一種與植物雄性育性相關的蛋白及其編碼基因與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與植物雄性育性相關的蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的ZmIAP1基因在玉米中能夠控制雄性育性，即該基因的純合突變或缺失能夠使玉米雄性不育，在該基因突變或缺失的材料中正常表達ZmIAP1基因能夠恢復雄性育性。本發(fā)明為植物特別是玉米的雄性育性研究提供了新的基因資源，其在玉米制種領域利用細胞核雄性育性基因創(chuàng)制不育系和保持系的應用中將發(fā)揮重要作用。
【專利說明】
一種與植物雄性育性相關的蛋白及其編碼基因與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及一種與植物雄性育性相關的蛋白及其編碼基 因與應用。
【背景技術】
[0002] 玉米是一種雜種優(yōu)勢十分明顯的作物，生產(chǎn)上普遍使用雜交種，因此每年都需要 制種。在制種過程中，由于玉米是異花授粉作物，為了保證種子純度，制種所用的母本需要 去雄。如果母本自身雄性不育，則無需去雄，既節(jié)省人力成本又避免了由于去雄不徹底所帶 來的制種純度降低。玉米的雄性不育，包括質(zhì)核互作的雄性不育和細胞核基因雄性不育。在 玉米雄性組織的生長發(fā)育直至產(chǎn)生有活性花粉的過程中，任何一個細胞核雄性育性基因發(fā) 生突變，都有可能導致雄性不育。這些細胞核雄性育性基因突變導致的雄性不育可分為顯 性核不育和隱性核不育，且以隱性核不育居多。
[0003] 目前克隆的玉米細胞核雄性育性基因包括MS8(Wang et al. ,2013，Plant Reprod.26:329-338)、MS9(專利號：US20150191743)、MS22/MSCAl(Chaubal et al. ,2003， Planta 216:778-788，專利號：US20090038028、EP2631243A2)、MS26(專利號：US7098388)、 MS32(Moon et al.，2013，Plant Journal 76:592-602)、MS45(Albertsen et al.,1993， Proc Annu Corn Sorghum Ind Res Conf 48:224-233)nAMI(Pawlowski et al.,2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:3603-3608)nMACI(Wang et al.,2012development 139: 2594-2603)、0CL4(Vanessa et al.，2009，Plant Journal 59:883-894)。其中有些基因由 于其突變導致雄性不育嚴格徹底且對玉米其他性狀沒有明顯的負面影響，可以在玉米制種 過程中得以利用。例如MS22、MS26、MS45已獲得美國或歐洲專利保護。在我國，以MS 1、MS7、 MS30為基礎的不育系保持和繁殖方法專利也已公開（專利號：CN104823840A、 CN105039316A、CN105018475A)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種與植物雄性育性相關的蛋白及其編碼基因與應用。
[0005] 本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為ZmlAPl，來源于玉米屬的玉米(Zea mays L.)，是 如下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] (b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加，且與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 序列表序列1為ZmlAPl的氨基酸序列，包括582個氨基酸，在該蛋白質(zhì)序列中，疏水 氨基酸占263個，親水氨基酸占266個，堿性氨基酸占70個，酸性氨基酸占52個，該蛋白質(zhì)的 分子量為63.43KD，等電點為8.73。
[0009] 為了便于上述(a)中所示蛋白質(zhì)的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列 組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標簽。
[0010] 表:標簽的序列
[0012] 上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個 氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變。
[0013] 編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0014] 所述核酸分子可以是DNA，如CDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0015] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述蛋白質(zhì)的基因（命名為 ZmlAP1)，所述基因具體可為如下1) -6)中任一的DNA分子：
[0016] 所述基因為如下1)_6)中任一的DNA分子：
[0017] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0018] 2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列3的第249-1997位所示的DNA分子；
[0020] 4)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0021] 5)在嚴格條件下與1)-4)中任一限定的DNA分子雜交且編碼與植物雄性育性相關 的由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0022] 6)與1)-5)中任一限定的DNA序列具有90%以上同一性，且編碼與植物雄性育性相 關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0023] 其中，序列2為ZmlAPl基因在玉米基因組中的序列；序列3為ZmlAPl基因的cDNA序 列，第249-1997位為CDS。
[0024]含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生物也屬于本發(fā) 明的保護范圍。
[0025] 所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0026]所述重組表達載體可用現(xiàn)有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元農(nóng) 桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物表達 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工 或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使用所 述基因構建重組表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織 特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、泛素基因 Ubiquitin啟動 子(pUbi)、脅迫誘導型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用； 此外，使用本發(fā)明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增 強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列 的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣 泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結構基因。 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如 加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素 標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化 植株。
[0027] 在本發(fā)明中，所述重組表達載體為將ZmlAPl基因插入到pCAMBIA3300載體的多克 隆位點（如ΚρηΙ和Hindm)處后得到的重組質(zhì)粒。更加具體的，為將pCAMBIA3300載體的酶切 位點ΚρηΙ和Hindm之間的小片段替換為序列表中序列4的第1406-6601位所示DNA片段后得 到的重組質(zhì)粒(命名為p3300-ZmIAPl)。
[0028] 所述表達盒由能夠啟動所述基因表達的啟動子，所述基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組 成。
[0029] 所述轉(zhuǎn)基因細胞系為轉(zhuǎn)入所述基因的非繁殖材料。
[0030] 所述蛋白質(zhì)或所述核酸分子或所述重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生 物在如下任一中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：
[0031] (a)植物育種和/或制種；
[0032] (b)調(diào)控植物雄性育性。
[0033]所述(a)中的應用可以是轉(zhuǎn)基因的，也可以是非轉(zhuǎn)基因的。其中"非轉(zhuǎn)基因"的應 用，可為:利用所述ZmlAPl基因培育不育系。不育系的雄性不育性狀是由于植物體內(nèi)表達有 功能的所述ZmlAPl蛋白的能力喪失或降低引起的，所述ZmlAPl基因為純合態(tài)aa。"轉(zhuǎn)基因" 的應用可為:將保持系和不育系合二為一成為兩用系，需要以不育系為基礎導入所述正常 有功能的ZmlAPl基因，在后代中可分離出不育系和兩用系。所述應用可以是對所述ZmlAPl 基因（正常有功能）的利用，也可以是所述ZmlAPl基因（降低或喪失功能）的利用。
[0034]所述(b)中，所述調(diào)控植物雄性育性可為提高植物雄性育性或降低植物雄性育性。
[0035] 本發(fā)明還提供了培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0036] 本發(fā)明所提供培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可為如下(A)或(B):
[0037] (A)培育雄性可育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：
[0038] (al)向雄性不育的受體植物中導入ZmlAPl蛋白的編碼基因，得到表達所述編碼基 因的轉(zhuǎn)基因植物;所述受體植物的雄性不育性狀是由于所述受體植物表達有功能的所述 ZmlAPl蛋白的能力喪失或降低引起的；
[0039] (a2)從步驟(al)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性可育的轉(zhuǎn)基因植物；
[0040] (B)培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：
[00411 (b 1)抑制雄性可育的受體植物中ZmlAP 1蛋白的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；
[0042] (b2)從步驟(bl)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物。
[0043]在所述方法(A)的步驟（al)中，所述編碼基因可通過以上重組表達載體p3300-ZmlAPl導入所述受體植物；
[0044]在所述方法(B)步驟(bl)中，是通過如下實現(xiàn)抑制所述受體植物中所述編碼基因 的表達的：采用CRISPR/Cas9核酸酶對所述受體植物中編碼ZmlAPl蛋白的基因組DNA序列進 行特異性剪切，使所述受體植物喪失或降低表達有功能的ZmlAPl蛋白的能力。
[0045] 其中，所述CRI SPR/Cas9核酸酶對所述受體植物中編碼ZmlAP1蛋白的基因組DNA序 列進行特異性剪切時的靶標片段為所述受體植物中編碼ZmlAPl蛋白的基因組DNA序列中符 合5 ' -Nx-NGG-3 '或5 ' -CCN-Nx-3 '序列排列規(guī)則的片段;N表示A、G、C和T中的任一種，14 < X < 30,且X為整數(shù)(如X為20)，Nx表示X個連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。更加具體的，所述靶標片段為 所述受體植物中編碼Zml AP 1蛋白的基因組DNA序列中的"5 ' -GAACGCGCGGGCCCGGGTGCTGG-3 ' (即序列2的第701-723位)"。
[0046] 在本發(fā)明中，所述雄性不育為"盛花期花藥不外掛"和/或"花藥內(nèi)沒有經(jīng)1%I2-KI 染色鑒定為有活力的花粉"。
[0047] 在本發(fā)明中，所述植物既可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。其中，所述單子葉 植物如禾本科植物，具體如玉米。
[0048] 在培育雄性可育轉(zhuǎn)基因植物時，可將玉米突變體ms*_6044作為所述受體植物，獲 得相應的雄性可育轉(zhuǎn)基因玉米；當然也可以像本發(fā)明的一個實施例一樣，將含有所述 ZmlAPl基因的載體轉(zhuǎn)化到玉米品種ΗΠΙ中，然后再將轉(zhuǎn)基因陽性植株與玉米突變體ms*-6044雜交兩次，選擇定位區(qū)間內(nèi)基因組背景為ms*-6044且轉(zhuǎn)基因為陽性的植株，即為相應 的雄性可育轉(zhuǎn)基因玉米。
[0049] 在本發(fā)明的另一個實施例中，培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物時采用的所述受體植物具 體為玉米品種Hi Π 。
[0050] 本發(fā)明利用圖位克隆的策略，用玉米雄性不育突變體ms*-6044與玉米自交系B73 和/或自交系鄭58組配BCfi群體，將控制這一突變性狀的基因定位到玉米一號染色體 80.96cM到81. lcM之間，以公布的B73基因組測序結果為參考物理距離約為140kb，共包括四 個基因。其中基因號為GRMZM2G434500的序列在突變體與玉米自交系B73/鄭58之間存在差 異，突變體有一個1.3kb的插入，B73和鄭58沒有這一插入，基因編碼蛋白可以正確翻譯，將 此基因命名為ZmlAPl。用轉(zhuǎn)基因技術將ZmlAPl基因在上述玉米雄性不育突變體中互補表 達，可以恢復其雄性育性。用CRISPR-Cas9基因編輯技術將玉米雄性育性正常的材料Hill的 ZmlAPl基因敲除，可以使Hi Π 的雄性育性喪失，不能產(chǎn)生有活性的花粉。
[0051 ]本發(fā)明的ZmlAPl基因在玉米中能夠控制雄性育性，即該基因的純合突變或缺失能 夠使玉米雄性不育，在該基因突變或缺失的材料中正常表達ZmlAPl基因能夠恢復雄性育 性。
[0052]本發(fā)明為玉米雄性育性研究提供了新的基因資源，其在玉米制種領域利用細胞核 雄性育性基因創(chuàng)制不育系和保持系的應用中將發(fā)揮重要作用。
【附圖說明】
[0053] 圖1為玉米突變體ms*-6044與野生型的表型對比圖。其中，A、C、E、G為野生型，B、D、 F、H為ms*-6044突變體。A和B，植株形態(tài);C和D，雄穗花藥外掛情況;E和F，花藥形態(tài);G和Η，花 粉1%Ι2-ΚΙ染色。
[0054] 圖2為ZmlAPl基因圖位克隆圖。
[0055]圖3為ZmlAPl基因結構及其在玉米突變體ms*-6044中插入位點示意圖。
[0056]圖4為構建互補載體PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0057] 圖5為PCR產(chǎn)物經(jīng)ΚρηΙ和Hindm雙酶切后的電泳圖。
[0058] 圖6為ZmlAPl基因遺傳互補驗證圖。其中，A:轉(zhuǎn)基因后代群體配制示意圖；B:基因 型為aaBb植株的雄性可育表型；C:轉(zhuǎn)基因檢測（3、4、5是基因型為aaBb的植株，經(jīng)鑒定為轉(zhuǎn) 基因陽性，1是對照，即轉(zhuǎn)化玉米受體ΗΠΙ時用的p3300-ZmIAPl質(zhì)粒作為模板擴增所得的陽 性對照）;D:基因型為aaBb植株的花粉1 % I2-KI染色。
[0059]圖7為ZmlAPl基因敲除驗證圖。其中，A:基因敲除靶點序列;B:轉(zhuǎn)基因植株的PCR酶 切驗證，1-4為轉(zhuǎn)基因植株，CK為野生型，PCR產(chǎn)物大小為805bp，被Smal酶切后產(chǎn)生大小為 574bp和231bp的兩個片段;C:野生型與轉(zhuǎn)基因植株PCR產(chǎn)物測序和編碼氨基酸序列比較;D: 轉(zhuǎn)基因陽性植株盛花期雄穗;E:轉(zhuǎn)基因陽性植株花藥1 % I2-KI染色;F:轉(zhuǎn)基因陰性植株盛 花期雄穗;G:轉(zhuǎn)基因陰性植株花粉1 % Ι2-ΚΙ染色。
【具體實施方式】
[0060] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0061] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0062] 玉米突變體ms*_6044:由Maize Genetics Cooperation Stock Center保存，Co-op ID: 104G;Description: 104G ms*_6044。該玉米突變體在該保藏中心的具體網(wǎng)頁鏈接如 下：http: //www .maizegdb · org/data_center/stock?id = 130311 〇
[0063] pBUN411 載體：在文獻"Hui-Li Xing,Li Dong,Zhi-Ping Wang,Hai-Yan Zhang, Chun-Yan Han,Bing Liu，Xue_Chen Wang,Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14:327-338 (2014)"中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得，僅可用于重復本發(fā) 明實驗。該質(zhì)?？赏瑫r用于轉(zhuǎn)錄向?qū)NA和表達Cas9蛋白。
[0064] 實施例1、玉米雄性育性基因 ZmlAPl的圖位克隆
[0065] 一、玉米突變體ms*_6044的表型
[0066]與正常植株相比，玉米突變體ms*-6044在植株整體形態(tài)方面沒有異常（圖1中A和 B)，但是其雄穗的花藥不外掛（圖1中C和D)，經(jīng)解剖其花藥干癟瘦?。▓D1中E和F)，花藥內(nèi)部 用1 % I2-KI溶液染色未觀察到飽滿成熟的花粉粒（圖1中G和H)，表現(xiàn)為徹底的雄性不育現(xiàn) 象。該現(xiàn)象在北京和海南連續(xù)4年觀察表型一致，不育特性穩(wěn)定，且在大田條件下肉眼即可 區(qū)分是否為雄性不育。
[0067]二、遺傳定位群體的構建
[0068] 以玉米突變體ms*-6044為母本，以玉米自交系B73或鄭58為父本組配F!，F(xiàn)!田間表 型均為雄性可育。而后以玉米突變體ms*-6044為母本，以Fi為父本構建回交群體(BCiFi)， B&Fi群體在田間可分為雄性可育個體和雄性不育個體兩種類型，且兩種類型的比例經(jīng)卡方 檢驗符合1:1(表1)。由此推測玉米突變體ms*-6044的表型由隱性單基因控制，并將B&Fi群 體做為遺傳定位群體。
[0069] 表1 B&F!群體不同表型個體的比例統(tǒng)計
[0070]
[0072] X〇.〇52(l) = 3.84
[0073] 三、ZmlAPl基因的定位
[0074] 首先，以玉米突變體ms*-6044和玉米自交系B73、鄭58的基因組DNA為模板，用玉米 全基因組引物篩選在突變體和自交系之間有多態(tài)性的引物。然后，從BQFi群體中選取雄性 可育單株和雄性不育單株各10株，驗證多態(tài)性引物是否與雄性育性性狀連鎖。篩選出連鎖 引物，用于對BQFi群體的1060個單株測定基因型，從而結合雄性育性表型篩選出表型與基 因型不符的為交換單株，并根據(jù)不同引物篩選出的交換單株個數(shù)的不同，依照減少趨勢確 定定位區(qū)間，由此將ZmlAPl基因定位在位于一號染色體的引物標記K204(80.92Mb)和K265 (81.931^)之間。在1(204和1(265之間繼續(xù)開發(fā)多態(tài)性分子標記，并用于檢測隊正 1群體的所有 單株，最終將ZmlAPl基因定位在K168(80.96Mb)和K163(81.1Mb)之間，參考已公布的玉米自 交系B73基因組測序結果，物理距離約為140kb(圖2)。其中，用于基因定位的分子標記引物 序列如表2所示。
[0075] 表2用于基因定位的分子標記引物序列
[0078] 四、ZmlAPl基因的克隆
[0079] 參考玉米基因組測序信息，定位區(qū)間的14 0 k b范圍內(nèi)包含4個基因，分別是 GRMZM2G434514、GRMZM2G133968、GRMZM2G434500、GRMZM2G133943。以雄性可育單株和雄性 不育單株的基因組DNA為模板，擴增這4個基因并比較其序列差異，發(fā)現(xiàn)只有GRMZM2G434500 基因在雄性可育單株和雄性不育單株之間存在DNA序列上的差異。相對于雄性可育單株，雄 性不育單株在GRMZM2G434500基因的第三外顯子的第691位堿基處，存在一個1331bp的插入 (圖3)。因此推測候選基因 GRMZM2G434500即為要克隆的ZmlAPl基因。
[0080] 以玉米自交系B73的基因組DNA為模板，采用引物對F1/R1進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn) 物的序列為序列表中序列2,序列2即為ZmlAPl基因在玉米基因組中的序列。提取玉米自交 系B73的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用引物對F2/R2進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn)物的序列為序列 表中序列3,序列3即為ZmlAPl基因的cDNA序列，其中第249-1997位為CDS。序列2和序列3均 編碼序列表中序列1所不的ZmlAPl蛋白。
[0081 ] FI:5 '-CTCACAGCAAATTCGTCTCAC-3 '；
[0082] R1:5'-TTAAAATTAAGGGAAAATTAAATAG-3'。
[0083] F2:5 '-TCGTCATCCAGCTCCGTT-3 '；
[0084] R2:5 '-GCCTAGTCCCTAGACCATGCTGAA-3 '。
[0085] 實施例2、玉米雄性育性基因 ZmlAPl的功能驗證(互補實驗）
[0086] 一、互補載體的構建
[0087] 設計針對ZmlAPl基因的基因組序列的特異引物。具體序列為：
[0088] Pl-F:5 '-CCAAGGGTGACAGAATACA-3 '；
[0089] P1-R:5，-ATTGCGATGGGAGCGTAT-3，。
[0090] 其中，P1-F位于ZmlAPl基因起始密碼子ATG上游3323bp，Pl-R位于ZmlAPl基因終止 密碼子下游1404bp。
[0091]以玉米自交系B73的基因組DNA為模板，采用引物對P1-F/P1-R進行PCR擴增，擴增 獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶（圖4)。進一步將目標條帶膠回收 測序，顯示其序列如序列表中序列4所示。
[0092] 將此PCR產(chǎn)物(序列4)用ΚρηΙ和Hindm雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過1.0%的凝膠電泳檢 測，如圖5所示，得到兩條條帶，長度分別為5.2kb和1.3kb左右，將5.2kb(上游1919bp+ ZmlAPl基因1922bp+下游1358bp，即序列表中序列4的第1405-6602位）的目的條帶回收，與 經(jīng)同樣雙酶切的PCAMBIA3300的骨架大片段相連，經(jīng)酶切和測序鑒定，構建成為互補載體 p3300-ZmIAPl〇
[0093] 重組表達載體p3300-ZmIAPl的結構描述:將pCAMBIA3300載體的酶切位點ΚρηΙ和 Hindm之間的小片段替換為序列表中序列4的第1406-6601位所示DNA片段后得到的重組質(zhì) 粒。
[0094] 二、玉米遺傳轉(zhuǎn)化實驗
[0095]由天津吉諾沃生物科技有限公司完成重組表達載體p3300-ZmIAPl向玉米雜交種 Hi Π 的遺傳轉(zhuǎn)化，具體的轉(zhuǎn)化方法是常規(guī)的農(nóng)桿菌介導的玉米幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化。
[0096]三、轉(zhuǎn)基因后代群體配制
[0097]為鑒定ZmlAPl基因的功能，將轉(zhuǎn)p3300-ZmIAPl載體的To代轉(zhuǎn)基因植株配制成群 體。
[0098] 在此，將玉米基因組上正常的ZmlAPl基因以基因型AA表示，突變的zmiapl基因以 基因型aa表示。玉米受體Hi Π 是雄性育性正常的材料，因此ZmlAPl基因在Hi Π 中的基因型 是AA，而在玉米突變體ms*-6044中的基因型是aa。同時，將轉(zhuǎn)基因陰性植株或非轉(zhuǎn)基因植株 的基因型以bb表示，將轉(zhuǎn)基因陽性植株（即含有ZmlAPl基因的互補載體片段已整合到玉米 基因組上）以B表示，那么轉(zhuǎn)基因雜合植株的基因型是Bb，轉(zhuǎn)基因純合植株的基因型是BB。
[0099]轉(zhuǎn)基因后代群體的配制（圖6中A)，首先以To代轉(zhuǎn)基因陽性植株(AABb)為父本，玉 米突變體ms*_6044 (aabb)為母本，組配Fi Τι群體包含兩種基因型，即AaBb和Aabb。提取Fi各 個單株的基因組DNA鑒定其是否為轉(zhuǎn)基因陽性(B)。選擇轉(zhuǎn)基因陽性植株即AaBb基因型單株 為父本，以玉米突變體ms*-6044(aabb)為母本，再次雜交，其后代共產(chǎn)生四種基因型:AaBb、 Aabb、aaBb、aabb。其中aaBb基因型的單株，在玉米基因組上一號染色體定位區(qū)間內(nèi)的基因 型為aa(確定方法是通過在定位區(qū)間兩側(cè)的連鎖的多態(tài)性分子標記，即定位區(qū)間右端K10和 定位區(qū)間左端K57,來擴增單株的基因組DNA，得到的條帶帶型與ΗΠΙ-樣，就認為這一段來 自把11，得到的條帶帶型與1118*-6044-樣，就認為這一段來自1118*-6044。我們將211114?1基因 兩側(cè)的分子標記都用來做這個檢測，兩側(cè)的分子標記都同時是ms*-6044材料的帶型，就確 定這一段基因組DNA來自突變體ms*-6044，如果基因組DNA雙鏈都是來自ms*-6044，那么在 這一區(qū)間內(nèi)的目的基因的基因型就是aa)，由此對應的表型應為雄性不育，然而由于轉(zhuǎn)基因 陽性(Bb)使得玉米基因組上整合了 ZmlAPl基因，aaBb基因型的單株的表型實則應為雄性可 育。
[0100] 其中，確定是否為轉(zhuǎn)基因陽性的方法具體如下：將轉(zhuǎn)基因后代群體中的單株提取 基因組DNA，以此為模板，以P2-F和P2-R為引物，擴增獲得大小1396bp的目的條帶為轉(zhuǎn)基因 陽性，無此條帶為轉(zhuǎn)基因陰性。同時以轉(zhuǎn)化前的p3300-ZmIAPl質(zhì)粒為模板進行擴增，做為陽 性對照。
[0101] P2-F:5'-CTCCACCATGTTATCACATCAATCC-3'（位于pCAMBIA3300載體上啟動標記基 因的CaMV35S啟動子上）
[0102] P2-R:5'-CGTCTTTGTCTTTCGCGTAGC-3'（位于p3300-ZmIAPl的酶切位點ΚρηΙ和Hind ΙΠ 之間的插入片段上，即序列4的第2185-2205位的反向互補序列）。
[0103 ]圖6中C的泳道3、4、5為鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性的基因型為aaBb的植株，泳道1是以轉(zhuǎn)化 前的p3300-ZmIAPl質(zhì)粒為模板的結果，是陽性對照。
[0104] 其中，植株表型是否為雄性可育，具體通過如下兩種方法鑒定：1、觀察盛花期雄穗 的花藥是否外掛，不外掛為雄性不育，外掛為雄性可育。2、花藥內(nèi)部用1%I 2-KI溶液染色， 未觀察到黑色圓形飽滿成熟的花粉粒為雄性不育，觀察到黑色圓形飽滿成熟的花粉粒為雄 性可育。
[0105] 最終，本發(fā)明檢測的4個轉(zhuǎn)化事件共63個aaBb基因型單株其表型均為雄性可育（圖 6中B和D，圖中顯示盛花期花藥飽滿且外掛，花藥內(nèi)經(jīng)1%I 2-KI染色全部花粉均呈現(xiàn)黑色圓 形飽滿狀，鑒定為有活力的花粉），同時分離出的33個aabb基因型單株的表型均為雄性不育 (盛花期花藥干癟且不外掛，花藥內(nèi)沒有經(jīng)1%I 2-KI染色鑒定為有活力的花粉）。由此得出， 轉(zhuǎn)化的ZmlAPl基因可以互補ms*-6044純合突變的雄性育性表型。
[0106] 實施例3、玉米雄性育性基因 ZmlAPl的功能驗證(敲除實驗）
[0107]除了上述互補實驗，本發(fā)明的發(fā)明人還設計實驗將玉米雄性育性正常的植株中的 ZmlAPl基因進行編輯。具體是米用CRISPR_Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated 9)基因編輯系統(tǒng)，對玉米受體植株中ZmlAPl基 因的基因組序列進行定點編輯。CRISPR-Cas9技術可針對基因組上特定位點DNA進行切割， 利用生物體對DNA鏈的修復無法每次都保證100 %正確的特點，重新連接的DNA鏈在序列上 與未被切割前會產(chǎn)生差異，從而使得基因序列發(fā)生變化，其編碼的蛋白質(zhì)也隨之變化。
[0108] 具體到本實驗中，根據(jù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特點，選取ZmlAPl基因的第二外顯子上 含有Smal酶切位點的特定序列做為 SgRNA(single guide RNA)靶點序列（圖7中A)，并將其 連入到PBUN411載體(除草劑抗性），構建成為ZmlAPl基因敲除載體，并采用農(nóng)桿菌介導的方 法轉(zhuǎn)化玉米受體Hi Π 。該部分的載體構建和玉米遺傳轉(zhuǎn)化工作是委托天津吉諾沃生物科技 有限公司完成的。具體操作如下：
[0109] (1)設計靶位點
[0110] 5' -GAACGCGCGGGCCCGGGTGCTGG-3'（即序列2的第701-723位）。
[0111] 由于該靶位點序列中含有Smal酶切識別序列(斜體下劃線的序列），可以被Smal限 制性內(nèi)切酶切割。靶序列區(qū)域被CRISPR-Cas9核酸酶識別切割，自身修復后，如果發(fā)生了突 變，則Smal酶切識別序列被破壞，將不能被限制性內(nèi)切酶Smal切割;如果沒有發(fā)生突變，將 可以被限制性內(nèi)切酶Smal切割。
[0112] (2)用限制性內(nèi)切酶BsaI酶切pBUN411載體，回收約12.4kb的載體骨架，命名為 BUN411。
[0113] (3)根據(jù)步驟（1)設計的靶位點序列，合成如下帶有粘性末端（下劃線部分）的引 物：
[0114] ZmlAPlF:5 '-ggcgGAACGCGCGGGCCCGGGTGC-3'；
[0115] ZmlAPIR:5 '-aaacGCACCCGGGCCCGCGCGTTC-3'。
[0116] (4)將ZmlAPlF和ZmlAPIR進行退火，形成有粘性末端的雙鏈DNA，將其和步驟(2)中 的膠回收產(chǎn)物BUN411連接，得到重組質(zhì)粒pBUN411 -ZmlAP 1。重組質(zhì)粒pBUN411 -Zml AP1的結 構描述為:將PBUN411質(zhì)粒的兩個限制性內(nèi)切酶Bsal的識別序列之間的片段(約l.lkb)替換 為DNA片段"5 ' -GAACGCGCGGGCCCGGGTGC-3 '"后所得的重組質(zhì)粒。
[0117] (5)將構建好的重組質(zhì)粒pBUN411-ZmIAPl通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法導入玉米品種 ΗΠΙ。以ΗΠΙ未成熟胚及愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，轉(zhuǎn)化后經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得完整再生植株。
[0118] 經(jīng)過轉(zhuǎn)化pBUN411 -Zml API獲得完整的轉(zhuǎn)基因植株后，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA， 用能夠擴增含有靶位點序列的特異引物對T3-F/T3-R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用Smal單酶切。
[0119] T3-F:5'-CGCCCCTGGTGTCGCAGTACA-3'（序列2的第484-504位）；
[0120] T3-R: 5 ' -CGCCGACAGGATCACCTCGTTC-3 '（序列2的第 1267-1288位的反向互補序 列)。
[0121] 其中，T3-F位于Smal酶切位點上游231bp，T3-R位于Smal酶切位點下游574bp。
[0122] 以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，擴增獲得的PCR產(chǎn)物用Sma I酶切后經(jīng)1.0 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測。如果PCR產(chǎn)物可以被Smal酶切，則說明該位點沒有發(fā)生變異，稱之為轉(zhuǎn) 基因陰性;如果PCR產(chǎn)物不能被Smal酶切，則說明該序列已經(jīng)發(fā)生變化，ZmlAPl基因被定點 編輯成功，稱之為轉(zhuǎn)基因陽性（圖7中B)。將無法被Smal切開的PCR產(chǎn)物測序，以其中一株為 例，發(fā)現(xiàn)其與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株在ZmlAPl基因的第二個外顯子上缺失7bp，導致氨基 酸移碼和翻譯的提前終止(圖7中C)。
[0123] 參照實施例2中的方法觀察檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株的雄性是否可育。實驗同時設置 了轉(zhuǎn)基因陰性的對照，向玉米品種ΗΠΙ導入了 PBUN411空載體的對照，以及未轉(zhuǎn)基因的玉米 品種ΗΠΙ野生型對照。每種實驗材料的供試植株數(shù)不少于80株。
[0124] 結果顯示:在表型上，轉(zhuǎn)基因陽性植株花藥干癟不外露，無可被1%I2-KI溶液染色 的花粉，表現(xiàn)為徹底的雄性不育；而轉(zhuǎn)基因陰性植株花藥飽滿且外掛，散出的花粉可以被 1 % Ι2-ΚΙ溶液染色，表現(xiàn)為雄性可育（圖7中D、E、F和G)。而空載對照和野生型對照的花藥表 型及1%I2-KI溶液染色結果均與轉(zhuǎn)基因陰性植株結果相似，無顯著差異。由此得出，ZmlAPl 基因被敲除會導致玉米雄性不育的表型。另外，轉(zhuǎn)基因陽性植株除了雄性不育外，其他表型 和性狀與未轉(zhuǎn)基因的對照玉米植株相比基本上沒有差異。
[0125] 綜合以上各實施例的研究結果，可見：通過圖位克隆、基因的互補實驗和敲除實 驗，本發(fā)明克隆的ZmlAPl基因是控制玉米雄性育性的基因，其突變可導致徹底的雄性不育， 且對其他性狀沒有明顯的負面影響，可以在玉米制種過程中得以利用。
【主權項】
1. 蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): (a) 由序列表中序列1所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且 與植物雄性育性相關的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子。3. 根據(jù)權利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子為編碼權利要求1所述 蛋白質(zhì)的基因，所述基因為如下1)_6)中任一的DNA分子： 1) 序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 序列表中序列3所示的DNA分子； 3) 序列表中序列3的第249-1997位所示的DNA分子； 4) 序列表中序列4所示的DNA分子； 5) 在嚴格條件下與1 )_4)中任一限定的DNA分子雜交且編碼與植物雄性育性相關的由 序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子； 6) 與1)_5)中任一限定的DNA序列具有90%以上同一性，且編碼與植物雄性育性相關的 由序列1衍生的蛋白質(zhì)的DNA分子。4. 含有權利要求2或3所述核酸分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生物。5. 根據(jù)權利要求4所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組表達載體或重組 克隆載體。6. 權利要求1所述蛋白質(zhì)或權利要求2或3所述核酸分子或權利要求4或5所述的重組載 體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組微生物在如下任一中的應用： (a) 植物育種和/或制種； (b) 調(diào)控植物雄性育性。7. 培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下(A)或(B): (A) 培育雄性可育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： (al)向雄性不育的受體植物中導入權利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達所述 編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物;所述受體植物的雄性不育性狀是由于所述受體植物表達有功能的 權利要求1所述蛋白質(zhì)的能力喪失或降低引起的； (a2)從步驟(al)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性可育的轉(zhuǎn)基因植物； (B) 培育雄性不育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： (bl)抑制雄性可育的受體植物中權利要求1所述蛋白質(zhì)的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物； (b2)從步驟(bl)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到雄性不育的轉(zhuǎn)基因植物。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟(al)中，所述編碼基因是通過權利要 求5中的所述重組表達載體導入所述受體植物的； 步驟（bl)中，是通過如下實現(xiàn)抑制所述受體植物中所述編碼基因的表達的：采用 CRISPR/Cas9核酸酶對所述受體植物中編碼權利要求1所述蛋白質(zhì)的基因組DNA序列進行特 異性剪切，使所述受體植物喪失或降低表達有功能的權利要求1所述蛋白質(zhì)的能力。9. 根據(jù)權利要求7或8所述的應用或方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子 葉植物。10. 根據(jù)權利要求7-9中任一所述的應用或方法，其特征在于:所述單子葉植物為禾本 科植物； 所述禾本科植物具體為玉米。
【文檔編號】C12N15/82GK105884874SQ201610321598
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】陳化榜, 趙麗, 張華
【申請人】中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所