用于在治療皮膚病中局部使用的煙酰胺核苷組合物的制作方法
【專利摘要】提供了含有煙酰胺核苷(NR)的組合物。含有NR的組合物用于護(hù)理或治療皮膚和皮膚病。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及含有煙酰胺核苷的藥物組合物和化妝品組合物。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使用煙酰胺核苷促進(jìn)細(xì)胞和組織中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的細(xì)胞內(nèi)水平增加從而提高細(xì)胞和組織存活的方法。提供了一種治療個(gè)體的衰老或皮膚皺紋的體征或癥狀的方法，包括向需要此治療的該個(gè)體局部給予有效量的化合物煙酰胺核苷或其鹽。
【專利說(shuō)明】
用于在治療皮膚病中局部使用的煙醜胺核昔組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 含有煙酷胺核巧(NR)的組合物可W用于護(hù)理或治療皮膚和皮膚病。在一些實(shí)施例 中，本發(fā)明設(shè)及含有煙酷胺核巧的藥物組合物和化妝品組合物。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明設(shè) 及使用煙酷胺核巧促進(jìn)細(xì)胞和組織中的煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(NAD+)的細(xì)胞內(nèi)水平增加 W提高細(xì)胞和組織存活W及整體細(xì)胞和組織健康的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 使用NAD+的酶在DNA修復(fù)過(guò)程中起一定作用。確切地說(shuō)，聚（ADP-核糖）聚合酶 (PARP )，尤其PARP-I是由DNA鏈斷裂激活的并且影響DNA修復(fù)。PARP消耗作為腺巧二憐酸核 糖(ADPR)供體的NAD+并且使聚(ADP-核糖)合成核蛋白諸如組蛋白和PARP本身。盡管PARP活 性有利于DNA修復(fù)，但是PARP的過(guò)度激活可W引起細(xì)胞內(nèi)NAD+顯著消耗，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞 死。NAD+代謝對(duì)于基因毒性的表觀敏感性已引起對(duì)抑制PARP作為改善細(xì)胞存活的方式的藥 理學(xué)研究。大量報(bào)告已顯示PARP抑制增加遭受基因毒性的細(xì)胞中的NAD+濃度，從而導(dǎo)致細(xì) 胞壞死降低。然而，仍然發(fā)生因毒性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，推測(cè)是因?yàn)榧?xì)胞能夠完成由基因毒性 激活的調(diào)亡途徑。因此，即使在PARP抑制的情況下，大量的細(xì)胞死亡仍是DNA/大分子損傷的 結(jié)果。該結(jié)果表明改善基因毒性中的NAD+代謝可W部分有效地改善細(xì)胞存活但是調(diào)節(jié)調(diào)亡 敏感性的其他參與者諸如去乙酷化酶(Sirtuin)也可W在細(xì)胞對(duì)基因毒素的響應(yīng)中起重要 作用。
[0003] 確定組織中化學(xué)毒性和福射毒性的影響的生理機(jī)制和生化機(jī)制是復(fù)雜的，并且有 證據(jù)表明MD+代謝是細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)途徑中的重要參與者。例如，已顯示通過(guò)煙酷胺/煙酸單 核巧酸過(guò)表達(dá)上調(diào)NAD+代謝能抵抗神經(jīng)元軸突變性，并且目前已顯示藥理學(xué)上使用的煙酷 胺能提供胎兒乙醇綜合征和胎兒局部缺血模型中的神經(jīng)元保護(hù)。運(yùn)些保護(hù)作用可能歸因于 上調(diào)的NAD+生物合成，運(yùn)增加在基因毒性應(yīng)激過(guò)程中遭受消耗的可用NAD+庫(kù)。該NAD+消耗 由PARP酶介導(dǎo)，該酶由DNA損傷激活并且可W消耗細(xì)胞NAD+，從而導(dǎo)致壞死性死亡。與上調(diào) 的NAD+生物合成共同起作用的另一種增強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制是激活由去乙酷化酶(Sirtuin) 酶調(diào)節(jié)的細(xì)胞保護(hù)轉(zhuǎn)錄程序。
[0004] 與NAD+和去乙酷化酶（Sirtuin)有關(guān)的細(xì)胞和組織保護(hù)的實(shí)例包括SIRTl是與創(chuàng) 傷和基因毒性相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)所必須的結(jié)果。SIRTl還可W通過(guò)減少的NFKB信號(hào)傳遞來(lái)降 低e淀粉樣蛋白的小神經(jīng)膠質(zhì)依賴性毒性。SIRTl和增加的NAD+濃度提供阿爾茨海默氏病模 型中的神經(jīng)保護(hù)。去乙酷化酶（Sirtuin)是具有蛋白質(zhì)脫乙酷酶和ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性的 上調(diào)應(yīng)激響應(yīng)途徑的NAD+依賴性酶。有證據(jù)指示SIRTl由卡路里限制進(jìn)行上調(diào)并且在人類 中可通過(guò)下調(diào)p53和Ku70功能提供對(duì)抗細(xì)胞調(diào)亡的細(xì)胞。此外，SIRTl上調(diào)活性氧(ROS)解毒 中設(shè)及的蛋白質(zhì)如MnSOD的FOXO依賴性轉(zhuǎn)錄。已顯示去乙酷化酶(sirtuin)SIRT6參與DNA修 復(fù)途徑并且?guī)椭S持基因組穩(wěn)定性。關(guān)于包括煙酷胺核巧的煙堿基核巧，各種用途已在美 國(guó)專利8，106，184中提出，該專利通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0005] UV介導(dǎo)的DNA損傷
[0006] 紫外化V)光在從衰老至癌癥范圍內(nèi)的眾多皮膚病的發(fā)展中起不可缺少的作用。數(shù) 十年間大量證據(jù)已最終證實(shí)UV福射觸發(fā)多種獨(dú)立性細(xì)胞響應(yīng)。已知UV福射穿透皮膚，其中 該UV福射由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)W及DNA吸收，引起一系列導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能逐漸退化的事 件（瑪拉基（Valacchi)等人，"皮膚對(duì)環(huán)境應(yīng)激物的響應(yīng)（Cutaneous responses to environment! stressors)"，紐約科學(xué)院年刊（Ann.N.Y.Acad. Sci .) (2012)1271:75-81)。 DNA是生命的組成部分并且其穩(wěn)定性對(duì)于所有活細(xì)胞適當(dāng)?shù)墓δ苁菢O其重要的。UV福射是 最強(qiáng)大(且普遍)的環(huán)境因素之一，它可W通過(guò)誘導(dǎo)突變和細(xì)胞毒性DNA病變;最顯著地環(huán)下 燒喀晚二聚體（CPD)和6-4光化產(chǎn)物（64pp)而引起廣泛范圍的細(xì)胞病癥（納拉亞南 (化 rayanan)等人，。紫外福射和皮膚癌化 Itraviolet radiation and skin cancer)"，國(guó) 際皮膚病學(xué)雜志（Int. J.DermatoI.) (2010)49:978-86)。值得注意的是UV介導(dǎo)的DNA損傷是 多個(gè)增殖性細(xì)胞病癥中的早期事件。UV誘導(dǎo)的DNA損傷的兩種主要類型是era和64pp(與它 們的杜瓦異構(gòu)體一起）（辛哈，R. P. (Sinha，R. P.)和黑德，D. P.化ader，D. P.)，"UV誘導(dǎo)的DNA 損傷和修復(fù)：評(píng)論（UV-induced DNA damage and repai;r:a review)"，光化學(xué)和光生物學(xué) 科學(xué)（Photochem. Photobiol. Sci .) (2002)1:225-36; W及拉斯托吉（Rastogi)等人，。紫外 福射誘導(dǎo)的DNA損傷和修復(fù)的分子機(jī)制（Molecular mechanisms of ultraviolet radiation-induced DNA damage and repair)"，核酸期刊（J.Nucleic Acids) (2010) 2010:592980)。運(yùn)些大量的DNA病變?nèi)绻葱迯?fù)可能干擾DNA復(fù)制并且隨后引起DNA突變。因 此，運(yùn)些病變可W是突變的(潛在地導(dǎo)致增殖性病癥)和/或可W是細(xì)胞毒性的（導(dǎo)致細(xì)胞死 亡）D64ppWcro頻率的約S分之一出現(xiàn)，但是是更加致突變的（辛哈和黑德，2002)。在一個(gè) 實(shí)施例中，運(yùn)些UV介導(dǎo)的DNA加合物的預(yù)防對(duì)于防止從衰老至癌癥范圍的若干增殖性病癥 發(fā)作是極其重要的。
[0007] UV介導(dǎo)的屏障功能的喪失
[0008] 維持有機(jī)體與環(huán)境之間的不透水屏障是皮膚的基本功能。該屏障功能用于防止脫 水;該脫水可W導(dǎo)致有機(jī)體死亡(江，S.J. (Jiang,S.J.)等人，"紫外B誘導(dǎo)的皮膚屏障和表 皮重丐梯度的改變（Ultr曰violet B-induced 曰Iterations of the skin barrier and 邱idermal calcium gradient)"，實(shí)驗(yàn)皮膚病學(xué)化邱.Dermatol. )(2007)16:985-992)。已 證實(shí)UV光W劑量依賴性方式破壞表皮屏障功能（原武，A.化aratake，A.)等人/'UVB誘導(dǎo)的 滲透屏障功能的改變：對(duì)表皮過(guò)度增殖和胸腺細(xì)胞介導(dǎo)的響應(yīng)的作用（UVB-induced alterations in permeability barrier function: roles for epidermal hyperproliferation and thymocyte-mediated response )"皮膚病學(xué)石開究其月干。 (J. Invest.Dermatol.) (1997) 108:769-775; W及先前的引用）。皮膚屏障功能不良可通過(guò) 測(cè)量經(jīng)皮水分流失(TEWL)直接進(jìn)行評(píng)估，其為皮膚水合的測(cè)量(奧己，C.(Oba，C.)等人/'膠 原水解物吸收改善無(wú)毛小鼠的由UVB福射誘導(dǎo)的表皮屏障功能和皮膚彈性的損失 (Coll曰gen hydrolys曰te intake improves the loss of epiderm曰I b曰rrier function and skin elasticity induced by UVB irradiation in hairless mice)"，光照皮膚病 學(xué)光照免疫學(xué)光照醫(yī)學(xué)（Photodermatol .Photoimmunol .F*hotomed.) (2013)29:204-11; W 及先前的引用）。
[0009] 因此，假設(shè)用于若干人類皮膚病癥的化學(xué)預(yù)防性藥劑將有效抑制或預(yù)防直接UV介 導(dǎo)的屏障功能損失、DNA損傷或氧化性損傷，從而幫助維持健康人類皮膚。
[0010] 如果可W發(fā)現(xiàn)在維持人類皮膚健康的局部皮膚護(hù)理組合物中使用煙酷胺核巧或 其鹽的方式，則運(yùn)將是對(duì)本領(lǐng)域的有用貢獻(xiàn)。此外，如果可W發(fā)現(xiàn)在維持人類皮膚健康的化 妝品或藥用化妝品組合物中使用煙酷胺核巧或其鹽的方式，則運(yùn)也將是對(duì)本領(lǐng)域的有用貢 獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] -種皮膚護(hù)理組合物包含煙酷胺核巧或其鹽，任選地與選自W下各項(xiàng)的化合物組 合:巧類(例如，蝶巧）、姜黃素、膚、視黃醇、水楊酸、過(guò)氧化苯甲酯、維生素 ca-抗壞血酸）、 花青素或其組合。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中，煙酷胺核巧是選自W下各項(xiàng)的一種鹽形式:氣化物、氯化物、漠 化物、艦化物、甲酸鹽、乙酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸鹽、巧樣酸鹽、氨基甲酸鹽、甲酸 鹽、葡萄糖酸鹽、乳酸鹽、甲基漠化物、甲基硫酸鹽、硝酸鹽、憐酸鹽、二憐酸鹽、班巧酸鹽、硫 酸鹽或=氣乙酸鹽。
[0013] 提供了一種治療個(gè)體的衰老或皮膚皺紋的體征或癥狀的方法，該方法包括向需要 此治療的個(gè)體局部給予有效量的化合物煙酷胺核巧或其鹽。
[0014] 提供了一種用于治療或預(yù)防個(gè)體皮膚中的UV介導(dǎo)的DNA損傷的化學(xué)保護(hù)性方法， 該方法包括向需要此治療的個(gè)體局部給予治療有效量的化合物煙酷胺核巧或其鹽。
[0015] 提供了一種用于治療或預(yù)防個(gè)體皮膚中的氧化性損傷的細(xì)胞保護(hù)性方法，該方法 包括向需要此治療的個(gè)體局部給予治療有效量的化合物煙酷胺核巧或其鹽。
[0016] 提供了一種用于治療或修復(fù)個(gè)體皮膚中的傷口的方法，該方法包括向需要此治療 的個(gè)體局部給予治療有效量的化合物煙酷胺核巧或其鹽，其中該皮膚中的皮膚細(xì)胞具有增 加的運(yùn)動(dòng)和/或增殖。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1示出用ImM出0油生長(zhǎng)停滯條件（1%胎兒牛血清，F(xiàn)BS)下；對(duì)照，+0.2mM NR; + ImM NR; W及巧mM NR解育的人類表皮A431細(xì)胞的氧化性損傷保護(hù)測(cè)定。活細(xì)胞W反應(yīng)性巧 光單位(RFU)示出。
[001引圖2示出用ImM此02在正常生長(zhǎng)條件（10%FBS)下；對(duì)照，+0.04mM NR;+0.2mM NR; W及+ImM NR解育的圖I的實(shí)驗(yàn)。
[0019]圖3示出用細(xì)胞培養(yǎng)基（對(duì)照）；+111^^;從及巧1111^預(yù)處理的人類表皮4431細(xì) 胞;然后將所有樣品W lOJ/m2暴露至UV-C福射的UV損傷測(cè)定。將UV誘導(dǎo)的DNA損傷W環(huán)下燒 喀晚二聚體(CPD)水平反映。
[0020] 圖4A是示出用1 %FBS解育（0小時(shí)）的小鼠 NIH 3T3成纖維細(xì)胞的第一劃痕傷口愈 合測(cè)定在40X放大倍數(shù)下的顯微照片。
[0021] 圖4B是示出用1%FBS解育（24小時(shí)）的圖4A的劃痕傷口愈合測(cè)定在40X放大倍數(shù)下 的顯微照片，運(yùn)證明通過(guò)細(xì)胞遷移閉合間隙。
[0022] 圖5A是示出用5%FBS對(duì)照解育（0小時(shí)）的小鼠 NIH 3T3成纖維細(xì)胞的第一劃痕傷 口愈合測(cè)定在40X放大倍數(shù)下的顯微照片。
[00剖圖5B是示出服％ FBS對(duì)照解育（24小時(shí)）的圖5A的劃痕傷口愈合測(cè)定在40X放大倍 數(shù)下的顯微照片，運(yùn)證明通過(guò)細(xì)胞遷移閉合間隙。
[0024] 圖6A是示出用l%FBS+lmM NR解育(0小時(shí)）的小鼠 NIH 3T3成纖維細(xì)胞的第二劃痕 傷口愈合測(cè)定在40X放大倍數(shù)下的顯微照片。
[002引圖6B是示出用1 %FBS+lmM NR解育（24小時(shí)）的圖6A的劃痕傷口愈合測(cè)定在40X放 大倍數(shù)下的顯微照片，運(yùn)證明通過(guò)細(xì)胞遷移閉合間隙。
【具體實(shí)施方式】
[00%] 在某些實(shí)施例中，煙酷胺核巧(NR)或其鹽可W增加 NAD+活性。還認(rèn)為增加 NAD+活 性可W增加去乙酷化酶（Sirtuin)活性，因?yàn)镹AD+可W充當(dāng)SIRTl的底物。運(yùn)些藥劑可W包 括NAD+或NADH、NAD+前體、NAD+補(bǔ)救途徑中的中間體或生成NAD+的底物諸如煙酷胺單核巧 腺巧酷轉(zhuǎn)移酶(NMNAT)或編碼煙酷胺單核巧腺巧酷轉(zhuǎn)移酶的核酸。煙酷胺單核巧腺巧酷轉(zhuǎn) 移酶可W是NMNATl蛋白質(zhì)。其他可用的NAD+前體包括煙酷胺和煙酸。通過(guò)引用結(jié)合在此的 米爾布蘭特(Mi Aramlt)等人的美國(guó)專利7,776,326討論了NAD生物合成途徑。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種通過(guò)使細(xì)胞接觸煙酷胺核巧或其鹽來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞壽 命、延長(zhǎng)細(xì)胞增殖能力、減慢細(xì)胞衰老、促進(jìn)細(xì)胞存活、延遲細(xì)胞衰老、模擬卡路里限制的影 響、增加細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的抵抗或預(yù)防細(xì)胞調(diào)亡的方法。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，運(yùn)些方法包括 使皮膚細(xì)胞與煙酷胺核巧或其鹽接觸。
[0028] 在另一個(gè)實(shí)施例中，意圖長(zhǎng)時(shí)間段保存的細(xì)胞可W用煙酷胺核巧或其鹽處理。運(yùn) 些細(xì)胞可W在懸浮液(例如，血細(xì)胞、血清、生物生長(zhǎng)介質(zhì)等)或在組織或器官中。例如，出于 輸血目的，從個(gè)體收集的血液可W用煙酷胺核巧或其鹽處理，W使血細(xì)胞保存較長(zhǎng)時(shí)間段。 另外，出于司法目的所使用的血液也可W使用煙酷胺核巧或其鹽保存。
[0029] 可W用煙酷胺核巧或其鹽進(jìn)行保護(hù)或處理W延長(zhǎng)它們的壽命或抵抗調(diào)亡的特定 細(xì)胞包括皮膚細(xì)胞諸如角質(zhì)細(xì)胞、黑素細(xì)胞、真皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、樹突（朗格漢斯)細(xì)胞、基 底細(xì)胞、鱗狀細(xì)胞、干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、毛囊等等。
[0030] 可W進(jìn)行處理W延長(zhǎng)它們的壽命或抵抗調(diào)亡的其他細(xì)胞包括用于生產(chǎn)、消耗或食 物的細(xì)胞，例如，來(lái)自非人類哺乳動(dòng)物的細(xì)胞(諸如肉)或植物細(xì)胞(諸如蔬菜）。
[0031] 煙酷胺核巧(NR)是具有W下化學(xué)式(I)的化晚化合物：
[0032] 巧）
[0033] 化學(xué)式（I)的化合物可W包括鹽平衡離子，諸如但不限于面化物(包括氯化物、漠 化物、艦化物等）、甲酸鹽、乙酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸鹽、巧樣酸鹽、氨基甲酸鹽、 甲酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳酸鹽、甲基漠化物、甲基硫酸鹽、硝酸鹽、憐酸鹽、二憐酸鹽、班巧酸 鹽、硫酸鹽、=氣乙酸鹽、苯橫酸鹽、甲苯橫酸鹽、=氣甲橫酸鹽、甲橫酸鹽等。參考最新版的 雷明頓藥物科學(xué)（Remington' S曲armaceutical Sciences)(馬克出版公司，伊斯頓，PA (Mack Publishing Co.,Easton,PA))、S.貝爾熱（S.Berge)等人藥物科學(xué)雜志 (J.Pharmaceut. Sci.)(1977)66:1-19( W及其中引用的參考文獻(xiàn)）的論文、W及L.D.賓利 化.D.Bighley)等人的書籍章節(jié)"藥物的鹽形式和吸收（Salt Forms of Drugs and Abso巧tion)"，在制藥技術(shù)百科全書化ncyclopedia of Pharmaceutical Technology)中， J.斯沃布里克(J.Swarbrick)編著，第13卷，第453-499頁(yè)(紐約：馬塞爾德克爾公司(Marcel Dekker，Inc .)，1996) (W及其中引用的參考文獻(xiàn)）；所有文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0034] 煙酷胺核巧(NR)作為氯化物鹽WNIAGEN?從化romaDex公司（歐文，加利福尼亞） (ChromaDex Inc. (Irvine,California))商貝勾獲得。
[0035] 用于局部應(yīng)用、單獨(dú)或與NR組合的其他可用化合物包括煙酸核巧(NAR)、1,4-二氨 還原型NR或NAR(即還原型煙酷胺核巧(NRH)或還原型煙酸核巧(NARH))等。
[0036] 煙酷胺核巧或其鹽還可W在哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲或微生物的發(fā)育和生長(zhǎng)階段應(yīng) 用，W便例如改變、延遲或加速發(fā)育和/或生長(zhǎng)過(guò)程。
[0037] 已發(fā)現(xiàn)一種用于通過(guò)使用有效量的NR來(lái)抑制或預(yù)防由紫外(UV)光引起的皮膚DNA 損傷，或抑制或預(yù)防氧化性損傷的化學(xué)保護(hù)性方法。描述適用于給予個(gè)體W便預(yù)防皮膚內(nèi) 的隨后UV介導(dǎo)的DNA損傷或氧化性損傷的含有蝶巧的藥物和營(yíng)養(yǎng)組合物。
[0038] 在另一個(gè)實(shí)施例中，煙酷胺核巧或其鹽可W用于處理適用于移植或細(xì)胞療法的細(xì) 胞，包括例如，固體組織移植、器官移植、細(xì)胞懸浮液、干細(xì)胞、骨髓細(xì)胞等。運(yùn)些細(xì)胞或組織 可W是自體移植、異體移植、同基因移植或異種移植。在給予/植入受試者之前、在給予/植 入受試者同時(shí)和/或在給予/植入受試者之后，可W用煙酷胺核巧或其鹽處理細(xì)胞或組織。 可W在細(xì)胞從供體個(gè)體去除之前處理，在細(xì)胞或組織從供體個(gè)體去除之后離體處理或者在 植入受體之后處理運(yùn)些細(xì)胞或組織。例如，供體或受體個(gè)體可W用煙酷胺核巧或其鹽全身 地處理，或可W具有用煙酷胺核巧或其鹽局部處理的細(xì)胞/組織亞型。在某些實(shí)施例中，細(xì) 胞或組織(或供體/受體個(gè)體)可W用一種或多種適用于延長(zhǎng)移植物存活的其他治療劑例如 像免疫抑制劑、細(xì)胞因子、血管生成因子等處理。
[0039] 還在其他實(shí)施例中，細(xì)胞可W用增加體內(nèi)NAD+水平的煙酷胺核巧或其鹽處理，例 如W增加它們的壽命或預(yù)防細(xì)胞調(diào)亡。例如，在一個(gè)主要實(shí)施例中，皮膚可W通過(guò)用增加細(xì) 胞內(nèi)NAD+水平的煙酷胺核巧或其鹽處理皮膚或表皮細(xì)胞來(lái)防止衰老(例如，產(chǎn)生皺紋、彈性 損失等）。在一個(gè)示例性實(shí)施例中，使皮膚與包含增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的煙酷胺核巧或其鹽 的藥物或化妝品組合物接觸?？蒞根據(jù)在此描述的方法治療的示例性皮膚病痛或皮膚病狀 包括與炎癥、太陽(yáng)損傷或自然衰老相關(guān)或由其引起的病癥或疾病。例如，發(fā)現(xiàn)運(yùn)些組合物在 預(yù)防或治療W下疾病中的實(shí)用性:接觸性皮炎(包括刺激性接觸性皮炎和過(guò)敏性接觸性皮 炎）、特應(yīng)性皮炎(也稱為過(guò)敏性濕疹）、光化性角化病、角質(zhì)化病癥(包括濕疹）、大瘤性表皮 松解疾病(包括天瘤瘡）、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、紅斑(包括多形性紅斑和結(jié)節(jié)性紅斑）、 由太陽(yáng)或其他光源引起的損傷、盤狀紅斑狼瘡、皮肌炎、牛皮癖、皮膚癌W及自然衰老的影 響。在另一個(gè)實(shí)施例中，增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的煙酷胺核巧或其鹽可W用于治療傷口和/或 燒傷W促進(jìn)愈合，包括例如一度燒傷、二度燒傷或=度燒傷和/或熱燒傷、化學(xué)燒傷或電燒 傷。在有效于引起所需結(jié)果的給藥方案背景內(nèi)，運(yùn)些制劑可W作為軟膏、乳液、霜?jiǎng)?、微?劑、凝膠、溶液等向皮膚或粘膜組織局部給予，如在此進(jìn)一步描述的。
[0040] 包含增加細(xì)胞內(nèi)NAD+水平的一種或多種煙酷胺核巧或其鹽的局部制劑也可用作 預(yù)防性組合物，例如化學(xué)預(yù)防性組合物。當(dāng)在化學(xué)預(yù)防性方法中使用時(shí)，在任何可見病狀之 前處理特定個(gè)體的敏感皮膚。
[0041] 局部制劑可W包括能夠增加體內(nèi)NAD+的其他NAD+前體或化合物，諸如但不限于煙 酷胺和煙酸。
[0042] 基于局部組合物的總重量，該組合物中NR或其鹽的可用范圍包括按重量計(jì)從約 0.001%至約50%?；诮M合物的總重量，另一個(gè)適合的NR范圍是按重量計(jì)從約0.1%至約 10%?；诮M合物的總重量，另一個(gè)適合的NR范圍是按重量計(jì)從約0.5%至約5%。
[0043] 考慮NR的口服制劑。在人類個(gè)體中，NR的有用治療劑量范圍可W是(但不局限于） 從約Img至約SOOOmg。另一個(gè)適合的劑量范圍是從約5mg至約500mg。另一個(gè)適合的劑量范圍 是從約50mg至約500mg"NR可W配制為口服或局部用的藥物或營(yíng)養(yǎng)組合物，分別包括藥學(xué)上 可接受的載體或營(yíng)養(yǎng)學(xué)上可接受的載體。在含有NR的藥物組合物的一個(gè)實(shí)施例中，基于組 合物的總重量，適合NR水平范圍可W是從按重量計(jì)約0.01%至按重量計(jì)約50%。在包含NR 的藥物組合物的另一個(gè)實(shí)施例中，基于組合物的總重量，適合的NR水平范圍可W是從按重 量計(jì)約0.1 %至按重量計(jì)約10%。
[0044] 人類皮膚包括頂部表皮層(表皮），它位于下面的真皮層(真皮)上。表皮主要由角 質(zhì)化細(xì)胞組成，角質(zhì)化細(xì)胞在底部發(fā)育，朝向頂部移動(dòng)，并且不斷地更換。隨著老的死細(xì)胞 脫落，它們被更換，所W運(yùn)一層不斷自我更新。表皮還包含黑素細(xì)胞，一般位于該層的底部 附近，它產(chǎn)生黑色素，有助于皮膚顏色，并且還提供UV-保護(hù)。表皮還包含參與免疫系統(tǒng)的樹 突狀細(xì)胞(朗格漢斯細(xì)胞），W及在該層底部發(fā)現(xiàn)的底層細(xì)胞。表皮還包括鱗狀細(xì)胞。表皮層 和真皮層還包含干細(xì)胞和毛囊。在哺乳動(dòng)物中，除了其他組織外，黑素細(xì)胞還分布在腦、眼 睛、耳朵、W及屯、臟中。
[0045] 如所述的皮膚細(xì)胞還易于發(fā)生UV光誘導(dǎo)的損傷、DNA損傷、W及癌發(fā)生。此外，正常 衰老導(dǎo)致形成皺紋、老年斑、皮膚彈性損失W及其他衰老體征，運(yùn)些其他體征包括淺表皺 紋、粗深皺紋、毛孔粗大、光損傷、鱗屑、剝落、干燥、皮膚下垂、眼睛周圍的皮膚浮腫、面頰周 圍的皮膚浮腫、皮膚緊致性損失、皮膚緊密度損失、屏障功能損失、皮膚從變形的回復(fù)力損 失、稱色、斑點(diǎn)、暗黃、色素沉著過(guò)度、角化病、角質(zhì)化過(guò)度、彈性組織變性或膠原分解W及脂 肪團(tuán)或其組合。
[0046] 因此，在一個(gè)實(shí)施例中，NR或其鹽可W用于如下：改善衰老的體征，運(yùn)些衰老的體 征包括淺表皺紋、粗深皺紋、毛孔粗大、老年斑、光損傷、鱗屑、剝落、干燥、皮膚下垂、眼睛周 圍的皮膚浮腫、面頰周圍的皮膚浮腫、皮膚彈性的損失、皮膚緊致性損失、皮膚緊密度損失、 屏障功能損失、皮膚從變形的回復(fù)力損失、稱色、斑點(diǎn)、暗黃、色素沉著過(guò)度、角化病、角質(zhì)化 過(guò)度、彈性組織變性或膠原分解W及脂肪團(tuán)或其組合。
[0047] NR或其鹽可W與一種或多種巧類組合使用。一種示例性的巧類化合物是蝶巧(3， 5-二甲氧基-少-徑基-反式-巧），它是一種可口服生物利用的化合物，在血液中的半衰期 ti/2是約105分鐘。蝶巧是一種用于與煙酷胺核巧或其鹽組合治療皮膚病狀的可用化合物。 [004引任選地，NR或其鹽可W與蝶巧組合，進(jìn)一步與姜黃素組合使用。
[0049] 任選地，NR或其鹽可W與一種或多種化合物組合使用，運(yùn)種或運(yùn)些化合物包括膚、 視黃醇、水楊酸、過(guò)氧化苯甲酯、維生素 ca-抗壞血酸）、花青素或其組合。一種可用的花青 素是花青素-3-糖巧rC3G")。
[0050] 本發(fā)明的化妝品或藥用化妝品組合物可W與一種營(yíng)養(yǎng)上可接受的載體組合給予。 在此類配制品中可W包括從按重量計(jì)1%至按重量計(jì)99%、或可替代地按重量計(jì)0.1%至按 重量計(jì)99.9%的活性成分。"營(yíng)養(yǎng)上可接受的載體"是指與該配制品中的其他成分兼容并且 對(duì)使用者無(wú)害的任何載體、稀釋劑或賦形劑。有用的賦形劑包括微晶纖維素、硬脂酸儀、硬 脂酸巧、任何可接受的糖（例如，甘露醇、木糖醇），并且針對(duì)美容使用，基于油的賦形劑 (oil-base)是優(yōu)選的。
[0051] 本發(fā)明的運(yùn)些局部藥物組合物可W與一種藥學(xué)上可接受的載體組合給予。在此類 配制品中可W包括從按重量計(jì)1%至按重量計(jì)99%、或可替代地按重量計(jì)0.1%至按重量計(jì) 99.9%的活性成分。"藥學(xué)上可接受的載體"是指與該配制品中的其他成分兼容并且對(duì)使用 者無(wú)害的任何載體、稀釋劑或賦形劑。
[0052] 根據(jù)某些實(shí)施例，在此公開的化妝品和/或局部藥物組合物可W軟膏、霜?jiǎng)?、乳液?凝膠或其他經(jīng)皮遞送系統(tǒng)的形式提供，如在L. V.艾倫，化.（L. V.AlIen，Jr.)等人，安塞爾的 藥物劑型和藥物傳遞系統(tǒng)（Ansel，S Pharmaceutical Dosage F'orms and Drug Delivery Systems)第9版，第272-293頁(yè)（賓夕法尼亞州的費(fèi)城:利平科特威廉斯W及威爾金斯出版公 司，2011 (F*hiladel地ia,Pennsylvania = Lippincott Williams&Wnkins,2011))中所描述 的，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合在此。
[0053] 如在此使用的軟膏是指半固體制劑，該半固體制劑包括具有結(jié)合或稠合（即與制 劑的其他組分烙融在一起并且在持續(xù)攬拌下冷卻W形成凝結(jié)制劑)于其中的一種或多種活 性成分的軟膏基質(zhì)。該軟膏基質(zhì)可W是W下形式：油脂性基質(zhì)或控基質(zhì)（例如，凡±林或凡 ±林/蠟組合）；吸收基質(zhì)，該吸收基質(zhì)允許水溶液滲入從而導(dǎo)致形成油包水乳液(例如，親 水性凡±林)或是允許滲入額外量的水溶液（例如，羊毛脂）的油包水乳液；水可去除的基 質(zhì)，該水可去除的基質(zhì)為可W用水或水溶液(例如，親水性軟膏，USP)稀釋的水包油乳液;或 水溶性基質(zhì)，該水溶性基質(zhì)不包含油脂性組分(例如，聚乙二醇(PEG)配制物，該配制物將具 有低于600的平均分子量的PEG與具有高于1000的平均分子量的一種PEG結(jié)合)等等。
[0054] 如在此使用的霜?jiǎng)┦侵赴芙庥诨蚍稚⒂谟桶橐夯?水-包油乳液中或在 另一種類型的可水洗基質(zhì)中的一種或多種活性劑或藥劑的半固體制劑。大體上，霜?jiǎng)┡c軟 膏的區(qū)別在于它們是否容易應(yīng)用/擴(kuò)散至表面諸如皮膚上W及它們是否容易從處理表面去 除。
[0055] 如在此使用的洗液是指固體材料在含水溶媒中的懸浮液。大體上，乳液具有非油 膩特性并且與軟膏、霜?jiǎng)￤及凝膠相比在大面積皮膚上具有增加的擴(kuò)散性。
[0056] 如在此使用的凝膠是指半固體系統(tǒng)，該半固體系統(tǒng)包括小分子和/或大分子在含 水液體溶媒中的分散，該含水液體溶媒通過(guò)添加膠凝劑形成凍狀。適合的膠凝劑包括但不 限于合成高分子(例如，卡波姆聚合物）、纖維素衍生物(例如，簇甲基纖維素和/或徑丙基甲 基纖維素）W及天然膠(例如，黃著膠、卡角叉菜膠等）。凝膠制劑可W是其中活性成分或藥 物成分均勻地分散于全部液體溶媒而無(wú)可見邊界的單相凝膠形式或其中絮凝劑或活性成 分或藥物成分的明顯小顆粒分散于液體溶媒中的兩相凝膠形式。
[0057] 經(jīng)皮制劑可由軟膏、霜?jiǎng)┗蚰z形成，該軟膏、霜?jiǎng)┗蚰z已與滲透增強(qiáng)劑結(jié)合并 且被設(shè)計(jì)為全身性遞送活性成分或藥物成分。滲透增強(qiáng)劑包括例如二甲亞諷、乙醇、丙二 醇、甘油、PEG、尿素、二甲基乙酷胺、十二烷基硫酸鋼、泊咯沙姆、司盤(Span)、吐溫(Tween)、 卵憐脂和/或祗締等。
[0058] 用作化妝品和/或局部藥物組合物的其他適合的半固體形式包括糊劑（制劑含有 較大比例的固體材料，使得它們比軟膏更硬)和甘油明膠(塑性團(tuán)塊含有明膠、甘油、水W及 活性成分或藥物成分）。
[0059] 在其他實(shí)施例中，局部組合物和/或化妝品組合物可根據(jù)劑型制備，如藥物劑型的 樣品審1]備（8曰111口16 Preparation of Pharmaceutical Dosage Forms)，B.尼克森 (B.Nickerson)編輯(紐約：施普林格出版社（Springer) ,2011)中所述的，該文獻(xiàn)通過(guò)引用 結(jié)合在此。
[0060] 例如，在人類患者中，蝶巧可W按從約IOmg至約250mg的每日局部劑量提供。另一 個(gè)適合的局部劑量范圍是每日從約50mg至約150mg。另一個(gè)適合的局部劑量范圍是每日從 約50mg至約1 OOmg。一個(gè)特別適合的劑量是每日給予約1 OOmg。
[0061 ]給藥途徑
[0062] 運(yùn)些化合物可W通過(guò)任何途徑來(lái)給藥，包括但不局限于，口服、舌下、口腔、眼睛、 肺部、直腸、W及腸胃外給藥，或作為口腔噴霧或鼻腔噴霧(例如噴霧狀的蒸汽、液滴或固體 微粒的吸入）。腸胃外給藥包括例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、膀脫內(nèi)（例 如，向膀脫）、真皮內(nèi)、經(jīng)皮、局部、或皮下給藥。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還考慮將NRW控制的配制 品形式滴注至患者的體內(nèi)，其中該藥物的全身性或局部釋放在稍晚的時(shí)間發(fā)生。例如，該藥 物可W被定位于一個(gè)儲(chǔ)存處用于至該循環(huán)的緩釋。
[0063] 可W與W下實(shí)例結(jié)合來(lái)進(jìn)一步理解W上描述的方法。在每個(gè)運(yùn)些實(shí)例中，考慮可 W使用NR或其鹽。
[0064] 實(shí)例 1
[0065] 在一個(gè)實(shí)施例中，NR被用作用于經(jīng)皮遞送化合物和/或藥物產(chǎn)品的溶媒。
[0066] 在另一個(gè)實(shí)施例中，NR用于如下：改善衰老的體征，運(yùn)些衰老的體征包括淺表皺 紋、粗深皺紋、毛孔粗大、老年斑、光損傷、鱗屑、剝落、干燥、皮膚下垂、眼睛周圍的皮膚浮 月中、面頰周圍的皮膚浮腫、皮膚彈性的損失、皮膚緊致性損失、皮膚緊密度損失、屏障功能損 失、皮膚從變形的回復(fù)力損失、稱色、斑點(diǎn)、暗黃、色素沉著過(guò)度、角化病、角質(zhì)化過(guò)度、彈性 組織變性或膠原分解W及脂肪團(tuán)或其組合。
[0067] 在另一個(gè)實(shí)施例中，NR被用在用于治療皮膚損傷的方法中，該皮膚損傷包括紅斑 瘦瘡、皮炎、牛皮癖、瘦瘡W及UV誘導(dǎo)的損傷(包括例如，曬傷)或其組合。
[0068] 在另一個(gè)實(shí)施例中，NR可W用于減少氧化性應(yīng)激的影響W幫助阻止衰老的體征。
[0069] 實(shí)例2
[0070] 在一個(gè)實(shí)施例中，NR與蝶巧組合，任選地進(jìn)一步與姜黃素組合使用。
[0071] 在該實(shí)例中，含有NR的組合起到UV誘導(dǎo)的炎癥性調(diào)節(jié)劑的作用，從而影響衰老的 體征和由例如UV/福射引起的損害，例如包括皮膚增亮、炎癥W及太陽(yáng)灼傷發(fā)紅。
[0072] 此外，在另一個(gè)實(shí)施例中，含有NR的組合可W用于治療與W下各項(xiàng)相關(guān)的發(fā)紅和 炎癥:瘦瘡、紅斑瘦瘡、牛皮癖、福射皮膚病W及傷口愈合。
[0073] 在另一個(gè)實(shí)施例中，含有NR的組合用于如下：改善衰老的體征，運(yùn)些衰老的體征包 括淺表皺紋、粗深皺紋、毛孔粗大、老年斑、光損傷、鱗屑、剝落、干燥、皮膚下垂、眼睛周圍的 皮膚浮腫、面頰周圍的皮膚浮腫、皮膚彈性的損失、皮膚緊致性損失、皮膚緊密度損失、屏障 功能損失、皮膚從變形的回復(fù)力損失、稱色、斑點(diǎn)、暗黃、色素沉著過(guò)度、角化病、角質(zhì)化過(guò) 度、W及彈性組織變性或膠原分解或其組合。
[0074] 在另一個(gè)實(shí)施例中，含有NR的組合用于如下:修復(fù)皮膚中的DNA、改善皮膚中的DNA 修復(fù)和/或強(qiáng)化改善DNA修復(fù)過(guò)程。
[0075] 實(shí)例3
[0076] 在一個(gè)實(shí)施例中，NR可W與一種或多種巧類（即巧化合物)組合使用。示例性巧類 如在約瑟夫(Joseph)等人的US2009/0069444中所討論的，雖然用于不同的用途(通過(guò)引用 結(jié)合在此）。
[0077] 在該實(shí)例中，含有NR與一種或多種巧類的組合起到UV誘導(dǎo)的炎癥性調(diào)節(jié)劑的作 用，從而影響衰老的體征和由UV/福射引起的損害，例如包括皮膚增亮、炎癥、瘦瘡W及紅斑 瘦瘡。
[0078] 在另一個(gè)實(shí)施例中，含有NR與一種或多種巧類的組合用于如下:改善衰老的體征， 運(yùn)些衰老的體征包括淺表皺紋、粗深皺紋、毛孔粗大、老年斑、光損傷、鱗屑、剝落、干燥、皮 膚下垂、眼睛周圍的皮膚浮腫、面頰周圍的皮膚浮腫、皮膚彈性的損失、皮膚緊致性損失、皮 膚緊密度損失、屏障功能損失、皮膚從變形的回復(fù)力損失、稱色、斑點(diǎn)、暗黃、色素沉著過(guò)度、 角化病、角質(zhì)化過(guò)度、W及彈性組織變性或膠原分解或其組合。
[0079] 在另一個(gè)實(shí)施例中，含有NR與一種或多種巧類的組合用于如下：修復(fù)皮膚中的 DNA、改善皮膚中的DNA修復(fù)和/或強(qiáng)化改善DNA修復(fù)過(guò)程。
[0080] 實(shí)例4
[0081] 在一個(gè)實(shí)施例中，NR與一種或多種膚組合使用，W改善化合物和/或藥物產(chǎn)品或制 劑的經(jīng)皮遞送。
[0082] 實(shí)例5
[0083] 在一個(gè)實(shí)施例中，NR與視黃醇、水楊酸、過(guò)氧化苯甲酯或維生素 Ca-抗壞血酸）中 的一種或多種組合使用，用于治療選自瘦瘡、紅斑瘦瘡、角化病、牛皮癖、皮炎等的皮膚病 狀。
[0084] 在W下方案中，NR被用作氯化物鹽(NIAGEN?)。
[0085] 實(shí)例A
[0086] NR治療預(yù)防人類皮膚細(xì)胞中的氧化性損傷。
[0087] 基于培養(yǎng)建議，使A431人類表皮細(xì)胞(ATCC#CRL1555)在T75燒瓶中補(bǔ)充有10%FBS 和1 % Pens化ep (青鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，直至達(dá)到的匯 合度>80%。將細(xì)胞用0.25 %膜蛋白酶邸TA溶液膜蛋白酶化2-3分鐘，直至移去細(xì)胞。將細(xì)胞 Wl :3的比率進(jìn)行傳代培養(yǎng)，W用于進(jìn)一步生長(zhǎng)并且擴(kuò)大，從而用于分析。使細(xì)胞膜蛋白酶 化并且計(jì)數(shù)為5，000或15，000個(gè)細(xì)胞的密度并且接種在96孔透明底部黑色板中的I(K)化培 養(yǎng)基/孔中。使處于運(yùn)些板周邊的外孔未接種并且反而用培養(yǎng)基填充，W減少解育過(guò)程中的 邊緣效應(yīng)。將板在37 °C/5 % C〇2下在濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中解育過(guò)夜，W證實(shí)細(xì)胞被附著。在預(yù)處理 24h(無(wú)過(guò)氧化氨）下或者連同ImM過(guò)氧化氨一起在培養(yǎng)基中W指示的最終測(cè)定濃度添加煙 酷胺核巧氯化物(NR氯化物），W在化補(bǔ)充培養(yǎng)基的情況下或在使用1%FBS的生長(zhǎng)同步條件 下在37°C/5%C02下在濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中解育20h。各濃度W-式六份進(jìn)行測(cè)試。每次測(cè)定中保 持適當(dāng)對(duì)照:無(wú)化合物和過(guò)氧化氨的細(xì)胞(無(wú)細(xì)胞毒性；陰性對(duì)照）、無(wú)化合物但存在ImM過(guò) 氧化氨的細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照）、僅具有阿爾瑪藍(lán)(alamar bIue)的孔(空白）。
[0088] 對(duì)細(xì)胞存活率作圖并且數(shù)據(jù)表示為在給定測(cè)定條件下ImM此化相對(duì)于陰性(未處 理的對(duì)照)細(xì)胞的細(xì)胞毒性百分比或者在測(cè)試化合物存在下相對(duì)于陽(yáng)性（ImM肥02)對(duì)照計(jì) 算的細(xì)胞保護(hù)百分比。
[0089] 對(duì)于生長(zhǎng)同步樣品，陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的比較顯示出化處理后75%的細(xì)胞毒性， 而用NR氯化物Wo. 2mM、ImMW及SmM進(jìn)行處理顯示與對(duì)照相比分別為2%、15% W及38%的 細(xì)胞保護(hù)(參見圖1)。
[0090] 對(duì)于正常生長(zhǎng)樣品，陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的比較顯示出化處理后53%的細(xì)胞毒性， 而用NR氯化物W0.04mM、0.2mMW及ImM進(jìn)行處理顯示與對(duì)照相比分別為-1%、8%W及23% 的細(xì)胞保護(hù)(參見圖2)。
[0091] 總之，觀察到NR的存在減少10%-40%氧化性損傷介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，甚至在生長(zhǎng)停 滯條件下也有減少。還預(yù)期用NR氯化物處理將有效減少至少約10%或更大的氧化性損傷介 導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
[0092] 實(shí)例B
[0093] NR治療預(yù)防人類皮膚細(xì)胞中的有害UV-C介導(dǎo)的損傷。
[0094] 將A431細(xì)胞系W4xl05個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度接種在2ml含有10%FBS的培養(yǎng)基的6 孔板中。將未處理的細(xì)胞作為對(duì)照或者將細(xì)胞用不同濃度的NR氯化物培養(yǎng)基(5mM和ImM)在 含有5%C02的完全濕潤(rùn)氣氛下在37°C下處理化。解育后，用PBS替換培養(yǎng)基并且將細(xì)胞暴露 至10J/VUVC福射。UVC暴露之后，立即收集板連同相應(yīng)對(duì)照（陰性對(duì)照是無(wú) UV-C暴露的細(xì) 胞，而陽(yáng)性對(duì)照是在UV-C暴露下的未處理細(xì)胞）。提取每種條件下的細(xì)胞DNA并且通過(guò) Nano化OP定量。然后將DNA樣品WlOO納克/孔的濃度添加于化ISA板中并且根據(jù)制造商的方 案使用CPD-DNA評(píng)估試劑盒(OxiSelect?，細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室公司（Cell Biolabs，Inc.)，美國(guó) 圣地亞哥(San D i ego, USA))評(píng)估DNA樣品中的環(huán)下燒喀晚二聚體(CPD)的量。
[0095] 將UV誘導(dǎo)的DNA損傷W環(huán)下燒喀晚二聚體(CPD)水平反映：1.2iig/ml DNA對(duì)照；+ ImM NR氯化物（-32%對(duì)比對(duì)照）；巧mM NR氯化物（-34%對(duì)比對(duì)照）；2.1iig/ml DNA對(duì)照；+ ImM NR氯化物(-41%對(duì)比對(duì)照）；+5mM NR氯化物(-50%對(duì)比對(duì)照）；參見圖3。
[0096] 總之，觀察到與未處理的U V暴露的對(duì)照相比NR有效于減少3 2 %至5 0 %范圍內(nèi)的 era的量。還預(yù)期用NR氯化物進(jìn)行處理將有效減少至少約10%或更大的era水平。
[0097] 實(shí)例Cl (對(duì)照實(shí)驗(yàn)）
[0098] NR處理促進(jìn)小鼠皮膚細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。
[0099] 從ATCC(#CRkl658?)獲得NIH 3T3成纖維細(xì)胞并且將運(yùn)些成纖維細(xì)胞在含有5% 〇)2的完全濕潤(rùn)氛圍下在37°(：下在補(bǔ)充有10%胎兒牛血清巧85)、41111心谷氨酷胺、1%青霉 素/鏈霉素的杜爾貝科修飾的伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM)中培養(yǎng)。關(guān)于實(shí)驗(yàn)，從具有膜蛋白酶/EDTA的亞匯合單層收集細(xì)胞。使用臺(tái)吩藍(lán)染料 排阻染色法使得細(xì)胞存活率高達(dá)95 %。在含有I %FBS的DMBl培養(yǎng)基中使用來(lái)自第4-7代的 細(xì)胞進(jìn)行該研究。將未處理的細(xì)胞（1%FBS)用作陰性對(duì)照。研究煙酷胺核巧氯化物(NR氯化 物)對(duì)NIH 3T3成纖維細(xì)胞中的傷口閉合的影響。
[0100] 通過(guò)細(xì)胞活性檢測(cè)系統(tǒng)（cell titer blue)(普洛麥格(Promega))測(cè)定細(xì)胞存活 率，通過(guò)切toSelect?傷口愈合分析試劑盒(細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室公司，美國(guó)圣地亞哥)測(cè)定傷口 閉合。在S個(gè)獨(dú)立的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行所有的條件。簡(jiǎn)言之，將含有10 % FBS的DMEM中的NI H 3T3成纖維細(xì)胞(2.5X 105/50化l)接種至每孔含有處理的插入物的24孔組織培養(yǎng)板中24h， 運(yùn)些插入物具有在相同取向?qū)R的傷口區(qū)域，W使細(xì)胞粘附并且達(dá)到約70 %-80 %的匯合。 在2地后，去除孔中的插入物并且小屯、地吸出培養(yǎng)基而不攬動(dòng)細(xì)胞，接著用測(cè)試培養(yǎng)基(含 有1%FBS的DMEM)洗涂孔W去除死細(xì)胞和碎片。洗涂后，將細(xì)胞用不同濃度的測(cè)試化合物在 含有1 %FBS的培養(yǎng)基中處理另外24小時(shí)，同時(shí)根據(jù)制造商說(shuō)明書通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下目測(cè) 檢查來(lái)研究NIH3T3細(xì)胞在傷口區(qū)域中的遷移。拍攝集中于傷口區(qū)域中屯、的代表性圖像。使 用"Image J"軟件分析傷口閉合的顯微鏡成像。將測(cè)試化合物對(duì)傷口閉合的影響與在"零分 鐘（Zero min.r并且在化合物處理后24h下的1%FBS對(duì)照孔進(jìn)行比較。將具有5%FBS的 DMBl用作陽(yáng)性對(duì)照。將無(wú)形成的傷口面積(匯合面積）的孔中的細(xì)胞密度用作100 %傷口閉 合。除顯微鏡觀察之外，使用"Image J"軟件分析數(shù)據(jù)W確定限定傷口區(qū)域的總表面積。通 過(guò)從"0"小時(shí)處的傷口總表面積減去24小時(shí)后的表面積來(lái)計(jì)算傷口區(qū)域中的遷移細(xì)胞的表 面積。將閉合百分比（％)計(jì)算為遷移細(xì)胞表面積與總表面積的比率，而間隙閉合（％)通過(guò) 從處理的測(cè)試樣品減去對(duì)照的未處理樣品存在下的閉合百分比確定。
[0101] 觀察到分別如圖5和圖4所示，24小時(shí)解育后，間隙閉合在5 %FBS存在下是51 %，相 比之下在1%FBS存在下是20%。
[0102] 實(shí)例C2(NR劑量響應(yīng)）
[0103] NR處理促進(jìn)小鼠皮膚細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。
[0104] 使用如實(shí)例Cl所述相同的實(shí)驗(yàn)條件，用切toSelect?傷口愈合分析試劑盒研究培 養(yǎng)基中的煙酷胺核巧氯化物(ImM和0.2mM)對(duì)傷口閉合的影響。
[010引觀察到在24小時(shí)解育后，間隙閉合在ImM NR氯化物+1%FBS存在下是46%，相比之 下在僅1%FBS存在下是20% (實(shí)例Cl);參見圖6。因此，在NR(1%FBS)存在下指示細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 的間隙閉合可與實(shí)例C1中作為對(duì)照的5 %FBS做比較。此外，在0.2mM NR(+1 % FBS)存在下觀 察到13 %間隙閉合，運(yùn)表明劑量響應(yīng)影響。
[0106] 哺乳動(dòng)物組織傷口經(jīng)歷復(fù)雜而有序的一系列事件，W修復(fù)組織。該修復(fù)的兩個(gè)關(guān) 鍵因素是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖。在此提供的數(shù)據(jù)清晰地表明NR促進(jìn)哺乳動(dòng)物皮膚細(xì)胞到"傷口 " 中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖。
[0107] 實(shí)例D
[0108] NR治療預(yù)防人類皮膚細(xì)胞中的有害UV介導(dǎo)的損傷。
[0109] 在該實(shí)例中，煙酷胺核巧(NR)用于幫助維持皮膚的健康屏障功能。屏障功能是皮 膚最重要的功能。皮膚是人類身體抵抗包括太陽(yáng)紫外(UV)福射在內(nèi)的環(huán)境暴露的第一且最 好的防衛(wèi)。對(duì)UV光的暴露是許多皮膚病癥發(fā)展的關(guān)鍵因素。對(duì)皮膚的中屯、部分UV介導(dǎo)的損 傷是屏障功能的損失。
[0110] 預(yù)期W在此描述的治療劑量應(yīng)用局部NR能防止UV介導(dǎo)的屏障功能損失。其中N時(shí)尋 防止UV介導(dǎo)的皮膚屏障功能損失的一種方式是通過(guò)防止已知UV介導(dǎo)的經(jīng)皮水分流失 (TEWL)增加。此外，預(yù)期經(jīng)口給予M將有效維持皮膚的健康屏障功能。
[0111] 例如，皮膚屏障功能不良可W通過(guò)測(cè)量經(jīng)皮水分流失(TEWL)進(jìn)行直接評(píng)估，該經(jīng) 皮水分流失是皮膚水合的測(cè)量(奧己，C.等人，"膠原水解物吸收改善無(wú)毛小鼠由UVB福射誘 導(dǎo)的表皮屏障功能和皮膚彈性的損失"，光照皮膚病學(xué)光照免疫學(xué)光照醫(yī)學(xué)(2013)29:204-11; W及其中引用的參考文獻(xiàn)；（江，S.J.等人，"紫外B誘導(dǎo)的皮膚屏障和表皮巧梯度的改 變"，實(shí)驗(yàn)皮膚病學(xué)(2007)16:985-992); W及原武，A.等人/'UVB誘導(dǎo)的滲透屏障功能的改 變:對(duì)表皮過(guò)度增殖和胸腺細(xì)胞介導(dǎo)的響應(yīng)的作用"皮膚病學(xué)研究期刊（1997) 108 : 769-775) O
[0112] 在描述目前要求保護(hù)的發(fā)明的上下文中（尤其是權(quán)利要求的上下文中），術(shù)語(yǔ)"一 個(gè)/一種(a/an)"、"該(the)" W及相似指代詞的使用應(yīng)解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非在 此另外指示或明顯地與上下文矛盾。在此敘述值的范圍僅旨在用作個(gè)別參考該范圍內(nèi)的每 個(gè)單獨(dú)數(shù)值的簡(jiǎn)寫方法，除非在此另外指示，并且將每個(gè)單獨(dú)數(shù)值結(jié)合在說(shuō)明書中，就好像 它在此個(gè)別引用一樣。術(shù)語(yǔ)"約"的使用旨在描述高于或低于該范圍中的所述值大約±10% 的值;在其他實(shí)施例中，運(yùn)些值可W在高于或低于該范圍中的所述值大約±5%的值的范圍 內(nèi)；在其他實(shí)施例中，該值可在高于或低于該范圍中的所述值大約±2%的值的范圍內(nèi)；在 其他實(shí)施例中，該值可在高于或低于該范圍中的所述值大約± 1 %的值的范圍內(nèi)。上述范圍 旨在根據(jù)上下文確定，并且未隱含進(jìn)一步限制。在此描述的所有方法可W任何適合的順序 進(jìn)行，除非在此另外指示或明顯地與上下文矛盾。在此提供的任何和所有實(shí)例或示例性語(yǔ) 言（例如，"諸如"）的使用僅旨在更好地描述本發(fā)明并且不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，除非 另外指示。本說(shuō)明書中的任何語(yǔ)言均不應(yīng)解釋為指示任何未要求權(quán)利保護(hù)的特征作為實(shí)施 本發(fā)明的必要特征。
[0113] 盡管在上述說(shuō)明書中，已經(jīng)就本發(fā)明的某些實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行了描述，并且為了說(shuō) 明的目的已經(jīng)提出了許多細(xì)節(jié)，但是對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明易受另外 的實(shí)施例的影響并且在此所描述的某些細(xì)節(jié)可W在不偏離本發(fā)明的基本原則的情況下進(jìn) 行相當(dāng)?shù)母淖儭?br>[0114] 在此所引用的所有參考文件均通過(guò)引用整體結(jié)合。在不偏離本發(fā)明的精神或基本 屬性的情況下，可W將其體現(xiàn)為其他特定形式，并且因此應(yīng)該參考指明本發(fā)明的范圍的所 附權(quán)利要求書，而非參考上述說(shuō)明書。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于治療或預(yù)防個(gè)體皮膚中的UV介導(dǎo)的DNA損傷的化學(xué)保護(hù)性方法，包括向需 要此治療的該個(gè)體局部給予治療有效量的化合物煙酰胺核苷或其鹽。2. 如權(quán)利要求1所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中該個(gè)體是人。3. 如權(quán)利要求2所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中該煙酰胺核苷化合物或其鹽被提供在包 含一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物中。4. 如權(quán)利要求3所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中該煙酰胺核苷化合物是選自下組的一種 鹽，該組由以下各項(xiàng)組成:氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸鹽、乙酸鹽、抗壞血酸鹽、苯 甲酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨基甲酸鹽、甲酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳酸鹽、甲基溴化物、甲基硫 酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽以及三氟乙酸鹽。5. 如權(quán)利要求4所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中該煙酰胺核苷化合物是氯化物鹽。6. 如權(quán)利要求3所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中針對(duì)一個(gè)總劑量，煙酰胺核苷化合物或其 鹽的該治療有效量基于該組合物的總重量是在按重量計(jì)約0.01%至按重量計(jì)約50%的范 圍中。7. 如權(quán)利要求3所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中針對(duì)一個(gè)總劑量，煙酰胺核苷化合物或其 鹽的該治療有效量基于該組合物的總重量是在按重量計(jì)約0.1 %至按重量計(jì)約10%的范圍 中。8. 如權(quán)利要求1所述的化學(xué)保護(hù)性方法，其中由環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)或6-4光化產(chǎn) 物(64pp)的形成指示的DNA損傷降低大于約10%。9. 一種用于治療或預(yù)防個(gè)體皮膚中的氧化性損傷的細(xì)胞保護(hù)性方法，包括向需要此治 療的該個(gè)體局部給予治療有效量的化合物煙酰胺核苷或其鹽。10. 如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中該個(gè)體是人。11. 如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中該煙酰胺核苷化合物或其鹽被提供在 包含一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物中。12. 如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中該煙酰胺核苷化合物是選自下組的一 種鹽，該組由以下各項(xiàng)組成:氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸鹽、乙酸鹽、抗壞血酸鹽、 苯甲酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨基甲酸鹽、甲酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳酸鹽、甲基溴化物、甲基 硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽以及三氟乙酸鹽。13. 如權(quán)利要求12所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中該煙酰胺核苷化合物是氯化物鹽。14. 如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中針對(duì)一個(gè)總劑量，煙酰胺核苷化合物或 其鹽的該治療有效量基于該組合物的總重量是在按重量計(jì)約〇. 01 %至按重量計(jì)約50%的 范圍中。15. 如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中針對(duì)一個(gè)總劑量，煙酰胺核苷化合物或 其鹽的該治療有效量基于該組合物的總重量是在按重量計(jì)約0.1%至按重量計(jì)約10%的范 圍中。16. 如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞保護(hù)性方法，其中細(xì)胞死亡降低大于約10 %。17. -種用于治療或修復(fù)個(gè)體皮膚中的傷口的方法，包括向需要此治療的該個(gè)體局部 給予治療有效量的化合物煙酰胺核苷或其鹽，其中該皮膚中的皮膚細(xì)胞具有增加的運(yùn)動(dòng) 和/或增殖。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中該個(gè)體是人。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中該煙酰胺核苷化合物或其鹽被提供在包含一種藥 學(xué)上可接受的載體的組合物中。20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中該煙酰胺核苷化合物是選自下組的一種鹽，該組由 以下各項(xiàng)組成:氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、甲酸鹽、乙酸鹽、抗壞血酸鹽、苯甲酸鹽、碳 酸鹽、檸檬酸鹽、氨基甲酸鹽、甲酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳酸鹽、甲基溴化物、甲基硫酸鹽、硝酸 鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽以及三氟乙酸鹽。21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中該煙酰胺核苷化合物是氯化物鹽。22. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中針對(duì)一個(gè)總劑量，煙酰胺核苷化合物或其鹽的該治 療有效量基于該組合物的總重量是在按重量計(jì)約〇. 01 %至按重量計(jì)約50 %的范圍中。
【文檔編號(hào)】C07H19/048GK105873937SQ201480071722
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年10月30日
【發(fā)明人】安·德仁-路易斯, 特洛伊·魯尼穆斯
【申請(qǐng)人】可勞邁戴斯有限公司