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0135] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0136] 4、Weste;rn 檢測(cè)
[0137] 具體步驟同實(shí)施例1。
[013引5、結(jié)果
[0139] 如圖3所示，與轉(zhuǎn)染PCDNA3.1空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-A化IM3的細(xì)胞中 ABLIM3的mRNA水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);如圖4所示，與轉(zhuǎn)染PCDNA3.1 空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-ABLIM3的細(xì)胞中ABLIM3的蛋白水平顯著上調(diào)，差異具有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.〇5)。
[0140] 實(shí)施例3 ABLIM3基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖的影響
[0141 ]采用MlT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ABLIM3基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖能力影響。
[0142] 1、步驟:各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h后膜酶消化，制成單細(xì)胞懸液，W每孔6000個(gè)細(xì)胞接種 于96孔培養(yǎng)板中，每組分3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行第1次檢測(cè)： 每孔加入5g/L的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)地后，吸去培養(yǎng)基，加入DMSO 15化1，細(xì)屯、吹打，使紫 藍(lán)色沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀在490nm波長測(cè)吸光度值(A值）。然后每24h檢測(cè)1次，連續(xù)測(cè) 7化，共3次。
[0143] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0144] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩組 之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0145] 3、結(jié)果
[0146] 圖5所示的結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-A化IM3組的細(xì)胞生長速度明顯低于轉(zhuǎn)染 PCDNA3.1空載體組的細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)上述結(jié)果表明ABLIM3表 達(dá)能夠抑制食管癌細(xì)胞的生長。
[0147] 實(shí)施例4 ABLIM3基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞周期的影響
[0148] 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，在此過程中使用的PI單染試劑購自美國BD公司產(chǎn) 品。
[0149] 1、步驟:各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染4她后膜酶消化，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗涂2次，70 %的乙醇 固定過夜。按操作說明加相應(yīng)試劑，避光放置30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。
[0150] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0151] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0152] 3、結(jié)果
[0153] 如表2中顯示的結(jié)果，與轉(zhuǎn)染PCDNA3.1空載體組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-A化IM3 組細(xì)胞處于Gl期的細(xì)胞明顯增多，處于S期的細(xì)胞明顯減少。上述結(jié)果表明，A化IM3基因表 達(dá)能夠抑制細(xì)胞周期。
[0154]表2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期變化(百分比） rmssi
L0156」 注：與轉(zhuǎn)染PCDNA3.1空載體組相比，沖<0.05。
[0157]上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)ABUM3基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷食管癌的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測(cè)、原位雜交芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)ABUM3基因表達(dá)以診斷食管癌的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括 一對(duì)特異擴(kuò)增ABUM3基因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特 異擴(kuò)增ABUM3基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與ABUM3蛋白特異性 結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷食管癌的產(chǎn)品包括:與ABUM3基因的核酸序列雜交的探 針；所述用芯片診斷食管癌的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與 ABUM3蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與ABUM3基因的核酸序列雜交的探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至 少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增ABUM3基因的引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。5. -種診斷食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測(cè)ABUM3基因表達(dá)的試劑;所 述試劑包括檢測(cè)ABUM3基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)ABUM3蛋白的抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工具，其特征在于，所述檢測(cè)ABUM3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。 7. ABUM3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)的試劑、促進(jìn) ABUM3基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的試劑、促進(jìn)ABUM3基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑、促進(jìn)ABUM3基 因表達(dá)產(chǎn)物功能的試劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，促進(jìn)ABLIM3基因表達(dá)的試劑包括含有 ABUM3基因的試劑、攜帶ABUM3基因的載體或宿主細(xì)胞所形成的試劑、含有ABUM3蛋白質(zhì) 的試劑。10. -種用于治療食管癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括7-9中任一 項(xiàng)所述的促進(jìn)劑。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK105861740SQ201610472155
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】田子強(qiáng), 溫士旺, 李振華, 徐延昭
【申請(qǐng)人】河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院