活性提高的內(nèi)切葡聚糖酶變體及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及參與木質(zhì)纖維素生物質(zhì)分解的酶的表達和優(yōu)化。更具體地，本發(fā)明涉及里氏木霉內(nèi)切葡聚酶II的變體，和性能提高的所述變體在分解纖維素和生產(chǎn)生物燃料的方法中的用途。
【專利說明】
活性提高的內(nèi)切葡聚糖酶變體及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 由于大量原料的可利用性W及乙醇作為燃料的價值，由纖維素生產(chǎn)乙醇的可能性 已經(jīng)得到密切關(guān)注。用于此類工藝的基于纖維素的天然原料稱為"生物質(zhì)"。已經(jīng)考慮將許 多類型的生物質(zhì)，例如木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物，作為生產(chǎn)生物燃料的 潛在原料。運些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是由0-1，4鍵連接的葡萄糖分子組成的聚合物，其對降解或解聚合非常有 抗性。一旦纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，后者容易用酵母發(fā)酵成生物燃料，如乙醇。
[0003] 研究的用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的最古老的方法基于酸水解。該方法可W在濃 酸或稀酸存在下進行。然而，一些缺點（例如當(dāng)使用濃酸時酸回收很差，W及使用稀酸情況 下葡萄糖產(chǎn)量低)對酸水解工藝的經(jīng)濟性是不利的。
[0004] 為了克服酸式水解工藝的缺點，最近的纖維素轉(zhuǎn)化工藝已經(jīng)更多地與酶促水解 (使用纖維素酶類型的酶)相關(guān)。然而，運種酶促水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)（例如纖維素）的缺 點是其工業(yè)工藝較為昂貴。因此，有必要使用日益有效的分泌纖維素酶的微生物菌株。在運 方面，很多微生物包含水解纖維素的酶，例如真菌木霉（Tri Choderma)、曲霉 (Aspergillus)、腐質(zhì)霉（Humi cola)或鑲刀菌（Fusarium) W及細菌高溫單抱菌屬 (Thermomonospora)、芽抱桿菌（Baci 1 Ius )、纖維單胞菌（Cel Iulomonas )和鏈霉菌 (Str邱tomyces)。運些微生物分泌的酶具有用于將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的S種類型的活 性，且分為=組:隨機攻擊纖維素纖維內(nèi)部的內(nèi)切葡聚酶，攻擊纖維末端并釋放纖維二糖的 外切葡聚酶，和將運種纖維二糖水解為葡萄糖的e-葡萄糖巧酶。其他類型的酶，例如半纖維 素酶或最近發(fā)現(xiàn)的多糖單加氧酶類也可W在水解效率中起作用。
[0005] 降低酶促水解的成本具有強大的產(chǎn)業(yè)利益，運種降低設(shè)及使用減少量的酶W及更 有效的酶的混合物（cocktail)。因此，一些專利申請描述能力高于里氏木霉(Trichoderma reesei)的天然酶或通過基因工程改進的變體?？蒞提及與外切葡聚酶有關(guān)的專利申請 US2010304464、W0 2010/066411 和WO 2013/029176,與內(nèi)切葡聚酶有關(guān)的申請WO 2007/ 10944UW0 2012/149192和WO 2010/076388,與0-葡萄糖巧酶有關(guān)的申請WO 2010/029259、 WO 2010/135836或WO 2010/022518,或與多糖單加氧酶有關(guān)的其他申請W012135659和 W012149344。
[0006] 主要基于結(jié)構(gòu)標(biāo)準，水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶在CAZy系統(tǒng)（Cantarel，B丄.， Coutinho，P.M.,Rancurel，C.，BernarcUT.，Lombard，V.，&Henrissat，B.(2009).The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics.Nucleic acids research,37,0233-8)中分類。內(nèi)切葡聚酶屬于細 5、6、7、 8、9、12、16、18、19、26、44，、45、48、51、74 和 124 家族。
[0007] 為了使木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解有效且經(jīng)濟適用，酶混合物必須包含比例平衡的 各種酶活性(尤其是，但不排除其他，外切葡聚酶、內(nèi)切葡聚酶、木聚糖酶和e-葡萄糖巧酶）。 例如，一般注意到在里氏木霉的天然混合物中存在60-70%的外切葡聚酶、15-20%的內(nèi)切 葡聚酶、少量百分比的半纖維素酶和約5-10%的0-葡萄糖巧酶。該混合物適于水解大多數(shù) 預(yù)處理的底物(例如在酸性條件下汽爆的小麥賴桿)且產(chǎn)量可接受。簡言之，內(nèi)切葡聚酶活 性的增加必須不會損害其他酶的活性。運些酶的功能特異性目前仍知之甚少。里氏木霉基 因組包含至少巧巾主要的酶，其來自家族7化Gl，cel7b)、5化G2，cel5a)和12化G3，cell2a)。 EGl和EG2酶是主要的內(nèi)切葡聚酶，按重量計可W占里氏木霉產(chǎn)生的全部酶混合物的10-20%。
[000引內(nèi)切葡聚酶化C3.2.1.4)是作用于纖維素的第一個酶，已知其在水解中具有重要 作用:增加外切葡聚酶可W攻擊的位點數(shù)，同時降低被攻擊的微纖維的聚合度。最近的研究 (Szijarto,N.,Siika-aho,M.,Sontag-Strohm,T.,feViikari,L.(2011).Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes .Bioresource technology，102(2)，1968-74)強調(diào)它們在水解第一 個小時期間降低生物質(zhì)粘性的作用。運種粘性的降低對工藝的操作成本具有非常顯著的影 響。
[0009] 粘性問題在需要低溫資源的工藝的情況下加劇，例如同時糖化和發(fā)酵(SSF)，其設(shè) 及水解生物質(zhì)的酶和將糖單體轉(zhuǎn)化為乙醇的微生物兩者。
[0010] 水解和發(fā)酵可W根據(jù)各種方案進行。最常見的由獨立的水解和發(fā)酵(SHF)組成。運 種方法可W通過維持最佳反應(yīng)條件來優(yōu)化各步驟。發(fā)酵在約28°C至約3(TC的溫度即時進 行，而水解一般在至少45°C的溫度進行。然而，在甜F中，在反應(yīng)結(jié)束時釋放的糖的濃度非常 高，導(dǎo)致對酶的抑制，降低該方法的效率。為了避免運些缺點，可W預(yù)期另一種方法。在SSF 中，兩個步驟(己糖的水解和發(fā)酵)同時進行，防止糖積累至抑制酶的濃度。投資成本也因為 使用單個反應(yīng)器而降低。由于沒有抑制，之后的水解程度更高，因為釋放的糖被立即用于發(fā) 酵成乙醇。在該方法中，反應(yīng)器溫度必定構(gòu)成水解和發(fā)酵的最佳溫度之間的平衡，通常在約 30°C至約35°C之間。然而，纖維素酶的活性在該溫度降低約30%。
[0011] SSF還允許在發(fā)酵糖的生物中分解纖維素的酶的表達，從而可W將資源限制，或在 極端情況下消除至單獨步驟中產(chǎn)生的酶。
[001^ 因此，獲得在水解和發(fā)酵的最佳溫度(例如，在30°C-5(rC之間）下保持有效的內(nèi)切 葡聚酶活性同時保持混合物中所有酶的比例的酶對于將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃 料的工藝而言將具有顯著收益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了尤其與序列SEQ ID N0:2的野生型EG2蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性 相比，內(nèi)切葡聚酶活性提高的多膚。EG2對應(yīng)于里氏木霉內(nèi)切葡聚酶2。
[0014] 從運個角度，
【申請人】很大的功勞在于經(jīng)過大量研究之后，發(fā)現(xiàn)了與野生型EG2蛋白 (SEQ ID N0:2)的內(nèi)切葡聚酶活性相比，內(nèi)切葡聚酶活性提高的分離或純化多膚。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，所述多膚選自：
[0016] i)選自 SEQ ID N0:4、沈Q ID N0:6、SEQ ID N0:8、沈Q ID N0:10、沈Q ID N0:12、 SEQIDN0:14、WQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQIDN0:22、SEQIDN0: 24、沈Q ID NO:26、沈Q ID NO:28、SEQ ID NO:30、沈Q ID NO:32和沈Q ID NO:：M的氨基酸 序列；
[0017] ii)與序列沈Q ID N0:4、SEQ ID N0:6、沈Q ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO: 12、沈Q ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、沈Q ID N0:22、SEQ ID NO:24、沈Q ID NO:26、沈Q ID NO:28、沈Q ID NO:30、沈Q ID NO:32或沈Q ID NO:34具有至 少70%，優(yōu)選75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性百分比的氨基酸序列。
[001引根據(jù)本發(fā)明，給定序列相對于沈Q ID NO:4、SEQ ID NO:6、沈Q ID NO:8、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:16、沈Q ID NO:18、沈Q ID N0:20、沈Q ID N0:22、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:34的同一性百分比對應(yīng)于給定序列和SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 10、沈Q ID NO: 12、沈Q ID NO: 14、沈Q ID NO: 16、沈Q ID NO: 18、沈Q ID N0:20、沈Q ID N0:22、SEQ ID N0:24、沈Q ID N0:26、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32或 SEQ ID N0:：M之間相同的殘基數(shù)除Wseq ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:10、沈Q ID NO:12、沈Q ID NO:14、沈Q ID NO:16、沈Q ID NO:18、沈Q ID N0:20、沈Q ID N0:22、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32或SEQ ID NO:34的殘基數(shù)。當(dāng)使用Genome Quest數(shù)據(jù)庫時，所述相對于沈Q ID NO:4、SEQ ID NO: 6、WQIDN0:8、SEQIDN0:10、WQIDN0:12、SEQIDN0:14、WQIDN0:16、SEQIDN0: 18、沈Q ID N0:20、SEQ ID N0:22、沈Q ID N0:24、SEQ ID N0:26、沈Q ID N0:28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO: ：M的同一性百分比對應(yīng)于Query同一性百分比（％ id Que巧），其中Que巧對應(yīng)于序列沈Q ID NO:4、SEQ ID NO:6、沈Q ID NO:8、沈Q ID NO: 10、 SEQIDN0:12、WQIDN0:14、SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQIDN0: 22、沈Q ID N0:24、沈Q ID N0:26、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32或沈Q ID NO:34。
[0019] 在另一個實施方案中，上述多膚的特征在于，其在發(fā)酵生物中的表達至少等于野 生型EG2蛋白（SEQ ID NO:2)的表達。
[0020] 例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用底物簇甲基纖維素(CMC)或使用顯色底物(對硝 基苯基巧)來確定酶活性的增加或換言之提高。酶活性將通過還原糖或釋放的硝基苯酪的 比色分析分別掲示。
[0021] 優(yōu)選地，相對于氨基酸序列SEQ ID N0:2的EG2蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性，本發(fā)明的 多膚的酶活性提高至少10%，優(yōu)選至少20%，優(yōu)選至少30%。
[0022] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W用來確定根據(jù)本發(fā)明的多膚的酶活性相對于野生型EG2蛋白 (SEQ ID N0:2)是否提高的方案的實例如下：
[0023] -于37°C過夜形成表達根據(jù)本發(fā)明的多膚的大腸桿菌化.COli)的原種培養(yǎng)物；
[0024] -于37 °C用1 %原種培養(yǎng)物接種LB培養(yǎng)基直至獲得最佳密度0.4;
[0025] -于20°C培養(yǎng)所述細胞1她；
[0026] -在7900巧m離屯、5分鐘；
[0027] -用含有Img/ml溶菌酶的抑5的IOOmM巧樣酸鹽緩沖液重懸細胞沉淀(最終ODsoo為 100);
[002引-在冰上解育重懸細胞30分鐘；
[0029]-通過3個循環(huán)的冷凍/融化裂解細胞；
[0030] -通過超聲法使DNA片段化；
[0031] -在13000巧m離屯、30分鐘；
[0032] -于35°C和50°C解育10化1分解上清液化，所述分解上清液用10化1含有1%CMC的 P冊的IOOmM巧樣酸鹽緩沖液稀釋50倍；
[0033] -移除10化1反應(yīng)；
[0034] -加入 1〇化1 DNS 試劑(Miller ,1959);
[0035] -于10(TC解育5分鐘；
[0036] -在冰上解育3分鐘；
[0037] -在3000巧m離屯、10分鐘；
[0038] -在540nm讀取15化1上清液的光密度。
[0039] 本發(fā)明的主題還是編碼至少一個上述多膚的純化或分離的核酸。下表1包含W下 基因的核酸和膚序列的鑒定:EG2基因、推測的灰葡萄抱霉(Botryotinia fuckeliana)內(nèi)切 葡聚酶2基因（BF基因）和推測的核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)內(nèi)切葡聚酶2基因 （SS 基因），W及本發(fā)明的核酸和多膚序列。
[0040] 優(yōu)選地，所述純化或分離的核酸可W選自W下序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、 WQIDN0:7、SEQIDN0:9、SEQIDN0:11、WQIDN0:13、SEQIDN0:15、WQIDN0:17、 SEQIDN0:19、WQIDN0:21、SEQIDN0:23、SEQIDN0:25、SEQIDN0:27、SEQIDN0: 29、沈Q ID N0:31 和沈Q ID N0:33。
[0041] 表1
[0042]
[0043]
[0044] 本發(fā)明還設(shè)及包含上述核酸的載體。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"載體"意欲是指在其中有可能插入外源核酸片段的任何DNA序 列，載體能夠?qū)⑼庠碊NA引入宿主細胞。作為載體，非窮舉地可W提及:質(zhì)粒、黏性質(zhì)粒、酵母 人造染色體(YAC)、細菌人造染色體(BAC)、P1隧菌體衍生的人造染色體(PAC)或病毒衍生的 載體。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，上述核酸可W與啟動子、終止子或其在宿主細胞中表達所需的任何 其他序列功能性連接。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的載體還可W攜帶選擇標(biāo)記。術(shù)語"選擇標(biāo)記"意欲是指其表達使包含 它的細胞具有能夠選擇它們的特征。例如，它是耐抗生素的基因。
[004引本發(fā)明的主題還是包含至少一種上述多膚、或至少一種上述核酸或至少一種上述 載體的分離的宿主細胞。
[0049] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過熟知的常規(guī)方法將上述的多膚之一、核酸之一或載體 之一引入宿主細胞。例如，可W提及用氯化巧處理、電穿孔或使用基因槍。
[0050] 根據(jù)一個實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)方法將編碼內(nèi)切葡聚酶活性 提高的根據(jù)本發(fā)明的多膚的幾個拷貝的核酸引入宿主細胞。
[0051 ] 根據(jù)一個實施方案，上述分離的宿主細胞選自木霉、曲霉、鏈抱霉(Neurospora)、 腐質(zhì)霉、毀絲霉(Mycelio曲thora)、金抱霉(Qiiysosporium)、青霉(Penicilli皿）、鑲刀菌、 高溫單抱菌、芽抱桿菌、假單胞菌（Pseudomonas)、埃希氏菌（Escherichia)、梭菌 (Clostridium)、纖維單胞菌、鏈霉菌、耶氏酵母（Yarrowia)、畢赤醇母（Pichia)和酵母 (Saccharomyces)。
[0052] 根據(jù)一個實施方案，上述分離的宿主細胞選自里氏木霉、綠色木霉(Trichoderma viridae)、康氏木霉（Trichoderma koningii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidulans)、文氏曲霉（Aspergi 1 Ius went i i )、米曲霉（Aspergi 1 Ius oryzae)、海要曲霉（Aspergillus phoenicis)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermopila)、Chrysosporium lucknowense、粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)、灰腐質(zhì)霉 (Humicola grisae)、嗜松青霉（PeniciIlium pinophiIum)、草酉《青霉（PeniciIlium oxalicum)、大腸桿菌（Escherichia coli)、丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)、糖解梭菌（Clostridium saccharoIyticum)、拜氏梭菌（Clostridium benjerinckii)、下酸梭菌（Clostridium butylicum)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、解脂 耶氏酵母(化rrowia Iipolityca)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0053] 根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，上述分離的宿主細胞選自里氏木霉和釀酒酵母。
[0054] 本發(fā)明的主題還是上述任何一種多膚用于水解纖維素的用途。
[0055] 本發(fā)明的主題還是上述任何一種多膚用于生產(chǎn)生物燃料的用途。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"生物燃料"可W定義為來自生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化且可用于能源目的的 任何產(chǎn)物。并且，不希望被限制且通過舉例的方式可W提到的，可W納入燃料的產(chǎn)物-生物 氣(任選地在隨后的轉(zhuǎn)化之后)或其本身可W作為燃料，例如醇(根據(jù)使用的發(fā)酵生物的類 型，乙醇、下醇和/或異丙醇）、溶劑(丙酬）、酸(下酸）、脂質(zhì)及其衍生物(短鏈或長鏈脂肪酸、 脂肪酸醋)和氨氣。
[0057] 優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的生物燃料是醇，例如乙醇、下醇和/或異丙醇。更優(yōu)選的，根 據(jù)本發(fā)明的生物燃料是乙醇。
[005引在另外一個實施方案中，生物燃料是生物氣。
[0059] 在另外一個實施方案中，產(chǎn)物是在化學(xué)工業(yè)中感興趣的分子，例如另一種醇(如1， 2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-下二醇、2,3-下二醇）、有機酸(如乙酸、丙酸、丙締酸、下酸、班 巧酸、蘋果酸、延富馬酸、巧樣酸、或衣康酸），或徑基酸(如乙醇酸、徑基丙酸或乳酸）。
[0060] W下描述用于水解木質(zhì)纖維素的酶混合物的生產(chǎn)的實施方案。將能夠表達根據(jù)本 發(fā)明多膚的絲狀真菌菌株，優(yōu)選木霉，更優(yōu)選里氏木霉，在選擇用于微生物生長的碳基底物 (如乳糖或葡萄糖）的存在下在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。在一個實施方案中，將該碳基底物根據(jù)其性 質(zhì)在滅菌前引入發(fā)酵罐或單獨滅菌后再引入滅菌后的發(fā)酵罐W獲得20-35g^的初始濃度。
[0061] 然后加入選擇用于生產(chǎn)酶的含有底物的水性溶液。最后通過過濾培養(yǎng)基回收真菌 產(chǎn)生的作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物。在該組合物中，尤其有e-葡萄糖巧酶、外切葡 聚糖酶和根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶。在一個實施方案中，該選擇用于生產(chǎn)酶的含有底物 的水性溶液W200-250g/l的濃度制備，其還包含誘導(dǎo)底物例如乳糖。在初始的碳基底物耗 盡后加入該水性溶液W提供35-45mg/g的最佳細胞量（"補料分批"）。在該"補料分批"階段， 培養(yǎng)基中糖的殘留濃度少于lg/1，且作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶由真菌分泌。后者可W 通過過濾培養(yǎng)基回收。
[0062] 本發(fā)明的主題是能夠作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物，所述酶組合物優(yōu)選由 絲狀真菌產(chǎn)生，且包含至少一種相對于野生型EG2蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性，其內(nèi)切葡聚酶活 性提高的多膚。術(shù)語"絲狀真菌"意欲尤其是指木霉，更優(yōu)選里氏木霉。
[0063] 最后，本發(fā)明的主題是從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，包含W下連續(xù)步驟：
[0064] -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相；
[0065] -如上所述在酶組合物存在下水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)W產(chǎn)生含有葡萄糖的水解 物；
[0066] -發(fā)酵水解物中的葡萄糖W產(chǎn)生發(fā)酵液；
[0067]-從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[006引在一個實施方案中，將待水解的生物質(zhì)W6%-40%的固體，優(yōu)選20%-30%的比例 懸浮于水相。調(diào)節(jié)抑至4-5.5，優(yōu)選4.8-5.2，并且調(diào)節(jié)溫度至40-60°C，優(yōu)選45-50°C。通過加 入作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物啟動水解反應(yīng)，通常用量是每克預(yù)處理的底物10-SOmg分泌的蛋白或更少。反應(yīng)一般持續(xù)15-48小時。通過分析釋放的糖，尤其是葡萄糖監(jiān)測 反應(yīng)。通過過濾或離屯、從非水解固體級分中分離主要由木質(zhì)素組成的糖溶液，隨后在發(fā)酵 單元中處理。
[0069] 在一個實施方案中，可通過蒸饋從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0070] 本發(fā)明的另一個主題是從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于它包含W下連 續(xù)步驟：
[0071 ]-將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相；
[0072] -優(yōu)選在30°C-35°C的溫度同時添加上述酶組合物和發(fā)酵生物W產(chǎn)生發(fā)酵液；
[0073] -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0074] 優(yōu)選地，同時添加酶組合物和發(fā)酵生物，然后在30°C-35°C的溫度解育W產(chǎn)生發(fā)酵 液。
[0075] 根據(jù)運個實施方案，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的SSF(同時糖化和發(fā)酵)方法，將生 物質(zhì)中存在的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，同時在同一反應(yīng)器中，發(fā)酵微生物(例如酵母)將葡萄 糖轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。取決于發(fā)酵生物的代謝和水解能力，正確進行該操作可能需要添加或 多或少量的外源分解纖維素的混合物。
[0076] 在另一個實施方案中，發(fā)酵生物通過分泌或在其細胞表面產(chǎn)生作為本發(fā)明主題的 多膚，任選地與作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的其他酶一起，從而限制或消除對由絲狀真菌產(chǎn) 生的酶的需求。優(yōu)選地，發(fā)酵生物是上述宿主細胞。
[0077] 因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的主題是從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，包含W下連續(xù)步 驟：
[0078] -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相；
[0079] -添加一種或多種上述宿主細胞W及上述發(fā)酵生物和/或酶組合物W產(chǎn)生發(fā)酵液；
[0080] -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
[0081 ]優(yōu)選地，添加宿主細胞W及酶組合物和/或發(fā)酵生物，然后在30°C-35 °C的溫度解 育W產(chǎn)生發(fā)酵液。
[0082] 因此，使用根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切葡聚酶活性提高的多膚具有獲得更好葡萄糖生產(chǎn)產(chǎn) 量的優(yōu)勢。因此，本發(fā)明能夠使用比之前更少的酶，運具有來自經(jīng)濟觀點的優(yōu)勢。
[0083] 本發(fā)明的其他方面、主題、優(yōu)勢和特征將通過閱讀W實施例和圖的方式給出的W 下描述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的非限制性描述展示。
【附圖說明】
[0084] 圖1是表示分別由菌株Sca-EG2、Sca-222El和Sca-225C7分泌到培養(yǎng)基的EG2參考 內(nèi)切葡聚酶(SEQ ID N0:2)W及突變體22沈巧日225C7(分別為SEQ ID N0:24和26)水解P-硝 基苯基-0-纖維=糖巧(PNPC3)的圖。
[0085] 圖2是表示分別由菌株Sca-EG2、Sca-222E1和Sca-225C7分泌到培養(yǎng)基的EG2參考 內(nèi)切葡聚酶（569 1〇顯:2)^及突變體22261和225〔7(分別為560 1〇^:24和26)水解1% CMC的圖。
[0086] 圖3是表示W(wǎng)下混合物的甜F結(jié)果的圖：衍生自菌株146C4/7的混合物、由補充有(6-葡萄糖巧酶的菌株化847 AEGU AEGl)產(chǎn)生的參考混合物、W及由補充有0-葡萄糖巧酶的 菌株并用EG2參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 AEGU A EG1CEG2)產(chǎn)生的另一種參考混合物。
[0087] 圖4是表示W(wǎng)下混合物的SHF結(jié)果的圖：衍生自菌株222EUSEQ ID N0:24)的混合 物、衍生自菌株225C7/7(SEQIDN0:26)的混合物、由補充有(6-葡萄糖巧酶的菌株化847 A EGU AEGl)產(chǎn)生的參考混合物、W及由補充有0-葡萄糖巧酶的菌株并用EG2參考基因再轉(zhuǎn) 化的化847 AEGU A EG1CEG2)產(chǎn)生的另一種參考混合物。
[008引圖5是表示W(wǎng)下混合物的SSF結(jié)果的圖：衍生自菌株146C4/7(SEQ ID NO: 16)的混 合物、衍生自菌株19 IHl 1/9 (SEQ ID NO: 22)的混合物、由補充有0-葡萄糖巧酶的菌株化847 AEGU AEGl)產(chǎn)生的參考混合物、W及由補充有0-葡萄糖巧酶的菌株并用EG2參考基因再 轉(zhuǎn)化的化847 AEGU A EG1CEG2)產(chǎn)生的另一種參考混合物。
[0089] 圖6是表示W(wǎng)下混合物的平均SSF結(jié)果的圖：衍生自菌株222E1/U222E1/2和 22沈1/7(569 10^:24)的巧巾混合物、衍生自菌株225〔7/7(569 10^:26)的混合物、由補 充有e-葡萄糖巧酶的菌株化847 AEGU AEGl)產(chǎn)生的參考混合物、W及由補充有0-葡萄糖 巧酶的菌株并用EG2參考基因再轉(zhuǎn)化的化847 AEGU A EG1CEG2)產(chǎn)生的另一種參考混合 物。
【具體實施方式】
[0090] 實施例1:通過k洗牌的進化
[0091] 將里氏木霉內(nèi)切葡聚酶2化G2)的基因序列用各自與EG2參考基因 （SEQ ID N0:1) 具有64%同一性的推測的灰葡萄抱霉內(nèi)切葡聚酶2基因（BF基因）和推測的核盤菌內(nèi)切葡聚 酶2基因（SS基因）根據(jù)EP1104457B11中所述的專利方法進行一輪k洗牌。
[009。1-高通量篩選
[0093] 開發(fā)高通量篩選試驗W選擇由レ洗牌產(chǎn)生的最佳克隆，例如，相對于里氏木霉的 酶其內(nèi)切葡聚酶活性顯示至少20 %提高的那些。
[0094] 高通量篩選試驗根據(jù)W下步驟進行：
[00M]-在瓊脂上分離表達根據(jù)本發(fā)明的重組酶的變體的大腸桿菌克隆，并將所述克隆 于37 °C在LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)過夜；
[0096] -用所述預(yù)培養(yǎng)接種6%的LB培養(yǎng)基，然后于37°C解育5小時，然后于20°C解育17小 時；
[0097] -在3000巧m下離屯、10分鐘；
[0098] -添加 SOiil P冊含有Img/ml溶菌酶的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液溶液裂解細胞；
[0099] -在室溫下解育4小時；
[0100] -添加 SOiil P冊含有1 %簇甲基纖維素的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液；
[0101] -于35 °C解育3小時；
[0102] -在3000巧m下離屯、10分鐘；
[0103] -移除IOOiil上清液；
[0104] -添加10化1 DNS試劑；
[0105] -于IOCTC解育10分鐘，然后在冰上解育5分鐘；
[0106] -在 540nm 讀取 12化1 的 0D。
[0107] 在運些篩選條件下，在克隆 37D12、45A7、4細 1、50F10、108G5、140F7、146C4、14W4、 173〔6、191刖1、22261、22507、227〔4、22901、231〔9和330尸9中發(fā)現(xiàn)內(nèi)切葡聚酶活性相對于 EG2參考酶(SEQ ID ^:2)的提高(在54〇11111的00增加）。
[0刪 2-測定內(nèi)切葡聚酶活性的提高
[0…9] 2-1/在簇甲基纖維素(CMC)底物上
[0110] 為了評估克隆 37D12、45A7、46H1、50F10、108G5、140F7、146C4、149E4、173C6、 191化1、22261、225〔7、227〔4、22901、231〔9和33(^9與參考酶相比的1(。曰1，進行^下過程：
[0111] -于37°C過夜制備表達根據(jù)本發(fā)明的重組酶的大腸桿菌的原種培養(yǎng)液；
[0112] -于37 °C用1 %原種培養(yǎng)物接種LB培養(yǎng)基直至獲得600nm的光學(xué)密度為0.4;
[0113] -于20°C培養(yǎng)所述細胞1她；
[0114] -在7900巧m離屯、5分鐘；
[0115] -用pH5含有Img/ml溶菌酶的0.1 M巧樣酸鹽緩沖液重懸細胞沉淀（最終ODsoo為 100);
[0116] -在冰上解育重懸細胞30分鐘；
[0117] -通過3個循環(huán)的冷凍/融化裂解細胞；
[0118] -通過在能量5超聲3秒使DNA片段化；
[0119] -在13000巧m離屯、30分鐘；
[0120] -于35°C和50°C用10化1含有1%CMC的P冊的0.1M巧樣酸鹽緩沖液解育10化1分解 上清液化；
[0121] -移除10化1反應(yīng)；
[0122] -添加10化1 DNS試劑；
[0123] -于100°C解育5分鐘；
[0124] -在冰上解育3分鐘；
[0125] -在3000巧m離屯、10分鐘；
[01%]-在540nm讀取15化1的光密度。
[0127] 根據(jù)本發(fā)明，按照W下方式計算Kcat值：
[0128] -將540nm的OD表達為目標(biāo)蛋白量（WnM表示)的函數(shù)；
[0129] -減去陰性對照的值；
[0130] -除W葡萄糖標(biāo)準范圍的系數(shù)(用DNS掲示各種葡萄糖含量）；
[0131] -除W反應(yīng)時間。
[0132] 表2表示在CMC上的活性試驗的實驗條件下，克隆37D12、45A7、4細1、50F10、108G5、 140尸7、146〔4、14犯4、173〔6、191化1、22261、225(：7、227〔4、22901、231〔9和33(^9相對于662 參考蛋白（SEQ ID NO:2)的Kcat值W及提高倍數(shù)。
[0133] 表2:在CMC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0134]
[i
12345 結(jié)果表明運些克隆的酶活性相對于EG2參考蛋白（SEQ ID N0:2)顯著提高。 2
[0。7] 2-2/在憐酸溶脹纖維素(PASC)底物上 3 然后在第二種底物:憐酸溶脹纖維素(PASC)上確認克隆37D12、45A7、4細U50F10、 10865、140尸7、146〔4、14犯4、173〔6、191化1、22261、225〔7、227〔4、22901、231〔9和330尸9活性 的提高。 4 表3表示在PASC上的活性試驗的實驗條件下，克隆37D12、45A7、46H1、50F10、 10865、140尸7、146〔4、14犯4、173〔6、191化1、22261、225〔7、227〔4、22901、231〔9和330尸9相對 于EG2參考蛋白（SEQ ID NO:2)在50°C的Kcat值W及提高倍數(shù)。 5 表3:在PASC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0141]
[0142]
[0143] 結(jié)果表明運些克隆的酶活性相對于EG2參考蛋白（SEQ ID N0:2)顯著提高。
[0144] 2-3/在 Sigmacell 底物上
[0145] 還在第S種底物：Sigmacell 上評估克隆 37D12、45A7、4細 1、50F10、108G5、140F7、 146〔4、14犯4、173〔6、191刖1、22261、225(：7、227〔4、22901、231〔9和33(^9的提高。試驗方案 與之前所述的用CMC底物的方案相同。于50°C用底物解育24小時。
[0146] 表4表示在Sigmacell上的活性試驗的實驗條件下，克隆37D12、45A7、4細U50F10、 10865、140尸7、146〔4、14犯4、173〔6、191化1、22261、225〔7、227〔4、22901、231〔9和330尸9相對 于EG2參考蛋白（SEQ ID NO:2)在50°C的Kcat值W及提高倍數(shù)。
[0147] 表4:在Sigmacel 1上的內(nèi)切葡聚酶活性
[014 引
[0149] 1234
結(jié)果表明，在Sigmacell底物上可見克隆37D12、45A7、4細 1、50F10、108G5、140F7、 146C4、14 犯4、173C6、191H11、222E1、225C7、227C4、229D1、231C9 和 330F9 的活性相對于 EG2 參考酶(SEQ ID NO:2)提高。 2
[0巧1] 實施例2 3 通過Ba恤1/趾〇1雙消化，將變體146〔4、191刖1、22261和225〔7，^及里氏木霉的 EG2參考基因 （SEQ ID N0:2)克隆入含有耐腐草霉素基因作為標(biāo)記的PUT1040質(zhì)粒的Cbhl啟 動子和終止子之間。用扣g的各載體轉(zhuǎn)化里氏木霉菌株化847 A EGl。用化g的各構(gòu)建體通過 巧和陽G沖擊按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。在含有30yg/l腐草霉素 的PDA/薦糖選擇培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。在可能獲得純克隆的S次連續(xù)的繼代培養(yǎng)后，各變 體獲得11-15個克隆。在含有5g/l葡萄糖和lOg/1山梨糖作為碳底物和誘導(dǎo)劑的F45培養(yǎng)基 (800山85%出P04、4.2g(NH4)2S04、0.3gMgS04.7此0、0.75g玉米漿、lml01igo化rment、6g 鄰苯二甲酸鐘、pH 5.8-6)中培養(yǎng)所有克隆。于30°C培養(yǎng)7天后，移除上清液，將Low巧方法測 量的lOmg/1蛋白當(dāng)量用于簇甲基纖維素上的活性試驗。 4 對于活性測量，將15化1在pH4.8、50mM巧樣酸緩沖液中的2 % CMC溶液與15化1含有 lOmg/1蛋白的巧樣酸緩沖液混合。于50°C和35°C解育反應(yīng)10分鐘，然后在沸水浴中失活。離 屯、5分鐘后，移除20山W用3,5-二硝基水楊酸(DNS)分析還原糖。通過在540皿讀取吸光度來 監(jiān)測DNS的還原和3-氨基-5-硝基水楊酸的形成，用葡萄糖范圍定量還原糖。
[0154]表5總結(jié)了各變體的最佳克隆獲得的活性（W皿ol葡萄糖當(dāng)量/mg蛋白/min表示）。 用天然EG2基因轉(zhuǎn)化的菌株A EGl ( A EG1CEG2)的值是最佳的4個克隆的平均值。
[0巧5] 表5:在CMC上的內(nèi)切葡聚酶活性
[0156]
[0157] 對于各變體，至少一個克隆在35°C或50°C具有高于菌株AEG1cEG2的CM化Se活性， 最佳克隆的活性是菌株A EG1CEG2的兩倍。
[015引 實施例3:EG2參考內(nèi)切葡聚酶^及22沈1和225C7變體在釀酒酵母中的重組表達
[0159] 1-在胞外培養(yǎng)基中EG2參考內(nèi)切葡聚酶參考蛋白及其222E1變體的產(chǎn)生
[0160] 將里氏木霉的EG2參考內(nèi)切葡聚酶基因 （SEQ ID N0:1)W及222E1和225C7變體的 基因（分別是SEQ ID NO: 23和25)在不存在其信號膚的情況下克隆入祀SC-Leua Amyc載體 (CNRS-CERMAV)。該構(gòu)建體允許在釀酒酵母菌株邸YlOO的培養(yǎng)基中表達蛋白質(zhì)，所述菌株是 亮氨酸和色氨酸營養(yǎng)缺陷型(Boder ET和Wittrup KD,Biotechnol Prog,1998,14:55-62)。 該質(zhì)粒能夠?qū)⒒虮磉_置于半乳糖誘導(dǎo)的GALl啟動子的控制下，且具有允許轉(zhuǎn)化體選擇的 營養(yǎng)缺陷型可選擇標(biāo)記基因化eu2)。
[0161] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法(通過熱休克和乙酸裡轉(zhuǎn)化酵母)進行釀酒 酵母邸Y100的轉(zhuǎn)化。在0.67%YNB-2%Glc-0.01%T巧培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。
[0162] 用每個基因的一個轉(zhuǎn)化體（Sca-EG2、Sca-222El和Sca-225C7)接種 15ml 0.67% YNB-2 %Glc-SD-0.0 l % T巧的基本培養(yǎng)基。SD是氨基酸的混合物(40mg/l硫酸腺嚷嶺、20mg/ 1心精氨酸、lOOmg/1天冬氨酸、lOOmg/1心谷氨酸、20mg/l心組氨酸、30mg/l心賴氨酸、 20mg/l k甲硫氨酸、50mg/l k苯丙氨酸、375mg/l心絲氨酸、200mg/l心蘇氨酸、30mg/l 心酪氨酸、150mg/l心鄉(xiāng)氨酸和20mg^尿喀晚）。于30°C W22化pm振搖預(yù)培養(yǎng)24小時后，用 S 個菌株 Sca-EG2、Sca-222E 巧日 Sca-225C7 接種（0D600 = 0.5)150ml0.67%YNB-2%GaレSD-0.01 %化P培養(yǎng)基。于25°C W22化pm振搖解育該培養(yǎng)物。解育8小時后，向各培養(yǎng)物中添加 6ml P冊.6的巧樣酸鋼W將pH穩(wěn)定在5。
[0163] 解育4天后，移除20ml培養(yǎng)物。于4°C在3000g離屯、5分鐘獲得培養(yǎng)物上清液。
[0164] 2-在對硝基苯基-0-纖維立糖巧上測定內(nèi)切葡聚酶活性
[0165] 通過在W下條件下，在45化1體積中水解PNPC3底物測量培養(yǎng)物上清液的內(nèi)切葡聚 酶活性：
[0166] -P冊的50mM巧樣酸緩沖液；
[0167] -2mM pNPC3；
[0168] -來自 Sca-EG2、Sca-222E1 和 Sca-225C7 菌株的 56.3iU 培養(yǎng)物上清液；
[0169] -于35°C解育6小時。
[0170] 向10化1水解反應(yīng)中添加10化1 IM碳酸鋼停止反應(yīng)。通過測量415nm的吸光度并與 對硝基苯酪的標(biāo)準范圍（0.36-360iiM是線性)進行比較來測定由PNPC3水解釋放的對硝基苯 酪(pNP)的濃度。
[0171] 圖1的結(jié)果表明，Sca-222E1菌株的內(nèi)切葡聚酶活性相對于表達EG2參考酶(SEQ ID N0:2)的Sca-EG2菌株提高了1.6倍。發(fā)現(xiàn)菌株Sca-225C7方面對于水解運種底物的效率較 低。
[01。] 3-在簇甲基纖維素上測定內(nèi)切葡聚酶活性
[0173] 通過在W下條件下，在70化1體積中水解簇甲基纖維素(CMC)測量培養(yǎng)物上清液的 內(nèi)切葡聚酶活性：
[0174] -P冊的50mM巧樣酸緩沖液；
[0175] -1%CMC；
[0176] -Sca-EG2、Sca-222El和Sca-225C7菌株的210iU培養(yǎng)物上清液，所述上清液在 IOkDa膜上用P冊的50mM巧樣酸緩沖液透析并濃縮兩倍；
[0177] -于35 °C解育24小時。
[0178] 向10化1水解反應(yīng)中添加15化1 DNS試劑停止反應(yīng)。于100°C加熱5分鐘并在并上冷 卻后，通過測量550nm的吸光度并與用葡萄糖制備的標(biāo)準范圍進行比較來測定釋放的還原 糖的量。
[0179] 圖2的結(jié)果表明，由菌株Sca-222E1和Sca-225C7變體的作用釋放的還原糖的量高 于菌株Sca-EG2。因此，在水解CMCl小時后，在35°C的該底物上，Sca-222E巧日Sca-225C7相對 于Sca-EG2的提高倍數(shù)分別是3.5和2.6。超出該解育時間，兩種變體繼續(xù)水解CMC,但反應(yīng)速 率在EG2參考蛋白（SEQ ID NO:2)存在下幾乎變?yōu)榱恪?br>[0180] 實施例4:在補料瓶中通過里氏木霉生產(chǎn)酶
[0181] 在250ml化Ienm巧er瓶中培養(yǎng)參考菌株和在CMC上具有最佳活性的那些（CL847、 AEG1、AEGlcEG2、146C4/7、191Hll/9、222El/l、222El/2、222El/7、225C7/7)。接種55ml F45培養(yǎng)基（lOg/1 鄰苯二甲酸二鐘緩沖液、pH 6,4.2g/l(NH4)2S〇4、300mg/l MgS〇4.7出0、 150mg/l CaCb.2出0、1.5g/l玉米漿、0.07%正憐酸、5mg/l 化S〇4、1.4mg/l MnS〇4、1.4mg/l ZnS化、3.7mg^ C0CI2和12.5g/l葡萄糖），于30°C W15化pm振搖。生產(chǎn)在兩個階段進行:在葡 萄糖上的分批階段和在乳糖上的補料-分批階段。規(guī)律取樣可W測定葡萄糖濃度低于3g/l 的時刻。在運個階段，開始使用注射累(6路）的補料-分批進料。W40mg糖/g生物質(zhì)/小時的 流速用50g/l乳糖和0.3%N出為培養(yǎng)進料。每天取樣W測定pH、干重和上清液中的蛋白濃 度。補料-分批培養(yǎng)5天后，用0.45WI1過濾器過濾培養(yǎng)物并將上清液冷凍。
[0182] 最終的蛋白濃度為約3-4g/l。如果濃度低于3g/l，在柱（Vivaspin MWC05， Sador ius)上濃縮上清液。
[。側(cè)實施例5: k洗牌產(chǎn)生的酶根據(jù)SHF方法水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的效率
[0184] 所使用的參考底物是小麥賴桿，所述小麥賴桿用0.01%出S化酸浸潰10小時，洗涂， 在抑5中和，壓制并干燥后，進行汽爆預(yù)處理（19己-3分鐘）。其特征如表9所示。
[0185]
[0186] 表6:用于水解試驗的賴桿組成
[0187] 水解在10 %固體w/w進行，即相當(dāng)于5.4 %纖維素 w/w。
[0188] 將蛋白含量固定在lOmg/g固體，即約19mg/g纖維素。用BSA作為參考用Low巧方法 巧慢酶混合物的濃度。通過添加 SP1880-葡萄糖巧酶(Novozymes)向各混合物Wl20±2IU/g 纖維素的量補充e-葡萄糖巧酶活性。
[0189]在具有2ml工作量(Ig反應(yīng)量)的含有W下的化pendorf管中進行試驗：
[0190] -0.11 ± 0.0 Olg洗涂的賴桿底物；
[0191] -0.9 ±0.02ml由pH4.8的50mM醋酸鹽緩沖液和氯霉素(0.05g/l)組成的水解反應(yīng) 基質(zhì)；
[0192] -取決于其蛋白含量，0.1-0.2 ± 0.02g的酶混合物。
[0193] 在Elppendorf Thermomixer Comfort中，于45±2°C W900轉(zhuǎn)/分鐘的滿流攬拌進行 酶促水解。
[0194] 所有試驗重復(fù)進行，取樣時間固定在t24、48和96小時，一些在t72小時取樣。
[01M]在各取樣時間，在滅菌的化pendorf管里將水解物煮沸5分鐘。然后冷卻并離屯、運 些管。用HPLC進行葡萄糖分析。平行地，將各化pendorf管中的固體殘留物洗涂，離屯、3次，并 于105 °C干燥24小時，從而評估WIS(水溶性固體）。將WIS考慮在內(nèi)計算水解產(chǎn)量。
[0196] 評估由實施例4產(chǎn)生的混合物。用同樣添加有0-葡萄糖巧酶的參考混合物進行對 照試驗用于比較：由菌株化847 AEGU AEGl)產(chǎn)生的混合物，和由用EG2參考基因再轉(zhuǎn)化的 菌株化847 AEGU AEGlcEG2)產(chǎn)生的混合物。
[0197] 圖3表示由菌株146〔4/7(569 10^:16)產(chǎn)生的混合物的5耶結(jié)果。
[019引圖3所示的結(jié)果表明，146C4變體產(chǎn)生的混合物的初始水解速率高于A EGl和A EGlcEG2參考混合物。其最終水解產(chǎn)量也高于A EGl和A EGlcEG2參考混合物。
[0199] 圖4表示由菌株22沈1/1(569 10^:24)產(chǎn)生的混合物和由菌株225〔7/7(569 10 NO: 26)產(chǎn)生的混合物的SHF結(jié)果。
[0200] 圖4的結(jié)果表明，222E1變體和225C7變體產(chǎn)生的混合物的初始水解速率高于A EGl 和A EGlCEG2參考混合物。其最終水解產(chǎn)量也高于A EGl和A EGlCEG2參考混合物。
[020。實施例6:酶根據(jù)SSF方法水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的效率
[0202] 使用的底物與表6所述的底物(實施例4)相同。
[0203] 在實驗室反應(yīng)器中進行=次SSF。所述反應(yīng)器由W下元件組成：
[0204] -具有30ml工作量的玻璃瓶；
[02化]-聚酸酸酬(陽邸)安全塞；
[0206] -通過塞相連的Vaplock公司出售的DV-118單向閥。當(dāng)瓶中的相對壓力高于70m己 時，該閥設(shè)置為在出口打開；
[0207] -中空的聚丙締管，在一秒中固定，其通過所述塞，且用隔板將其配備于所述管的 下端；
[0208] -置于瓶頸和塞之間的平面密封。
[0209] 操作生物反應(yīng)器的原理如下：在乙醇發(fā)酵期間產(chǎn)生的C〇2積聚在位于反應(yīng)基質(zhì)上 方的頂部空間，通過積累造成生物反應(yīng)器內(nèi)壓力增加(Pc)。當(dāng)Pc高于打開單向閥的壓力(Ps) 時，所述閥打開W允許一定量的氣體排出，所述量例如通過稱重測定。當(dāng)Pc< Ps，閥再次關(guān)閉 直至化大于Ps。因此，運行中的生物反應(yīng)器總是在壓力下，從而確保發(fā)酵的穩(wěn)定厭氧培養(yǎng)基。 通過C〇2的產(chǎn)生評估產(chǎn)生的乙醇量，所述C〇2的產(chǎn)生基于W下用于將葡萄糖發(fā)酵成乙醇的化 學(xué)計量方程通過重量損失來估計：
[0210] C曲2〇6(葡萄糖）一 2C02+2C出C出OH(乙醇）+能量
[0211] 用于SSF的培養(yǎng)基是包含W下的水性培養(yǎng)基：
[0212] -P冊的50mM醋酸鹽緩沖液；
[0213] -O.lg/1 的氯霉素；
[0214]-含有3旨/11(此？〇4、2旨/1(畑4)25〇4、0.4旨/11旨5〇4.7出0和1旨/1酵母提取物的營養(yǎng) 培養(yǎng)基。
[021引 SSF在10±0.0 l %w/w固體進行，即相當(dāng)于15±0.003g的總反應(yīng)質(zhì)量使用5.4%纖 維素 w/w。將蛋白含量固定在10±0.01mg纖維素酶/g固體，即約19mg/g纖維素。用BSA(牛血 清白蛋白）作為參考用Low巧方法測量酶混合物的濃度。通過添加 SP1880-葡萄糖巧酶 (Novozymes)向各混合物W120 ± 2IU/g纖維素的量補充0-葡萄糖巧酶活性。
[0216] 向培養(yǎng)基中添加糖發(fā)酵酵母(釀酒酵母，Ethano 1 Red菌株，F(xiàn)erment i S，F(xiàn)rance) W 獲得2 + 0.1 g/kg的含量。
[0217] 將已經(jīng)于35°C用緩沖液、氯霉素和培養(yǎng)基預(yù)處理過的小麥賴桿調(diào)節(jié)(condition)l 小時后，向生物反應(yīng)器中添加酶和酵母。
[0218] 在約35°C的溫度，通過將實驗室生物反應(yīng)器置于軌道旋轉(zhuǎn)速度為150轉(zhuǎn)/分鐘的 Infors HT Multitron標(biāo)準解育器中進行SSF反應(yīng)。
[0219] 通過稱重生物反應(yīng)器監(jiān)測重量隨時間的損失。在反應(yīng)結(jié)束時，將發(fā)酵液于IOCTC加 熱5分鐘，冷卻并離屯、W分離未水解固體和發(fā)酵液體。然后用氣相色譜分析后者W測定其乙 醇濃度。
[0220] 評估由實施例4產(chǎn)生的混合物。用同樣添加有(6-葡萄糖巧酶的參考混合物進行對 照試驗用于比較：由菌株化847 A EGl ( A EGl)產(chǎn)生的混合物，和由用EG2參考基因再轉(zhuǎn)化的 菌株化847 AEGU AEGlcEG2)產(chǎn)生的混合物。
[0221] 圖5表示由菌株146〔4/7產(chǎn)生的混合物和由菌株191刖1/9(569 10^):22)產(chǎn)生的 混合物的SSF結(jié)果。
[0222] 圖5所示的結(jié)果表明，在100小時的過程中，表達146C4內(nèi)切葡聚酶的混合物和表達 191H11內(nèi)切葡聚酶的混合物的SSF進展(相同劑量的酶的乙醇產(chǎn)量)高于AEGl和AEGlcEG2 參考混合物。
[0223] 圖6表示由菌株22沈1/1、22沈1/2和22沈1/7產(chǎn)生的巧巾混合物（用兩個變體獲得的 平均結(jié)果)和由菌株225C7/7產(chǎn)生的混合物的SSF結(jié)果。
[0224] 圖6的結(jié)果表明，在100小時的過程中，表達222E1內(nèi)切葡聚酶的混合物和表達 225C7內(nèi)切葡聚酶的混合物的SSF進展等于且高于A EGl和A EG1CEG2參考混合物。
【主權(quán)項】
1. 一種分離或純化的多肽，其特征在于，與EG2參考蛋白的內(nèi)切葡聚酶活性相比，它的 內(nèi)切葡聚酶活性提高，所述多肽選自： i) 選自 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34的氨基酸序列； ii) 與序列SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:12、 SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:34具有至少 70%，優(yōu)選75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性百分比的氨基酸序列。2. -種純化或分離的核酸，其特征在于，它編碼至少一種如權(quán)利要求1所述的多肽。3. 如權(quán)利要求2所述的純化或分離的核酸，選自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33。4. 一種載體，其特征在于它包含如權(quán)利要求2或3所述的核酸。5. -種分離的宿主細胞，其特征在于它包含如權(quán)利要求2或3所述的核酸或如權(quán)利要求 4所述的載體。6. 如權(quán)利要求5所述的分離的宿主細胞，其特征在于，它選自木霉、曲霉、鏈孢霉、腐質(zhì) 霉、毀絲霉、金孢霉、青霉、鐮刀菌、高溫單孢菌、芽孢桿菌、假單胞菌、埃希氏菌、梭菌、纖維 單胞菌、鏈霉菌、耶氏酵母、畢赤醇母和酵母。7. 如權(quán)利要求5或6所述的分離的宿主細胞，其特征在于，它選自里氏木霉、綠色木霉、 康氏木霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、文氏曲霉、米曲霉、海棗曲霉、嗜熱毀絲霉、Chrysosporium lucknowense、粗糙脈孢菌、灰腐質(zhì)霉、嗜松青霉、草酸青霉、大腸桿菌、丙酮丁醇梭菌、糖解 梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、畢赤酵母、解脂耶氏酵母和釀酒酵母。8. 如權(quán)利要求1所述的多肽用于水解纖維素的用途。9. 如權(quán)利要求1所述的多肽用于生產(chǎn)生物燃料的用途。10. -種能夠作用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶組合物，所述酶組合物包含至少一種如權(quán) 利要求1所述的多肽。11. 一種用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續(xù)步驟： -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相； -在如權(quán)利要求10所述的酶組合物存在下水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以產(chǎn)生含有葡萄糖的 水解物； -發(fā)酵水解物中的葡萄糖以產(chǎn)生發(fā)酵液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。12. -種用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續(xù)步驟： -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相； -同時加入如權(quán)利要求10所述的酶組合物和發(fā)酵生物以產(chǎn)生發(fā)酵液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中發(fā)酵生物選自如權(quán)利要求6或7所述的宿主細胞。14. 一種用于從生物質(zhì)生產(chǎn)生物燃料的方法，其特征在于包含以下連續(xù)步驟： -將待水解的生物質(zhì)懸浮于水相； -加入一種或多種如權(quán)利要求5-7任一項所述的宿主細胞以及發(fā)酵生物和/或如權(quán)利要 求10所述的酶組合物以產(chǎn)生發(fā)酵液； -從發(fā)酵液中分離生物燃料。
【文檔編號】C12N9/42GK105874066SQ201480063718
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月21日
【發(fā)明人】A·馬爾若, S·布朗凱, C·佩爾西永, C·艾林哈克, C·于爾曼, O·邦宗, S·福爾, S·阿爾芒, M·勒農(nóng), M·佩蒂
【申請人】Ifp新能源公司, 普魯泰斯公司, 國家科學(xué)研究中心