一種降倍半萜類化合物及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種降倍半萜類化合物，所述降倍半萜類化合物是從豆科翅莢決明（Cassia alata L.）樹皮分離得到，命名為：7?異丙基?2,5?二甲氧基?1?甲基萘，英文名為：7?isopropyl?2,5?dimethoxy?1?methylnaphthalene，其分子式為C16H20O2，具有下述結(jié)構(gòu)：所述降倍半萜類化合物制備方法是以翅莢決明（Cassia alata L.）樹皮為原料，經(jīng)浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離得到。所述降倍半萜類化合物經(jīng)活性測試表明，對輪狀病毒具有很好的抑制作用。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎，且抗毒活性較好，可作為抗輪狀病毒藥物的先導(dǎo)化合物。
【專利說明】
一種降倍半萜類化合物及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種源于云南翅莢決明樹皮中降倍半萜 類化合物及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 翅莢決明（Cassia ahia L.)為豆科決明屬下的一個種。原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，廣 布于全世界熱帶地區(qū)，在我國分布于廣東和云南南部地區(qū)。該植物花色艷麗，有較高的觀賞 價值，常用作園林綠化樹種。同時，它也是重要的藥用植物，具有殺真菌、抗炎癥、抗病毒的 作用，可以用來治療皮膚病，是香皂、洗發(fā)液、洗液的常用原料之一。它的種子含有的皂角苷 可以作為驅(qū)除腸道寄生蟲的驅(qū)蟲劑;其葉水煎液常被用來治療高血壓、胃病、發(fā)燒、哮喘、毒 蛇咬傷、性病等。目前國內(nèi)外學(xué)者對翅莢決明進(jìn)行過一些研究，主要報道的化學(xué)成分有色 酮、黃酮、砲類、留體、生物堿等類化合物。倍半砲(sesquiterpenes)是指分子中含15個碳原 子的天然萜類化合物。倍半萜類化合物分布較廣，在植物體內(nèi)常以醇、酮、內(nèi)酯等形式存在 于揮發(fā)油中，是揮發(fā)油中高沸點(diǎn)部分的主要組成部分。多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，是醫(yī) 藥、食品、化妝品工業(yè)的重要原料。為充分利用我國豐富的資源，進(jìn)一步尋找新的活性天然 產(chǎn)物，我們對翅莢決明化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并從中分離到一個新的降倍半萜，該化合物具 有明顯的抗輪狀病毒活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎的降倍半萜類化合物，第二目的在于提 供所述降倍半萜類化合物的制備方法;第三目的在于提供所述降倍半萜類化合物在制備抗 輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述降倍半萜類化合物，是從翅莢決明（ 3仏以1^.)樹皮中分離得到，命名為7-異丙基-2,5-二甲氧基-1-甲基萘，英文名為7-isopropyl-2，5-dimethoxy-1-methylnaphthalene，其分子式為 Ci6H2〇〇2，具有下述結(jié)構(gòu)：
本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，所述降倍半萜類化合物是以翅莢決明（Cawia date L.)樹皮為原料，經(jīng)浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟，具體為： A、浸膏提取:將翅莢決明（Cassia ahia L.)樹皮粉碎到20~40目，用60~100%有機(jī)溶 劑浸泡并提取2~4次，每次12 h~72 h，合并提取液、過濾，減壓濃縮成浸膏； B、硅膠柱層析:浸膏用有機(jī)溶劑溶解后，用浸膏重量比1~1.6倍量的60~120目硅膠拌 樣，再用浸膏重量比2~5倍量的160~300目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比10:0~ 5:5的氯仿-甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液的9:1部分用硅膠層析柱繼續(xù)分離，用體積配比 15:1~2:1的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，將其先后劃分成6個部分，收集各部分洗脫液并 濃縮； C、高壓液相色譜分離:B步驟洗脫液的8:2部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化即得所 述的降倍半萜類化合物。
[0005] 以上述方法制備的降倍半萜類化合物的結(jié)構(gòu)是通過以下方法測定出來的： 本發(fā)明化合物為淺黃色膠狀物;紫外光譜（溶劑為甲醇），Amax (logs) 312 (3.76)、 260 (3·55)、220 nm;紅外光譜（溴化鉀壓片）vmax 3065、2942、1610、1548、1468、1352、 1253、1215、1143、985、821 cm-1;高分辨質(zhì)譜（HRES頂S)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 267.1353 []?+似]+(計算值267.1361)。結(jié)合1!1和13〇匪1?譜給出一個分子式(：16!12003，不飽和度為 7。紅外光譜數(shù)據(jù)證實化合物中存在芳環(huán)（1610、1548、1468(^1-1)功能團(tuán)，紫外光譜在312和 260 nm處有強(qiáng)吸收也證實化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從1H和13CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見表1)信號 可以看出化合物中有一個3,4,7,9_四取代的萘環(huán)(C-1~(：-10;!1-1，!1-2，!1-6和!1-8)、一個異 丙基（011~013 ;!1-11，!16-12，13)、1個甲基（(：-15，!13-15)、以及兩個甲氧基（(^56.19， 55.8 q;dH 3.84 s，3.78 s);這些信號表明化合物為10位降甲基的芳構(gòu)化桉葉烷類型降倍 半萜?；衔锏哪负说玫酱_認(rèn)后，剩余的甲基、異丙基和甲氧基為母核上的取代基。根據(jù)H-11和C-6、C-7、C-8，H-12，13和C-7，以及H-6、H-8和C-l 1的HMBC相關(guān)（圖3)可證實異丙基取代 在萘環(huán)的C-7位;根據(jù)甲基氫(H3-15)和C-3、C-4、C-5的HMBC相關(guān)，可證實甲基取代在母核的 C-4位;根據(jù)兩個甲氧基氫(dH 3.84 s，3.78 s)分別和C-3和C-9有HMBC相關(guān)，可證實兩個甲 氧基分別取代在母核的C-3和C-9位;至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。該化合物命名為:7_異 丙基-2,5-二甲氧基-1-甲基萘。
[0006] 表-1.化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)（溶劑為C5D5N)
本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，即將所述降倍半萜類化合物應(yīng)用于抗輪狀病毒藥物 的制備。
[0007] 本發(fā)明化合物是首次被分離出來的，通過核磁共振和質(zhì)譜測定方法確定為降倍半 萜類化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。經(jīng)對抗輪狀病毒的實驗，其TC 5Q值為248.5 pg/mL、IC50 值為8.62仰/mL，治療指數(shù)ΤΙ為28.8，超過陽性對照病毒唑的治療指數(shù)（19.16)，化合物具 有很好的抗輪狀病毒活性。以上結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗輪狀病毒藥物中有良 好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡單活性較好，可作為抗輪狀病毒藥物研發(fā)的先導(dǎo)性化 合物。
【附圖說明】
[0008] 圖1為本發(fā)明化合物的核磁共振碳譜； 圖2為本發(fā)明化合物的核磁共振氫譜； 圖3為本發(fā)明化合物的主要HMBC相關(guān)圖示。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010] 本發(fā)明所用原料不受地區(qū)和品種限制，任何來源的翅莢決明（Cassia alata L.) 樹皮均可以實現(xiàn)本發(fā)明，下面以來源于云南的翅莢決明（Cassia alata L.)樹皮原料對本 發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0011]除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0012]本發(fā)明所述的降倍半砲類化合物，是從翅莢決明（Cassia alata L.)樹皮中分離 得到，命名為7-異丙基-2，5-二甲氧基-1-甲基萘，英文名為7-isopropyl-2，5-dimethoxy-1-methylnaphthalene，其分子式為C16H2QO2,具有下述結(jié)構(gòu)：
本發(fā)明所述降倍半砲類化合物的制備方法，是以翅莢決明（Cassia alata L.)樹皮為 原料，經(jīng)浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟，具體為： A、浸膏提取:將翅莢決明（Cassia alata L.)樹皮粉碎到20~40目，用60~100%有機(jī)溶 劑浸泡并提取2~4次，每次12 h~72 h，合并提取液、過濾，減壓濃縮成浸膏； B、 硅膠柱層析:浸膏用有機(jī)溶劑溶解后，用浸膏重量比1~1.6倍量的60~120目硅膠拌 樣，再用浸膏重量比2~5倍量的160~300目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比10:0~ 5:5的氯仿-甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液的9:1部分用硅膠層析柱繼續(xù)分離，用體積配比 15:1-2:1的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，將其先后劃分成6個部分，收集各部分洗脫液并 濃縮； C、 高壓液相色譜分離:B步驟洗脫液的8:2部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化即得所 述的降倍半萜類化合物。
[0013] 所述A步驟中有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇或丙酮與水的混合物。
[0014] 所述A步驟中有機(jī)溶劑與樹皮的重量比是1.5~4:1。
[0015] 所述B步驟的有機(jī)溶劑是純甲醇、純乙醇或純丙酮。
[0016] 所述B步驟中的氯仿-甲醇溶液體積配比為10:0、9:1、8:2、7:3、6:4和5:5。
[0017] 所述C步驟中高壓液相色譜分離純化是采用21.2 mm X 250 mm，5 μL?的C18色譜 柱，流動相為52wt%的甲醇水溶液，流動相流速為12 mL/min，紫外檢測器檢測波長為312 nm，每次進(jìn)樣60~150 yL，收集38.4 min的色譜峰，多次累加后蒸干。
[0018] 所述C步驟中高壓液相色譜是指使用時壓力在5-15 Mpa的反相制備色譜。
[0019] 所述C步驟中高壓液相色譜分離純化后的物質(zhì)再次用甲醇溶解，再以甲醇溶液為 流動相，用凝膠柱層析分離，以進(jìn)一步分離純化。
[0020] 本發(fā)明所述降倍半萜類類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。
[0021] 實施例1 所用翅莢決明樹皮采于云南德宏。將樹皮取樣3.0 kg粉碎以70%的丙酮/水提取3次，每 次提取24 h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏150 g。浸膏用重量比180 g的純甲 醇溶解后用200 g的80目粗硅膠拌樣，1.0 kg的160目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配 比為10:0、9:1、8 :2、7:3、6:4、5:5的氯仿-甲醇梯度洗脫，將其中體積配比為9:1的氯仿-甲 醇洗脫部分進(jìn)一步用15:1-2:1的一系列氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，將其先后劃分成6個 部分，其中8:2洗脫部分用安捷侖1100半制備高效液相色譜分離，以52 %的甲醇水溶液為流 動相，Zorbax SB_Ci8 (21.2 X250 mm, 5 μπι)制備柱為固定相，流動相流速為12 ml/min， 紫外檢測器檢測波長為312 nm，每次進(jìn)樣125 yL，收集停留時間為38.4 min的色譜峰，多次 累加后蒸干，即得本發(fā)明所述的降倍半萜類化合物粗品；該粗品再用純甲醇溶解，以純甲醇 為流動相，用葡聚糖凝膠柱層析純化可得純品。
[0022] 實施例2 翅莢決明樹皮來源于云南西雙版納。將樹皮取樣3.5 kg切碎，以95%的乙醇提取3次，每 次提取48 h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏140 g。浸膏用重量比2.0倍量的純 甲醇溶解后用150 g的80目粗硅膠拌樣，0.9 kg的200目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積 配比為10:0、9:1、8: 2、7 : 3、6 :4、5: 5的氯仿-甲醇梯度洗脫，將其中用體積配比為9:1的氯 仿-甲醇洗脫先后劃分成6個部分，其中8:2洗脫部分用安捷侖1100半制備高效液相色譜分 離，以52%的甲醇水溶液為流動相，Zorbax SB-C18 (21.2 X 250 mm，5 μπι)制備柱為固定 相，流動相流速為12 ml/min，紫外檢測器檢測波長為312 nm，每次進(jìn)樣100 yL，收集停留時 間為38.4 min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得本發(fā)明所述的降倍半萜類化合物。為了進(jìn)一 步提純，還可以將所得產(chǎn)物用甲醇溶液溶解，再以甲醇溶液為流動相，用Sephadex LH-20 凝膠柱層析分離，即得更高純度的該新化合物。
[0023] 實施例3 取實施例1制備的化合物，為淺黃色膠狀物。本發(fā)明所制備的降倍半萜類化合物的結(jié)構(gòu) 是通過以下方法測定出來的：紫外光譜（溶劑為甲醇），Amax (logi) 312 (3.76)、260 (3·55)、22〇 nm;紅外光譜（溴化鉀壓片）vmax3〇65、2942、1610、1 548、1468、1352、1253、 1215、1143、985、821 cm-S高分辨質(zhì)譜（HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰《/z 267.1353 [M+ 似]+(計算值267.1361)。結(jié)合1!1和130匪1?譜給出一個分子式(： 16!12()03，不飽和度為7。紅外 光譜數(shù)據(jù)證實化合物中存在芳環(huán)（1610、1548、1468 cm-4功能團(tuán)，紫外光譜在312和260 nm 處有強(qiáng)吸收也證實化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從1Η和13CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見表1)信號可以看出 化合物中有一個3,4,7,9_四取代的萘環(huán)(C-1~〇10;!1-1，!1-2，!1-6和!1-8)、一個異丙基((：-11 ~〇-13;!1-11，!1 6-12，13)、1個甲基（(：-15，!13-15)、以及兩個甲氧基（冼56.19,55.8 9;出 3.84 s，3.78 s);這些信號表明化合物為10位降甲基的芳構(gòu)化桉葉烷類型降倍半萜?；?物的母核得到確認(rèn)后，剩余的甲基、異丙基和甲氧基為母核上的取代基。根據(jù)Η-ll和C-6、C- 7、08，!1-12，13和(：-7，以及!1-6、!1-8和(：-11的圓8(：相關(guān)（圖3)可證實異丙基取代在萘環(huán)的(：-7位;根據(jù)甲基氫(H 3-l 5)和C-3、C-4、C-5的HMBC相關(guān)，可證實甲基取代在母核的C-4位;根據(jù) 兩個甲氧基氫（<? 3.84 s，3.78 s)分別和C-3和C-9有HMBC相關(guān)，可證實兩個甲氧基分別取 代在母核的C-3和C-9位;至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。該化合物命名為:7-異丙基-2，5-二甲氧基-1-甲基萘。
[0024] 實施例4 取實施例2制備的化合物，為淺黃色膠狀物。測定方法與實施例3相同，確認(rèn)實施例2制 備的化合物為所述的降倍半萜類化合物一一7-異丙基-2,5-二甲氧基-1-甲基萘。
[0025] 實施例5 取實施例1~2制備的任一降倍半萜類化合物進(jìn)行抗輪狀病毒活性試驗，試驗情況如下： 抗輪狀病毒采用體外細(xì)胞測試法，即樣品與病毒同時作用于MA104細(xì)胞后，通過 Alarmablue法檢測樣品對病毒感染致細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，從而測定樣品對HRV的活性作 用。
[0026]藥物的細(xì)胞毒性檢測 MA104細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，加入不同濃度的樣品液，繼續(xù)培養(yǎng) 3天后，更換含Alamarblue的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2~3小時后檢測其530/590nm處的焚光值，從 而檢測樣品對MA104細(xì)胞的毒性，并計算半數(shù)細(xì)胞毒濃度(TC 50)。
[0027] 藥物抗輪狀病毒作用檢測 MA104細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，100TCID50的病毒液和不超過20% 細(xì)胞毒性的梯度濃度藥物溶液同時加到MA1 04細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天后，更換含 Alamarblue的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2~3小時后檢測其530/590nm處的熒光值，并計算半數(shù)抑制濃 度(IC50) 〇
[0028] 根據(jù)TC5Q/ IC5Q計算化合物的治療指數(shù) 結(jié)果表明，本發(fā)明化合物的TC5Q值為248.5 ；7g/mL、IC5()值為8.62 pg/mL，治療指數(shù)TI為 28.8,其治療指數(shù)超過對照病毒唑的治療指數(shù)19.16,說明化合物具有很好的抗輪狀病毒活 性。
【主權(quán)項】
1. 一種降倍半砲類化合物，其特征在于所述降倍半砲類化合物是從翅莢決明（Cassia 3仏以1^.)樹皮中分離得到，命名為7-異丙基-2,5-二甲氧基-1-甲基萘，英文名為7-isopropyl-2，5-dimethoxy-1-methylnaphthalene，其分子式為 Ci6H2〇〇2，具有下述結(jié)構(gòu)：2. -種權(quán)利要求1所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于以翅莢決明（Cawia date L.)樹皮為原料，經(jīng)浸膏提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜分離步驟，具體為： A、浸膏提取:將翅莢決明（Cassia ahia L.)樹皮粉碎粉碎到20~40目，用60~100%有 機(jī)溶劑浸泡并提取2~4次，每次12 h~72 h，合并提取液、過濾，減壓濃縮成浸膏； B、 硅膠柱層析：浸膏用有機(jī)溶劑溶解后，用浸膏重量比卜1.6倍量的60~120目硅膠拌 樣，再用浸膏重量比2~5倍量的160~300目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比10:0~ 5:5的氯仿-甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液的9:1部分用硅膠層析柱繼續(xù)分離，用體積配比 15:1~2:1的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，將其先后劃分成6個部分，收集各部分洗脫液并 濃縮； C、 高壓液相色譜分離:B步驟洗脫液的8:2部分進(jìn)一步用高壓液相色譜分離純化即得所 述的降倍半萜類化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述A步驟中有機(jī)溶 劑是乙醇、甲醇或丙酮與水的混合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述A步驟中有機(jī)溶 劑與樹皮的重量比是1.5~4:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述B步驟的有機(jī)溶 劑是純甲醇、純乙醇或純丙酮。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述B步驟中的氯 仿-甲醇溶液體積配比為10: 〇、9: 1、8:2、7:3、6:4和5: 5。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述C步驟中高壓液 相色譜分離純化是采用21.2 mm X 250 mm，5加的C18色譜柱，流動相為52wt%的甲醇水溶 液，流動相流速為12 mL/min，紫外檢測器檢測波長為312 nm，每次進(jìn)樣60~150 A，收集 38.4 min的色譜峰，多次累加后蒸干。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述C步驟中高壓液 相色譜是指使用時壓力在5-15 Mpa的反相制備色譜。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述降倍半萜類化合物的制備方法，其特征在于所述C步驟中高壓液 相色譜分離純化后的物質(zhì)再次用甲醇溶解，再以甲醇溶液為流動相，用凝膠柱層析分離，以 進(jìn)一步分離純化。10. -種權(quán)利要求1所述降倍半萜類類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07C41/36GK105884588SQ201610242831
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】秦瑞欣
【申請人】秦瑞欣